一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，首先活化乳酸片球菌PA003菌種于液體MRS培養(yǎng)基中，利用生長培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使其活性及存活性最佳；然后利用冷凍離心機(jī)離心法收集菌體，洗滌后，將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護(hù)劑培養(yǎng)基中，通過逐步冷凍法將溶液冷凍，待其結(jié)冰后準(zhǔn)備進(jìn)行冷凍干燥；最后將結(jié)冰樣品放置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥；最后獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。用本發(fā)明制備的乳酸片球菌存活率高達(dá)81.96%，復(fù)性后具有乳酸菌屬的發(fā)酵特性的同時仍保持對單核增多癥李斯特氏菌的抑菌活性，適于開發(fā)后大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，在食品業(yè)和飼料業(yè)中作為生物防腐劑或是飼料添加劑使用具有很大的潛力。
【專利說明】一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種冷凍干燥制劑的制備方法，特別涉及一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自人類使用乳酸菌生產(chǎn)發(fā)酵食品以來至少已有4000多年的歷史，主要用于生產(chǎn)發(fā)酵乳制品、發(fā)酵蔬菜和發(fā)酵肉制品等。乳酸菌發(fā)酵食品風(fēng)味獨(dú)特，對人類和動物有益生作用，甚至有些菌種具有防腐作用，這些乳酸菌在世界范圍內(nèi)深受喜愛。目前，乳酸片球菌能賦予食品柔和的酸味及香氣，改進(jìn)食品的品質(zhì)和營養(yǎng)，還具有抗菌、降低膽固醇、維持微生態(tài)環(huán)境、抗腫瘤、抗變異和增強(qiáng)免疫力等重要生物學(xué)功能。其作為發(fā)酵菌種已經(jīng)大量的在多國的食品中使用，是備受人們喜愛和接受的有益菌群。此外，其顯著的抑菌效果，使得乳酸片球菌潛藏著巨大的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]國內(nèi)外目前對于乳酸片球菌抑菌作用的研究大多都致力于片球菌素的研究上，主要是通過各種方法獲得高效高產(chǎn)量的片球菌素，如:優(yōu)化培養(yǎng)及各種條件，基因工程技術(shù)等方法來獲得高效高產(chǎn)量的細(xì)菌素。但作為人體有益菌的乳酸菌屬乳酸片球菌，其活菌的使用及活菌抑菌試驗(yàn)的研究報道卻在國內(nèi)外鮮見。本發(fā)明所用乳酸片球菌菌株(pediococcusacidilatici) PA003是天津大學(xué)化工學(xué)院周志江教授研究室的特有菌種，最初從一種發(fā)酵白菜(東北酸白菜)中分離純化得到的(已在專利CN102115720B中公開，可從天津大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)系食品生物技術(shù)研究室獲取)。此乳酸片球菌PA003能發(fā)酵糖類生成片球菌素——是一種多肽的天然生物防腐劑，屬于熱穩(wěn)定多肽細(xì)菌素，可以抑制很廣范圍內(nèi)的革蘭氏陽性菌，具有廣譜抗菌性。而該片球菌是乳酸細(xì)菌的一個種，既能發(fā)酵一些食品，又具備防腐功能，人們還可以直接食用，其作為天然物質(zhì)進(jìn)行使用時比目前備受爭議的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)和人工合成物質(zhì)或化合物更能得到大眾的認(rèn)可和接受。
[0004]目前國內(nèi)外尚未見乳酸片球菌冷凍干燥制劑研究的報道，因此，為了保證制作出的冷凍干燥制劑能穩(wěn)定的長期貯藏，且復(fù)性后具有較高的存活率和較穩(wěn)定的抑菌活性，以及在操作，貯藏，銷售，使用中更加方便可行，就必須針對制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的各種影響因素進(jìn)行認(rèn)真研究。而從技術(shù)和商業(yè)相結(jié)合的角度出發(fā)，菌種的生長及其進(jìn)行冷凍干燥、復(fù)性、冷凍干燥后長期貯藏過程中受到的影響都是該冷凍干燥制劑在復(fù)性后具有高活性和高生存能力的重要研究核心。而上述研究過程中的主要的影響因素又分為:固有的內(nèi)在因素，包括:細(xì)胞的大小、遺傳基因、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的組成；生長因素，包括:可兼容溶質(zhì)積累物、胞外多糖的產(chǎn)生、細(xì)胞膜的變化；半致死處理；干燥培養(yǎng)基，包括:脫脂牛奶粉、滲透性化合物、半滲透性化合`物、不滲透的化合物；貯藏和復(fù)性，貯藏包括:氧氣、水分、溫度，復(fù)性包括:復(fù)性液的PH值、溫度、容量、營養(yǎng)物質(zhì)成分和含量、能量物質(zhì)成分和含量。因此，針對不同影響因素對于菌屬中不同的種有不同的影響結(jié)果，不同種之間的最適條件也不相同等可能出現(xiàn)的問題，再加上乳酸片球菌PA003菌株在制作為冷凍干燥制劑后，后期使用和長期儲存過程中必須具備抑菌活性，那么必須對冷凍干燥法制備冷凍干燥制劑及復(fù)性過程中影響乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率和抑菌活性的三大影響因素(即:生長培養(yǎng)基，冷凍干燥保護(hù)劑，復(fù)性條件)進(jìn)行逐一研究。研制出制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的最佳方法。最終能讓乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑有效地，合理地，方便地作為天然生物防腐劑、發(fā)酵劑、飼料添加劑運(yùn)用到各種食品和相關(guān)產(chǎn)業(yè)中。從而顯現(xiàn)出乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑天然，無害，無污染，安全的發(fā)酵功能和生物防腐功效。以上的所有研究發(fā)明都是具很高的研究價值和意義的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，填補(bǔ)國內(nèi)外乳酸片球菌冷凍干燥制劑的空白，解決乳酸片球菌菌株應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)困難的問題。
[0006]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，包括如下步驟:
[0008](I)活化乳酸片球菌PA003菌種于液體MRS培養(yǎng)基中，利用生長培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使其活性及存活性最佳；
[0009](2)利用冷凍離心機(jī)離心法收集菌體，洗滌后，將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護(hù)劑培養(yǎng)基中，通過逐步冷凍法將溶液冷凍，待其結(jié)冰后準(zhǔn)備進(jìn)行冷凍干燥；
[0010](3)將結(jié)冰樣品放置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥；最后獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。
[0011]所述步驟(1)中生長培養(yǎng)基為10%(w/v)脫脂奶作為溶液基質(zhì)的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養(yǎng)基。所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養(yǎng)基配方是指將葡萄糖0.66%，果糖
0.66%，蔗糖0.66%代替MRS培養(yǎng)基`配方的葡萄糖2%。
[0012]所述步驟(1)中接種量為1%，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時間14h。
[0013]所述步驟(2)冷凍干燥保護(hù)劑培養(yǎng)基為5%蔗糖的10%(w/v)脫脂奶溶液。
[0014]所述步驟(2)冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000Orpm,在4°C下離心lOmin。
[0015]所述步驟(3)冷凍干燥溫度-53°C，冷凍干燥時間24h。
[0016]一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的使用方法，使用時利用生理鹽水作為復(fù)性液在22°C下進(jìn)行復(fù)性30min。
[0017]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明利用改良后的MRS培養(yǎng)基，該乳酸片球菌的生長能達(dá)到最佳。用本發(fā)明制備的乳酸片球菌存活率高達(dá)81.96%，復(fù)性后具有乳酸菌屬的發(fā)酵特性的同時仍保持對單核增多癥李斯特氏菌的抑菌活性，適于開發(fā)后大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，在食品業(yè)和飼料業(yè)中作為生物防腐劑或是飼料添加劑使用具有很大的潛力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1不同糖類(基質(zhì)為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0019]圖2不同糖類(基質(zhì)為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0020]圖3不同大分子聚合物(基質(zhì)為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0021]圖4不同大分子聚合物(基質(zhì)為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0022]圖5不同多元醇(基質(zhì)為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0023]圖6不同多元醇(基質(zhì)為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0024]圖7其他化合物(基質(zhì)為蒸餾水)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；
[0025]圖8其他化合物(基質(zhì)為10% (w/v)脫脂奶)在各自不同濃度下作為冷凍干燥保護(hù)劑時乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑的存活率；[0026]圖9a復(fù)性液對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0027]圖9b復(fù)性液對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0028]圖10復(fù)性溫度對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0029]圖11復(fù)性時間對乳酸片球菌PA003冷凍干燥制劑存活率的影響；
[0030]圖12乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑抑制單核增多癥李斯特氏菌CVCC1595的抑菌活性。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
[0032]實(shí)施例1
[0033]制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑
[0034](I)將貯藏于4°C下MRS斜面上的乳酸片球菌PA003菌種按1%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)14h，將液體MRS菌懸液再按1%的接種量接種于液體生長培養(yǎng)基中，放置于37°C下培養(yǎng)14h。
[0035](2)利用冷凍離心機(jī)離心(10000rpm,4°C, IOmin),棄上清，收集固體沉淀(菌體)；用同體積已滅菌的Ringer’ s solution洗漆兩次，同樣棄上清,收集固體沉淀(菌體)；此后將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護(hù)劑培養(yǎng)基中，于25°C靜置lh，之后于4°C下再靜置lh，最后將其放置于-20°C靜置，待其結(jié)冰后準(zhǔn)備進(jìn)行冷凍干燥。
[0036](3)將結(jié)冰樣品放置于冷凍干燥機(jī)中(_53°C )進(jìn)行冷凍干燥24h ;獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。
[0037]實(shí)施例2
[0038]乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的存活率
[0039]( I)冷凍干燥前乳酸片球菌菌株的活菌計數(shù):在上述25°C靜置Ih后，從冷凍干燥保護(hù)劑培養(yǎng)基中各取出ImL該保護(hù)劑的菌懸液加入到9mL已滅菌的生理鹽水中，將其經(jīng)過適當(dāng)稀釋后，即達(dá)到10_6、10_7時，將該稀釋梯度下的菌懸液各取100 u L加到MRS固體培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行菌落涂布(相鄰兩個梯度各涂布3塊平皿)，涂布好的平皿放置于37°C下培養(yǎng)48h，之后進(jìn)行平板菌落計數(shù)。存活的菌落數(shù)用cfu/mL來表示。
[0040](2)冷凍干燥后，立刻用同體積的復(fù)性液對冷凍干燥制劑進(jìn)行復(fù)性，使其在復(fù)性條件下形成復(fù)性菌懸液。從該復(fù)性菌懸液中各取出ImL菌懸液加入到9mL已滅菌的生理鹽水中，將其經(jīng)過適當(dāng)稀釋后達(dá)到10_6、10_7，將該稀釋梯度下的菌懸液取IOOyL加到MRS固體培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行菌落涂布(相鄰兩個梯度各涂布3塊平皿)，涂布好的平皿放置于37°C下，培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計數(shù)。存活的菌落數(shù)用cfu/mL來表示。
[0041](3)存活率是通過冷凍干燥前(No)，后(Nf)對應(yīng)的MRS固體培養(yǎng)皿上菌落數(shù)的比值來表示的:存活率(V) %= (Nf/No) X 100兩次平行試驗(yàn)的數(shù)值利用Software SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件來進(jìn)行處理，方差分析用一般線性模型(GLM)方差分析；多重比較利用新復(fù)極差法進(jìn)行分析。
[0042]實(shí)施例3
[0043]乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的抑菌活性
[0044]把冷凍干燥后的乳酸片球菌PA003從復(fù)性液中接種到MRS固體培養(yǎng)皿中，放置于37°C下培養(yǎng)24h，待其長出肉眼可見菌落；在50°C左右的5mL半固體TSYEB中接入I y L單核增多癥李斯特氏菌CVCC1595，將其混勻后傾倒入上述已長出肉眼可見菌落的MRS固體培養(yǎng)皿中，使該層半固體培養(yǎng)基平鋪于固體MRS培養(yǎng)基之上，之后將該平板放置于37°C下培養(yǎng)12h，觀察是否在乳酸片球菌菌落周圍出現(xiàn)抑菌圈。(圖12)
[0045]由圖12看出，制作出的冷凍干燥制劑進(jìn)行復(fù)性后，對存活的乳酸片球菌PA003進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌落周圍都可以看到清晰的抑菌圈，表明該冷凍干燥制劑仍具有穩(wěn)定的抑菌活性。 [0046]實(shí)施例4
[0047]優(yōu)化制備乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑制備過程中的各影響因素
[0048](1)在制備冷凍干燥制劑過程中通過利用兩因素全面實(shí)驗(yàn)，對乳酸片球菌菌株的生長培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇出最佳制備冷凍干燥菌制劑的生長培養(yǎng)基，即10%(w/v)脫脂奶作為溶液基質(zhì)的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養(yǎng)基。(表1、2、3、4)
[0049]表1不同生長培養(yǎng)基
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)活化乳酸片球菌PA003菌種于液體MRS培養(yǎng)基中，利用生長培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使其活性及存活性最佳； (2)利用冷凍離心機(jī)離心法收集菌體，洗滌后，將菌體懸浮于已滅菌的冷凍干燥保護(hù)劑培養(yǎng)基中，通過逐步冷凍法將溶液冷凍，待其結(jié)冰后準(zhǔn)備進(jìn)行冷凍干燥； (3)將結(jié)冰樣品放置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥；最后獲得的冷凍干燥制劑密封避光放置于室溫下貯藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中生長培養(yǎng)基為10%(w/v)脫脂奶作為溶液基質(zhì)的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培養(yǎng)基配方是指將葡萄糖0.66%，果糖0.66%，蔗糖0.66%代替MRS培養(yǎng)基配方的葡萄糖2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中接種量為1%，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時間14h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)冷凍干燥保護(hù)劑培養(yǎng)基為5%蔗糖的10%(w/v)脫脂奶溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000Orpm,在4°C下離心lOmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述乳酸片球菌菌`株冷凍干燥制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)冷凍干燥溫度-53°C，冷凍干燥時間24h。
8.一種乳酸片球菌菌株冷凍干燥制劑的使用方法，其特征在于，使用時利用生理鹽水作為復(fù)性液在22°C下進(jìn)行復(fù)性30min。
【文檔編號】C12N1/04GK103627637SQ201310631973
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】韓燁, 洪小迪, 譚茜倩, 周志江 申請人:天津大學(xué)