可可花癭病菌的實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了可可花癭病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法，包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，正向引物的核苷酸序列為GAGCGACGTTGGCACAATG，反向引物的核苷酸序列為GGTTCGGAACACGTGACGAT，探針的核苷酸序列為CCTGGCCCCTGCAC，檢測(cè)方法是以待檢測(cè)樣品DNA為模板，用檢測(cè)可可花癭病菌的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)，是一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)可可花癭病菌的試劑和方法。
【專利說(shuō)明】可可花癭病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及可可花癭病菌的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及可可花癭病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】[0002]可可花瘦病菌(Albonectriarigidiuscula (Berk.&Broome) Rossman&Samuels)屬菌物界(Fungi)、子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、叢赤殼科(Nectriaceae)、白殼屬(Albonectria)。其無(wú)性階段為多隔鐮刀菌(Fusarium decemcellulare Brickl908)。已被列入我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄，是一種檢疫性植物病原真菌。目前，分布于澳大利亞、俄羅斯、白俄羅斯、烏克蘭喀麥隆、中非、剛果、加納、科特迪瓦、馬達(dá)加斯加、尼日利亞、塞拉利昂、古巴、美國(guó)、哥斯達(dá)黎加、格林納達(dá)、危地馬拉、洪都拉斯、牙買加、尼加拉瓜、巴拿馬、特立尼達(dá)、多巴哥、阿根廷、哥倫比亞、秘魯、法屬圭亞那、蘇里南、委內(nèi)瑞拉、日本、斯里蘭卡、印度、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、菲律賓、以色列和中國(guó)。該病菌寄主范圍廣，可為害除可可外，病菌還可為害芒果(Mangifera indica)、三葉膠屬(Seringa)、咖啡(Coffea arabica)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zea mays)、豆科(Leguminosae sp.)、槽蓮樹(Durio zibethinus)、印度率(Ziziphus zizyphus)、蓮霧(Syzygium.samarangense)、魚尋梨(Persea americana)、橡膠(Hevea brasiliensis)、番蒸枝(Annonaceae sp.)、漆樹科(Anacardiaceae sp.)、夾竹桃科(Apocynaceae sp.)、木棉科(Bombacaceae sp.)、大戟科(Euphorbiaceae sp.)、錦奏科(Malvaceae sp.)、桑科(Moraceae sp.)等。1993年在日本有該菌危害釋迦(Atemoya),造成頂枯病的的報(bào)道。該病菌能夠造成多種植物頂枯病的發(fā)生，在可可上產(chǎn)生嚴(yán)重癌腫病害，在加納侵染率可達(dá)80%，而在尼日利亞則高達(dá)95%，嚴(yán)重時(shí)能夠造成可可絕收。迄今為止，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)可可花癭病菌的方法局限于形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)素質(zhì)要求較高，難以滿足快速、準(zhǔn)確、靈敏鑒定的檢測(cè)要求。
[0003]利用TaqMan-MGB探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)是在常規(guī)RT-PCR反應(yīng)體系中添加了 I條TaqMan-MGB探針，探針的5’端含有報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，發(fā)出熒光信號(hào)，從而使熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。目前，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已廣泛用于病毒檢測(cè)、細(xì)菌檢測(cè)、植原體檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)、線蟲檢測(cè)以及真菌檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)可可花癭病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是提供一種檢測(cè)可可花癭病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑，包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為79bp，其引物和探針序列分別為:
[0006]正向引物(NR-EFF):5，-GAG CGA CGT TGG CAC AAT G-3，；
[0007]反向引物(NR-EFR):5’-GGT TCG GAA CAC GTG ACG AT-3’ ；
[0008]探針(NR-EFMGB):5’ -CCT GGC CCC TGC AC-3’，該探針的 5’ 端含有 FAM 報(bào)告熒光染料，3’端為含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。
[0009]擴(kuò)增目標(biāo)片段的核苷酸序列為:GAGCGACGTTGGCACMTGC CCTGGCCCCT GCACACAMACATCAAACCT TGGCGCGCAT CGTCACGTGT TCCGAACC。
[0010]本發(fā)明所提供的檢測(cè)可可花癭病菌的方法，是以待檢測(cè)樣品DNA為模板，用上述檢測(cè)可可花癭病菌的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)。所述樣品可為帶病植物樣品、真菌純培養(yǎng)樣品等。樣品經(jīng)DNA提取試劑盒(購(gòu)自Tiangen公司)提取樣品DNA，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)是以提取樣品DNA為模板，25 μ L反應(yīng)體系中引物NR-EFF和NR-EFR的終濃度都為1.0 μ Μ、探針終濃度為0.7 μ Μ、
12、^iL 2χ TaqMan3? Universal PCR Master Mix (購(gòu)自 ABI 公司);所述實(shí)時(shí)突光 PCR 的反應(yīng)條件為:50°C 2min,95°C IOmin ；95°C 15s，60。。lmin，共40個(gè)循環(huán)。如從擴(kuò)增產(chǎn)物中可檢測(cè)到熒光信號(hào)，說(shuō)明所述檢測(cè)樣品含有可可花癭病菌，而且可以根據(jù)Ct (循環(huán)閾值)的大小確定樣品中的起始模板的量。
[0011]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有可可花癭病菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、繁瑣、專業(yè)人員素養(yǎng)要求高的缺點(diǎn)，提供了一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)可可花癭病菌方法。本發(fā)明的方法及其專用引物和探針對(duì)可可花癭病菌具有很強(qiáng)的?；?，并通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，不僅能提高可可花癭病菌檢測(cè)的效果，還能對(duì)受檢樣品進(jìn)行定量分析。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):1、快速簡(jiǎn)單:只需少量樣品DNA，用熒光PCR儀僅需I小時(shí)就可完成PCR步驟，即可得到檢測(cè)結(jié)果，且避免了普通分子檢測(cè)技術(shù)中的探針制備、電泳等處理過(guò)程；2、特異性強(qiáng):采用一對(duì)可可花癭病菌的特有引物進(jìn)行目標(biāo)基因片段的擴(kuò)增及一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針進(jìn)行檢測(cè)，提高了特異性，有效地避免假陽(yáng)性和假陰性；3、靈敏度高:由熒光PCR儀自動(dòng)收集熒光信號(hào)，避免普通PCR反應(yīng)后電泳分析中人為因 素干擾，進(jìn)一步提高靈敏度，在25 μ L反應(yīng)體系中，DNA檢測(cè)低限是10pg。4、交叉污染低:整個(gè)檢測(cè)過(guò)程完全閉管，不需PCR后處理，消除了 PCR產(chǎn)物的污染。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0014]實(shí)施例1、檢測(cè)可可花癭病菌的專用引物和探針的設(shè)計(jì)
[0015]從GenBank調(diào)出可可花癭病菌及其近似種的基因序列，利用DNAMAN6.0.40軟件進(jìn)行比對(duì)分析，找出可可花癭病菌的保守基因序列，根據(jù)引物和探針設(shè)計(jì)的一般原則，用軟件Primer Express3.0設(shè)計(jì)引物和TaqMan-MGB探針,再將設(shè)計(jì)的引物和探針在NCBI上比對(duì)，通過(guò)篩選最終確定一對(duì)引物和一條探針，其序列為:引物NR-EFF:GAG CGA CGT TGG CACMT G ;引物NR-EFR:GGT TCG GAA CAC GTG ACG AT ;探針NR-EFMGB:CCT GGC CCC TGC AC,，該探針的5’端含有FAM報(bào)告熒光染料，3’端為含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。
[0016]實(shí)施例2、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)可可花癭病菌的特異性試驗(yàn)[0017]具體過(guò)程包括以下步驟:[0018]、樣品來(lái)源
[0019]可可花癭病菌純培養(yǎng)樣品3份(F13657-l、F13657-2、F13657-3)、尖孢鐮孢菌純培養(yǎng)樣品3份(F1、F5、F7)、茄病鐮孢菌純培養(yǎng)樣品2份(F2、F8)、三線鐮孢菌純培養(yǎng)樣品2份(F4、F22)、磚紅鐮孢菌純培養(yǎng)樣品2份(F13、F27)、木賊鐮孢菌純培養(yǎng)樣品2份(F9、F31)、大麗輪枝菌純培養(yǎng)樣品2份(VD1、VD2)、黑白輪枝菌純培養(yǎng)樣品2份(AV02、AV27)。上述各菌種的來(lái)源是本發(fā)明人采集或收集。
[0020]二、樣品DNA的提取
[0021]對(duì)步驟一中的樣品經(jīng)DNA提取試劑盒分別提取DNA，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。
[0022]三、特異性檢測(cè)
[0023]以步驟一和步驟二獲得的DNA 為模板，即:F13657-1、F13657-2、F13657-3、F1、F5、F7、F2、F8、F4、F22、F13、F27、F9、F31、VD1、VD2、AV02、AV27，水為空白對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)，即在 25 μ L 反應(yīng)體系中加入 12.5 μ L 2xTaqMan? Universal PCR Master Mix(購(gòu)自ABI公司)，濃度20 μ mo I/L引物NR-EFF加至終濃度LOymol/L，濃度20 μ mol/L引物NR-EFR加至終濃度1.0 μ mol/L,濃度20 μ mol/L探針NR-EFMGB加至終濃度0.7 μ mol/L，滅菌雙蒸水補(bǔ)至 25 μ L。反應(yīng)條件為:50°C 2min,95°C IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，共 40個(gè)循環(huán)。結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的引物和探針有較強(qiáng)的特異性，10種真菌樣品中僅能檢出可可花癭病菌 F13657-1、F13657-2、F13657-3，不能檢出 F1、F5、F7、F2、F8、F4、F22、F13、F27、F9、F31、VD1、VD2、AV02、AV27 和水。
[0024]實(shí)施例3、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化
[0025]以實(shí)施例2中步驟二獲得的F13657-1的DNA為模板，分別對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系中的引物濃度和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，具體步驟如下:
[0026]一、引物濃度優(yōu)化
[0027]在實(shí)施例2中步驟三的體系中其它成分濃度不變，將引物終濃度從0.1 μΜ至
1.0μ M以0.1 μ M遞增。反應(yīng)條件按實(shí)施例2中步驟三的條件進(jìn)行。結(jié)果表明，當(dāng)引物終濃度為1.0y M時(shí)，Λ Rn值達(dá)最大、Ct值最小。經(jīng)過(guò)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最后確定1.0y M為引物終濃度。
[0028]二、探針濃度優(yōu)化
[0029]在實(shí)施例2中步驟三的體系中其它成分濃度不變，固定優(yōu)化后的引物濃度，將探針終濃度從0.ΙμΜ至Ι.ΟμΜ以0.ΙμΜ遞增。反應(yīng)條件按實(shí)施例2中步驟三的條件進(jìn)行。結(jié)果表明，當(dāng)探針終濃度為0.7 μ M時(shí)，Λ Rn值最大。經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最好確定0.7 μ M為探針終濃度。
[0030]實(shí)施例4、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)可可花癭病菌的靈敏度試驗(yàn)
[0031]以實(shí)施例2中步驟二獲得的F13657-1的DNA為模板，用核酸蛋白分析儀測(cè)OD26tl及OD28tl,計(jì)算DNA的濃度，并將其稀釋為25 μ L反應(yīng)體系中，DNA分別為100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、0.lpg、0.01pg,以實(shí)施例3中步驟三獲得的最優(yōu)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件按實(shí)施例3中步驟三的條件進(jìn)行。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，其檢測(cè)低限是 IOpg0
[0032]實(shí)施例5、接種樣品檢測(cè)[0033]挑取幼嫩健康的羅漢松葉片幼芽部位，將在PDA平板上培養(yǎng)IOd的菌落用直徑4mm打孔器在菌落邊緣打出菌餅后，將菌餅接種在幼芽上，菌絲面貼向幼芽，共接種8個(gè)幼芽。無(wú)菌菌餅接種三個(gè)幼芽作為對(duì)照，25°C溫室條件下進(jìn)行隔離培養(yǎng)。接種30d后按實(shí)施例2步驟二對(duì)發(fā)病葉片 提取DNA，以實(shí)施例3中步驟三獲得的最優(yōu)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件按實(shí)施例2中步驟三的條件進(jìn)行。結(jié)果表明，接種的8份樣品均檢出可可花癭病菌。
【權(quán)利要求】
1.可可花癭病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑，包含一對(duì)特異性引物和一條特異性熒光探針，擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為79bp，其特征在于引物和探針序列為: 正向引物:GAG CGA CGT TGG CAC AAT G ； 反向引物:GGT TCG GAA CAC GTG ACG AT ； 探針:5’-CCT GGC CCC TGC AC-3’，該探針的5’端含有FAM報(bào)告熒光染料，3’端為含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。
2.利用權(quán)利要求1所述的可可花癭病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)可可花癭病菌的方法，其特征在于步驟如下: 1)樣品DNA的提取:菌絲用DNA提取試劑盒提取DNA，得DNA為模板，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書； 2)實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè):25yL 反應(yīng)體系包括 12.5yL 2><TaqMan? Universal PCRMaster Mix,終濃度都為1.ΟμΜ的正向引物、反向引物，終濃度為0.7 μ M的探針，實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為:50°C 2min,95°C IOmin ；95°C 15s,60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)，若產(chǎn)生熒光信號(hào)，則為可可花癭病菌。`
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667467SQ201310631919
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】段維軍, 郭立新, 段麗君, 張慧麗, 陳先鋒 申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院