海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，涉及一種海洋微型浮游植物。提供一種海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，構(gòu)建的真核表達載體能夠運用于對海洋球石藻體內(nèi)代謝途徑研究、作為構(gòu)建高產(chǎn)神經(jīng)酰胺基因工程藻株的基礎(chǔ)載體。通過構(gòu)建海洋球石藻真核表達載體，作為微藻生物技術(shù)的工具，用于研究海洋球石藻機體代謝途徑等問題，并為構(gòu)建高產(chǎn)神經(jīng)酰胺基因工程藻株提高基礎(chǔ)載體?？捎糜诤Ｑ笄蚴搴铣纱x途徑的調(diào)控過程研究，即通過利用微藻生物技術(shù)阻斷或修飾其代謝途徑，構(gòu)建高產(chǎn)神經(jīng)酰胺海洋球石藻基因工程藻株，以達到神經(jīng)酰胺的大量積累，為尋找一條新的生產(chǎn)神經(jīng)酰胺的天然途徑奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種海洋微型浮游植物，尤其是涉及一種海洋球石藻(Emilianiahuxleyi)真核表達載體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，微藻基因工程研究取得了許多重要進展，在微藻產(chǎn)品高值化上具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，利用基因工程手段將外源基因轉(zhuǎn)入到微藻細胞中已經(jīng)有所報道，通過對藻類基因工程的研究，可以從改造的藻體中篩選抗性強且生長快的優(yōu)良藻種，并把藻類作為新型的生物反應(yīng)器生產(chǎn)某些具有較大經(jīng)濟價值的生物活性物質(zhì)。在微藻中表達重要的蛋白、多肽甚至次生產(chǎn)物合成酶系，通過分子生物學(xué)技術(shù)阻斷或修飾代謝途徑，以創(chuàng)造具有商業(yè)價值的工程藻株和開發(fā)高價值微藻產(chǎn)品，推動微藻生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
[0003]目前用于轉(zhuǎn)化藻類的常用方法有:
[0004]①玻璃珠法，在待轉(zhuǎn)化的藻細胞樣品中加入DNA、玻璃珠和聚乙二醇，短暫渦旋震蕩，使細胞產(chǎn)生瞬時空洞，從而使得DNA進入細胞內(nèi)。該方法的優(yōu)點是不需要昂貴的專業(yè)設(shè)備、操作簡單、重復(fù)性好，缺點是需要使用沒有細胞壁的藻株或者制備原生質(zhì)體。由于微藻細胞壁結(jié)構(gòu)組成的復(fù)雜性和多樣性，大部分藻株很難獲得可存活的原生質(zhì)體，因此玻璃珠法并不適合用于所有微藻的轉(zhuǎn)化。
[0005]②農(nóng)桿菌侵染法，農(nóng)桿菌是一種土壤寄生菌，具有感染植物細胞的能力。研究表明，該方法也可以用于真核微藻的轉(zhuǎn)化，具有可以轉(zhuǎn)化有完整細胞壁的微藻細胞T-DNA準確插入宿主基因組中、獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的效率較高等優(yōu)點。
[0006]③基因槍法，將外`源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，然后在高壓的作用下，微粒被高速射入受體細胞，微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到染色體上，得到表達，從而實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化。該方法具有可以同時穿透細胞質(zhì)膜和細胞器膜，幾乎可以用于轉(zhuǎn)化所有的微藻等優(yōu)點，但是存在設(shè)備要求高、價格昂貴等缺點。
[0007]④電擊法，在適當?shù)耐饧与妶鰪姸群兔}沖時間作用下，細胞膜產(chǎn)生瞬間的可逆性小孔，使附著在質(zhì)膜上的DNA分子進入細胞內(nèi)，移去外加電壓后，膜孔在一定時間內(nèi)可以自動修復(fù)，不影響或很少影響細胞質(zhì)的生命活動，從而達到轉(zhuǎn)化的效果。該方法的優(yōu)點有強度適當?shù)碾娒}沖對DNA和受體細胞損害較小、操作容易控制、流程簡單、沒有細胞的種屬限制、轉(zhuǎn)化效率較高等。其中比較常用是基因槍法和電轉(zhuǎn)化法。通過現(xiàn)代生物技術(shù)(如基因工程、發(fā)酵工程及酶工程等)強化活性物質(zhì)代謝途徑，提高其產(chǎn)量已成為海洋生物資源領(lǐng)域新的研究熱點。
[0008]神經(jīng)酰胺(Ceramide)是一種新型的生物活性物質(zhì)，對細胞分化、增殖、免疫、凋亡、衰老等生命活動具有重要調(diào)節(jié)作用；其特有的生理功效使其成為一種附加值高和市場潛力大的活性成分，在醫(yī)藥、食品、化工特別是高檔護膚品以及治療某些皮膚病的藥物開發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景。神經(jīng)酰胺在生物體中以信號傳導(dǎo)分子的形式存在，通常含量極低，一般低于細胞總脂類的1%，目前制備神經(jīng)酰胺的原料主要為玉米、小麥、魔芋、米糠，但生產(chǎn)成本高，價格昂貴，產(chǎn)量不高。天然神經(jīng)酰胺產(chǎn)量較低是制約神經(jīng)酰胺功能性產(chǎn)品開發(fā)的瓶頸，迫切需要找到一種安全經(jīng)濟的來源和提高神經(jīng)酰胺產(chǎn)量的途徑。
[0009]海洋球石藻是一類單細胞的海洋微型浮游植物，在分類學(xué)上隸屬于定鞭藻門(Haptophyta=Prymnesiophyta),定鞭藻綱(Prym nesiophyceae),廣泛分布于世界范圍的近海和大洋水域中。自然海域中，病毒感染海洋浮游植物是一種普遍現(xiàn)象；研究發(fā)現(xiàn)，球石藻病毒感染宿主后導(dǎo)致宿主細胞的裂解，并伴隨神經(jīng)酰胺的大量合成，因此該藻及其病毒有望開發(fā)成為一種新的生產(chǎn)神經(jīng)酰胺的天然途徑。盡管如此，病毒感染通過什么機制(或代謝途徑)促使細胞合成大量的神經(jīng)酰胺；病毒感染伴隨著神經(jīng)酰胺的合成，神經(jīng)酰胺是一類中間產(chǎn)物，導(dǎo)致這種天然的合成途徑不能無限制地積累，因此通過構(gòu)建基因工程藻株，人為調(diào)控神經(jīng)酰胺合成代謝途徑將有望解決這一難題 。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，本發(fā)明構(gòu)建的真核表達載體能夠運用于對海洋球石藻體內(nèi)代謝途徑(特別是神經(jīng)酰胺的合成途徑)研究、作為構(gòu)建高產(chǎn)神經(jīng)酰胺基因工程藻株的基礎(chǔ)載體。
[0011]本發(fā)明包括以下步驟:
[0012]I)海洋球石藻抗生素抗性分析及選擇標記基因的篩選；
[0013]2)基礎(chǔ)載體、啟動子基因及報告基因的選擇；
[0014]3)根據(jù)步驟I)和2)確定的標記基因、啟動子基因及報告基因的序列設(shè)計引物；
[0015]4)從含有pGFP質(zhì)粒的大腸桿菌ToplO-pGFP中提取質(zhì)粒,作為下一步的模板；
[0016]5) PCR擴增報告基因gfp ；
[0017]6)PCR電泳回收產(chǎn)物，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采用Pst I和Sal I進行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進行測序鑒定；
[0018]7)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞,篩選得到重組質(zhì)粒；
[0019]8)從海洋球石藻細胞中提取DNA;
[0020]9) PCR擴增海洋球石藻fcp啟動子基因；
[0021]10) PCR電泳回收產(chǎn)物，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采用EcoR I和Sac I進行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進行測序鑒定；
[0022]11)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，分別連接步驟g)構(gòu)建的重組質(zhì)粒和質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，篩選得到兩種重組質(zhì)粒；
[0023]12)從含有pSELECT質(zhì)粒的大腸桿菌ToplO-pSELECT中提取質(zhì)粒，作為下一步的模板；
[0024]13) PCR擴增標記基因neo ；
[0025]14) PCR電泳回收產(chǎn)物，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采用Xba I和BamH I進行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進行測序鑒定；
[0026]15)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接步驟j)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選得到重組質(zhì)粒；[0027]16)將海洋球石藻細胞進行處理，去除細胞表面球石粒(碳酸鈣)；
[0028]17)采用電轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建的真核表達載體共轉(zhuǎn)化海洋球石藻細胞，并在熒光顯微鏡下觀察確定轉(zhuǎn)化的細胞。
[0029]在步驟I)中，所述海洋球石藻抗生素可選自氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、G418、鏈霉素、新生霉素、嘌呤霉素等中的一種(均購于鷺隆生物科技有限公司)。
[0030]在步驟2)中，所述基礎(chǔ)載體可采用PUC18 (購于GE Healthcare廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司)。
[0031]在步驟3)中，所述引物可采用 SEQIDN0.1、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDN0.5和SEQIDN0.6 ;其核苷酸序列分別為:
[0032]SEQIDN0.1:GFP-F:5, -GCGTCGACATGAGTAAAGGAGAAGAAC ~3'， [0033]其中，劃線部分為SalI酶切位點；
[0034]SEQIDN0.2:GFP-R:5' -GCTGCAGCTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3'，
[0035]其中，劃線部分為PstI酶切位點；
[0036]SEQIDNOJ=FCP-Fj' -ACACAGAATTCTGTGTGGCTTGAG-3'，
[0037]其中，劃線部分為EcoRI酶切位點；
[0038]SEQIDN0.4:FCP-R:5' -TTAAGAGCTCGGTGAGGAAGGAG-3'，
[0039]其中，劃線部分為Sac I酶切位點；
[0040]SEQIDN0.5:6418^:5' -TATAATAGGATCCACTATAGGAGG-3'，
[0041 ] 其中，劃線部分為BamH I酶切位點；
[0042]SEQIDN0.6:G418-R:5' -AGACAGCGAGCTTCTAGATTTAG-3'，
[0043]其中，劃線部分為Xba I酶切位點。
[0044]在步驟4)中，所述含有pGFP質(zhì)粒的大腸桿菌ToplO-pGFP購于泰京生物技術(shù)有限公司。
[0045]在步驟5)中，所述PCR擴增的反應(yīng)條件可為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、52°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin的擴增，保存于4°C。
[0046]在步驟6)中，所述質(zhì)?？刹捎胮MD19_T質(zhì)粒，pMD19_T質(zhì)粒購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；所述雙酶切采用Pst I和Sal I。
[0047]在步驟7)中，所述雙酶切采用的酶為Pst I和Sal I。
[0048]在步驟8)中，所述海洋球石藻細胞可從美國國家海洋藻種保藏中心(CultureCenter of Marine Phytoplankton，CCMP)購買，https://ncma.bigelow.0rg/。
[0049]在步驟9 )中，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、56°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin的擴增，保存于4°C。
[0050]在步驟10)中，所述質(zhì)?？刹捎胮MD19-T質(zhì)粒，pMD19_T質(zhì)粒購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；所述雙酶切采用EcoRI和Sac I。
[0051 ] 在步驟11)中，所述雙酶切采用EcoRI和Sac I。
[0052]在步驟12)中，所述含有pSELECT質(zhì)粒的大腸桿菌ToplO-pSELECT購于泰京生物技術(shù)有限公司。
[0053]在步驟13)中，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、51。。復(fù)性30s、72。。延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin的擴增，保存于4°C。[0054]在步驟14)中，所述質(zhì)粒采用pMD19-T質(zhì)粒，pMD19_T質(zhì)粒購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；所述雙酶切采用Xba I和BamH I。
[0055]在步驟15)中，所述雙酶切采用Xba I和BamH I。
[0056]在步驟16)中，所述海洋球石藻細胞購于美國國家海洋藻種保藏中心(CultureCenter of Marine Phytoplankton,CCMP),網(wǎng)址為:https://ncma.bigelow.0rg ;所述去除細胞表面碳酸鈣采用MES-NaOH緩沖液，其配方為:0.5mol/L MES (2-N-嗎啉代-乙磺酸)(購于上海生工BBI分裝)，pH5.5。
[0057]在步驟17)中，所述電轉(zhuǎn)化方法可采用Hepes電擊緩沖液，其配方為:0.080mol/LKCl, 0.005mol/L CaCl2,0.2mol/L 甘露醇,0.2mol/L 山梨醇,0.01mol/L Hepes (4-輕乙基哌嗪乙磺酸)(購于上海生工BBI分裝)，pH7.2。
[0058]本發(fā)明中，含有pGFP質(zhì)粒和含有pSELECT質(zhì)粒的大腸桿菌均購自泰京生物科技有限公司；不含任何質(zhì)粒的大腸桿菌ToplO購于碧云天生物技術(shù)研究所；雙酶切所用的酶均購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司。
[0059]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明基于對構(gòu)建海洋球石藻真核表達載體的研究分析得到，海洋球石藻對G418特別敏感，因此G418抗性基因最適合作為該真核表達載體的標記基因。同時，根據(jù)已報道的序列結(jié)合生物信息學(xué)分析，確定編碼巖藻黃素葉綠素a/c結(jié)合蛋白的啟動子作為該真核表達載體的啟動子，該啟動子基因來源于宿主基因組DNA，針對性強、啟動效果好，有利于整合到宿主的染色體中，從而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。選擇綠色熒光蛋白基因作為報告基因，由于綠色熒光蛋白是一種非常實用的新型報告基因，具有熒光特性穩(wěn)定、檢測方便、無種屬特異性、對受體細胞無毒害作用、不受假陽性干擾和靈敏度高等優(yōu)點。另外，海洋球石藻細胞表面有球石粒(碳酸鈣)包裹著，先通過脫鈣處理去掉碳酸鈣，再進行電擊法轉(zhuǎn)化，大大提高的轉(zhuǎn)化效率，并能在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)化藻細胞。因此，通過構(gòu)建海洋球石藻真核表達載體，作為微藻生物技術(shù)的工具，用于研究海洋球石藻機體代謝途徑等問題，并為構(gòu)建高產(chǎn)神經(jīng)酰胺基因工程藻株提高基礎(chǔ)載體。本發(fā)明所闡述的這種新型的海洋球石藻真核表達載體及其構(gòu)建方法，可用于海洋球石藻合成代謝途徑的調(diào)控過程研究，即通過利用微藻生物技術(shù)阻斷或修飾其代謝途徑，構(gòu)建高產(chǎn)神經(jīng)酰胺海洋球石藻基因工程藻株，以達到神經(jīng)酰胺的大量積累，為尋找一條新的生產(chǎn)神經(jīng)酰胺的天然途徑奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1是本發(fā)明中pUC18-gfp_fcp重組質(zhì)粒雙酶切的凝膠電泳圖。
[0061]圖2是本發(fā)明中pUC18-fcp_neo重組質(zhì)粒雙酶切的凝膠電泳圖。
[0062]圖3是本發(fā)明中pUC18-gfp_fcp重組質(zhì)粒的載體圖譜。
[0063]圖4是本發(fā)明中pUC18-fcp_neo重組質(zhì)粒的載體圖譜。
[0064]圖5是本發(fā)明構(gòu)建的真核表達載體電轉(zhuǎn)化海洋球石藻在突光顯微鏡(400倍)下觀察結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0065]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。[0066]實施例1
[0067]本實施例主要包括如下步驟來構(gòu)建海洋球石藻真核表達載體。
[0068]a)海洋球石藻抗生素抗性分析，將處于對數(shù)中期的藻液接種于50ml的三角瓶中使其細胞密度為104cellS/L，每瓶藻液25ml，再加入不同濃度的抗生素，分別是氨芐青霉素(O、100 u g/ml、300 u g/ml、500 u g/ml、700u u g/ml、900 u g/ml )、卡那霉素(0、100 u g/ml、300 u g/ml>500 u g/ml、700 ii g/ml>900 u g/ml)、氯霉素(0、25 ii g/ml、50 ii g/ml、100 ii g/ml、200 ii g/ml、300 ii g/ml)、新生霉素(0、25 ii g/ml、50 ii g/ml、100 ii g/ml、200 ii g/ml、300ii g/ml)、G418 (0、25 y g/ml、50 y g/ml、100 y g/ml、200 y g/ml、300 y g/ml)、鏈霉素(0、25 V- g/ml>50 V- g/ml、100 ii g/ml>200 u g/ml>300 u g/ml)、嘌呤霉素(0、25ii g/ml>50 u g/ml>75 u g/ml>100 u g/ml>125 u g/ml),抗生素濃度梯度由多次預(yù)實驗確定,每個濃度設(shè)置3個平行組，光照培養(yǎng)。每24h取樣一次，用盧戈氏液固定樣品，血球計數(shù)板計數(shù)，測定細胞數(shù)目，并觀察藻液顏色變化，篩選出海洋球石藻的最適抗生素、以確定標記基因。
[0069]b)根據(jù)目前已有的載體，考慮載體的多克隆位點及細菌的選擇標記，最終確定PUC18為基礎(chǔ)載體；通過查閱相關(guān)資料、查找已報道的相關(guān)蛋白基因的啟動子并結(jié)合生物信息學(xué)分析，確定海洋球石藻基因組中編碼巖藻黃質(zhì)葉綠素a/c結(jié)合蛋白基因的啟動子作為啟動子；而報告基因的選擇是通過比較已有的報告基因，綜合考慮其優(yōu)缺點而確定綠色熒光蛋白基因為報告基因。
[0070]c)根據(jù)步驟a)和b)確定的報告基因(綠色熒光蛋白基因gfp)、海洋球石藻啟動子(巖藻黃質(zhì)葉綠素a/c結(jié)合`蛋白啟動子基因fcp)和標記基因(G418的抗性基因neo)，根據(jù)這三段基因的序列分別設(shè)計三對特異引物進行PCR擴增，本實驗中采用的引物為:SEQIDN0.1:GFP-F:5' -GCGTCGACATGAGTAAAGGAGAAGAAC ~3'(劃線部分為 Sail 酶切位點);SEQIDN0.2:GFP-R:5' -GCTGCAGCTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3'(劃線部分為 PstI 酶切位點)；SEQIDN0.3:FCP-F: 5 ' -ACACAGAATTCTGTGTGGCTTGAG-3 '(劃線部分為 EcoRI 酶切位點)；SEQIDN0.4:FCP-R:5' -TTAAGAGCTCGGTGAGGAAGGAG-3'(劃線部分為 Sac I 酶切位點)；SEQIDN0.5:G418-F:5' -TATAATAGGATCCACTATAGGAGG-3 '(劃線部分為 BamH I 酶切位點)；SEQIDN0.6:G418-R:5' -AGACAGCGAGCTTCTAGATTTAG-3 '(劃線部分為 Xba I 酶切位點)。
[0071]d) pGFP質(zhì)粒提取按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒操作說明書進行:(I)、柱平衡步驟:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500iU的平衡液BL，12000rpm離心Imin ；棄收集管中的廢液；(2)、取I~5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，12000rpm離心Imin,盡量吸除上清；(3)、加入250 U I溶液Pl,充分懸浮細菌沉淀；(4)、加A 250 u I溶液P2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6~8次使菌體裂解；(5)、加入350 U I溶液P3，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6~8次，12000rpm離心IOmin,此時在離心管底部形成沉淀；(6)、將上一步收集的上清液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12000rpm離心30~60s，棄廢液；(7)、向吸附柱CP3中加A 600 u I漂洗液PW，12000rpm離心30~60s，棄廢液；(8)、重復(fù)上一步操作；(9)、將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心2min，除殘留；(10)、將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，加入50iil無菌水于吸附柱CP3內(nèi)，室溫靜置2min，12000rpm離心lmin，收集質(zhì)粒溶液。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒質(zhì)量，并取2 ill測其濃度。
[0072]e) PCR擴增綠色熒光蛋白基因:PCR反應(yīng)體系為25 yl，含Iyl模板質(zhì)粒、0.3iUrTaq DNA polymerase (rTaq DNA聚合酶)(購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司)、I U I上游引物 SEQIDN0.1 (10pmol/ii 1)、1 ii I 下游引物 SEQIDN0.2 (10pmol/u 1),2 u I dNTP(脫氧核苷三磷酸)(dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2.5mmol/L)、2.5 yllOXPCR 緩沖液(其中含有 IOOmmoI/L Tris-HCl (pH8.3), 500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)(購于 TaKaRa 廣州瑞真生物技術(shù)有限公司)、17.2iU無菌水。
[0073]PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、52°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸lOmin，保存于4°C。
[0074]f)綠色熒光蛋白基因的PCR擴增后的產(chǎn)物鑒定:用設(shè)計的GFP基因特異性引物GFP-F和GFP-R進行PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約717bp的特異性擴增片段，與預(yù)期大小相符。PCR電泳產(chǎn)物(與預(yù)期大小相符的條帶)經(jīng)DNA (脫氧核糖核酸)回收試劑盒回收后，進行T-A克隆，所用載體為pMD19-T (購于TaKaRa廣州瑞真生物技術(shù)有限公司)，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞。將IOiU連接產(chǎn)物(含有4iU回收的gfp基因、I ill pMD19-T載體和5iil solution〗連接酶)加入到200 ill的大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞中，置冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴2min ;再加入到含有800 LB(LB培養(yǎng)基)的試管中混勻，37°C, 150rpm (每min轉(zhuǎn)數(shù))60min,取200 y I涂布至Amp板(氨節(jié)青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培養(yǎng)過夜，至克隆長出，進行藍白斑篩選。挑取白色菌落，采用試劑盒小量提取質(zhì)粒.采用Pst I和Sal I雙酶切后電泳分析并進行測序鑒定，測序結(jié)果(見序列表1)證明閱讀框架正確，得到了含有目的基因片段的重組質(zhì)粒pMD19-T-gfp。
[0075]g) PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后以Pst I和Sal I雙酶切獲得717bp (堿基對)的目的基因片段，與經(jīng)Pst I和Sal I雙酶切的PUC18基礎(chǔ)載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，篩選得到 重組子pUC18-gfp (質(zhì)粒構(gòu)建圖如圖1)，其中M1為DNA Marker (分子量標記)(TaKaRaA-Hind III digest23130,9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125), I 為pUC18-gfp 質(zhì)粒，2 為 Pst I/Sal I 雙酶切 pUC18-gfp 質(zhì)粒結(jié)果，3 為 pUC18_gfp 質(zhì)粒 PCR 擴增 gfp，4 為 pUC18-gfp-fcp 質(zhì)粒，5 為 Sac I/EcoR I 雙酶切 pUC18-gfp-fcp 質(zhì)粒結(jié)果，6 為pUC18-gfp-fcp 質(zhì)粒 PCR 擴增 fcp, M2 為 DNA Marker (分子量標記)(TaKaRa IOObp DNALadderMarkerl500, 1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100)。對重組質(zhì)粒進行 PCR 驗證和酶切驗證可見一 717bp條帶,與預(yù)期大小相符,說明gfp基因已連接到pUC18載體上。
[0076]h)從海洋球石藻中提取基因組DNA:(I)取250mL指數(shù)期的藻液，7000rpm，離心IOmin,收集藻細胞沉淀，加入500 u L0.5%SDS (十二烷基磺酸鈉)和終濃度為20 y g ? mL_l的蛋白激酶K (購于AMERSC0上海生工分裝)，旋渦混合30s，55°C孵育30min，每IOmin輕輕的旋渦混合一次；(2)加入80 u L4.5M的NaCl和65°C預(yù)熱的CTAB溶液，輕輕混勻，65°C恒溫孵育IOmin ; (3)將樣品取出降至室溫，加入500 體積比為24:1的氯仿-異戊醇(480 u L:20ii L)和60 ii LTris平衡酚(購于Biotech上海生工)輕輕顛倒離心管混勻樣品；
(4)室溫下高速(12000rpm)離心5min ； (5)移出最上層部分的水相于新的無菌的離心管中加入0.6倍體積的異丙醇，上下輕輕顛倒幾次混勻，于室溫下靜止IOmin使沉淀形成；(6)全速離心(13000rpm) IOmin,使DNA沉淀下來，取出異丙醇，加入預(yù)冷的70%乙醇500 y L最高速度(13000rpm)離心5min,室溫干燥2min ； (7)加入35mL TE緩沖液(購于碧云天生物技術(shù)研究所)(也可用無菌水代替)和終濃度為0.lmg/ml的RNase37°C孵育2個h，以除去RNA。[0077]i)PCR擴增海洋球石藻啟動子基因fcp:PCR反應(yīng)體系為25iU，含Iiil模板DNA、
0.3ill rTaq DNA polymerase、I ii I 上游引物 SEQIDN0.3 (IOpmol/)、I 下游引物SEQIDN0.4 (lOpmol/u l),2u I dNTP, 2.5 u I 10XPCR 緩沖液、5 y 15%DMS0 (二甲基亞砜)、
1.25 u I Betaine(5mol/l甜菜堿)(購于Sigma廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司)，11.05 U I無菌水。
[0078]PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、56°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin的擴增，保存于4°C。
[0079]j)啟動子基因的PCR擴增后的產(chǎn)物鑒定:用設(shè)計的啟動子基因特異性引物FCP-F和FCP-R進行PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約483bp的特異性擴增片段，與預(yù)期大小相符。PCR電泳產(chǎn)物(與預(yù)期大小相符的條帶)經(jīng)DNA (脫氧核糖核酸)回收試劑盒回收后，進行T-A克隆，所用載體為PMD19-T，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞。將10 ill連接產(chǎn)物(含有4 ill回收的fcp基因、I ill ?1?19-1'載體和5111 solutionl連接酶)加入到200 ill的大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，置冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴2min ;再加入到含有800iU LB (LB培養(yǎng)基)的試管中，37°C，150rpm (每min轉(zhuǎn)數(shù))60min，取200iil涂布至Amp板(氨芐青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培養(yǎng)過夜，至克隆長出，進行藍白斑篩選。挑取白色菌落，采用試劑盒小量提取質(zhì)粒.采用EcoR I和Sac I雙酶切后電泳分析并進行測序鑒定，測序結(jié)果(見序列表1)證明啟動子序列正確，得到了含有目的基因片段的重組質(zhì)粒pMD19-T-fcp。
[0080]k) PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后以EcoR I和Sac I雙酶切獲得483bp (堿基對)的目的基因片段，分別與經(jīng)EcoR I和Sac I雙酶切的pUC18-gfp重組質(zhì)粒和pUC18基礎(chǔ)載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO,篩選得到重組子pUC18-gfp-fcp (質(zhì)粒構(gòu)建圖如圖1,質(zhì)粒圖譜如圖3);重組子pUC18-fcp (質(zhì)粒構(gòu)建圖如圖2)，其中M1為DNA Marker (分子量標記)(TaKaRaA-Hind III digest 23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125)，I 為pUC18-fcp 質(zhì)粒，2 為 Sac I/EcoR I 雙酶切 pUC18_fcp 質(zhì)粒結(jié)果，3 為 pUC18_fcp 質(zhì)粒 PCR擴增 fcp，4 為 pUC18-fcp_neo 質(zhì)粒，5 為 Xba I/BamH I 雙酶切 pUC18-fcp_neo 質(zhì)粒結(jié)果，6為 pUC18-gfp-fcp 質(zhì)粒 PCR 擴增 neo，M2 為 DNA Marker (分子量標記)(TaKaRa IOObp DNALadderMarkerl500, 1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100)。對重組質(zhì)粒進行PCR驗證和酶切驗證可見一 484bp條帶,與預(yù)期大小相符,說明fcp基因已分別連接到pUC18-gfp重組質(zhì)粒和PUC18載體上。
[0081]I) pSELECT質(zhì)粒提取按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒操作說明進行。
[0082]m)PCR擴增G418抗性基因neo =PCR反應(yīng)體系為25 yl，含I 模板質(zhì)粒、0.3 U IrTaq DNA polymerase、I y I 上游引物 SEQIDN0.5 (10pmol/u 1),1 U I 下游引物 SEQIDN0.6(10pmol/u l),2u I dNTP, 2.5 u 110 X PCR 緩沖液、17.2 y I 無菌水。
[0083]PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、51°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸lOmin，保存于4°C。
[0084]n)標記基因neo的PCR擴增后的產(chǎn)物鑒定:用設(shè)計的neo基因特異性引物G418-F和G418-R進行PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約797bp的特異性擴增片段，與預(yù)期大小相符。PCR電泳產(chǎn)物(與預(yù)期大小相符的條帶)經(jīng)DNA (脫氧核糖核酸)回收試劑盒回收后，進行T-A克隆，所用載體為pMD19-T，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞。將10 ill連接產(chǎn)物(含有4 ill回收的neo基因、I ill pMD19_T載體和5 solutionl連接酶)加入到200 ill的大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，置冰浴30min，42°C熱激90s，冰浴21^11;再加入到含有800111 LB (LB培養(yǎng)基)的試管中，37°C，150rpm (每min轉(zhuǎn)數(shù))60min，取200iil涂布至Amp板(氨芐青霉素)板(10mg/ml)，37°C倒置培養(yǎng)過夜，至克隆長出，進行藍白斑篩選。挑取白色菌落，采用試劑盒小量提取質(zhì)粒.采用Xba I和BamH I雙酶切后電泳分析并進行測序鑒定，測序結(jié)果(見序列表1)證明閱讀框架正確，得到了含有目的基因片段的重組質(zhì)粒pMD19-T-neo。
[0085]O)PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后以Xba I和BamH I雙酶切獲得797bp(堿基對)的目的基因片段，與經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切的pUC18_fcp重組質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，篩選得到重組子pUC18-fcp-neo(質(zhì)粒構(gòu)建圖如圖2,質(zhì)粒圖譜如圖4)。對重組質(zhì)粒進行PCR驗證和酶切驗證可見一 797bp條帶,與預(yù)期大小相符，說明neo基因已連接到pUC18_fcp重組質(zhì)粒上。
[0086]p)海洋球石藻細胞表面去除球石粒(碳酸鈣)過程:取100ml指數(shù)生長期的藻液，4°C下4000rpm離心5min ;將收集的細胞沉淀重懸于5ml MES-NaOH緩沖液(0.5mol/L,pH5.5)，置于18°C培養(yǎng)箱反應(yīng)2h。
[0087]q)電轉(zhuǎn)化過程:將步驟p)處理的藻細胞在4°C下4000rpm離心5min,棄廢液；用Hepes 電擊緩沖液(0.080mol/L KCl, 0.005mol/L CaCl2, 0.2mol/L 甘露醇，0.2mol/L 山梨醇，0.01mol/L Hepes (4_羥乙基哌嗪乙磺酸)，pH7.2)洗滌細胞I次，4°C下4000rpm離心5min，棄廢液；再將細胞重懸于Ifepes緩沖液，使其終濃度為5X IO7個/ml，再加入重組質(zhì)粒充分混勻，使重組質(zhì)粒的終濃度為IOii g/ml，用Iml寬口吸頭充分混勻，冰浴15min ；吸取IOOii I混合液加入0.1cm冰浴的電擊杯(購于Bio-Rad泰京生物科技有限公司)，電擊(200V, 2ms/次，2次);電擊完畢冰浴15min，再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)24后加入G418 (終濃度為100 u g/ml),繼續(xù)培養(yǎng)；一周后取樣置于熒光顯微鏡下觀察，如圖5所示，該圖是置于400倍的熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果，圖中視野中有三個被轉(zhuǎn)化的微藻細胞發(fā)綠色熒光，確定為被轉(zhuǎn)化的陽性藻株。`
【權(quán)利要求】
1.海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: 1)海洋球石藻抗生素抗性分析及選擇標記基因的篩選； 2)基礎(chǔ)載體、啟動子基因及報告基因的選擇； 3)根據(jù)步驟I)和2)確定的標記基因、啟動子基因及報告基因的序列設(shè)計引物； 4)從含有pGFP質(zhì)粒的大腸桿菌ToplO-pGFP中提取質(zhì)粒，作為下一步的模板； 5)PCR擴增報告基因gfp ； 6)PCR電泳回收產(chǎn)物，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采用Pst I和Sal I進行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進行測序鑒定； 7)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞,篩選得到重組質(zhì)粒； 8)從海洋球石藻細胞中提取DNA； 9)PCR擴增海洋球石藻fcp啟動子基因； 10)PCR電泳回收產(chǎn)物，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采用EcoR I和Sac I進行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進行測序鑒定； 11)選擇與預(yù)期大小相符的條 帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，分別連接步驟g)構(gòu)建的重組質(zhì)粒和質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，篩選得到兩種重組質(zhì)粒; 12)從含有pSELECT質(zhì)粒的大腸桿菌ToplO-pSELECT中提取質(zhì)粒，作為下一步的模板； 13)PCR擴增標記基因neo ； 14)PCR電泳回收產(chǎn)物，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒采用Xba I和BamH I進行雙酶切后電泳分析PCR產(chǎn)物并進行測序鑒定； 15)選擇與預(yù)期大小相符的條帶進行回收，通過雙酶切得到目的基因片斷，連接步驟j)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選得到重組質(zhì)粒； 16)將海洋球石藻細胞進行處理，去除細胞表面球石粒； 17)采用電轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建的真核表達載體共轉(zhuǎn)化海洋球石藻細胞，并在熒光顯微鏡下觀察確定轉(zhuǎn)化的細胞。
2.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟I)中，所述海洋球石藻抗生素選自氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素、G418、鏈霉素、新生霉素、嘌呤霉素等中的一種；在步驟2)中，所述基礎(chǔ)載體可采用PUC18。
3.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟3)中，所述引物采用 SEQIDN0.1、SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDN0.5 和 SEQIDN0.6 ;其核苷酸序列分別為:
SEQIDN0.1:GFP-F:5' -GCGTCGACATGAGTAAAGGAGAAGAAC _3'， 其中，劃線部分為SalI酶切位點；
SEQIDN0.2:GFP-R:5' -GCTGCAGCTTTATTTGTATAGTTCATCCA-3'， 其中，劃線部分為PstI酶切位點；
SEQIDN0.3:FCP-F:5' -ACACAGAATTCTGTGTGGCTTGAG-3'， 其中，劃線部分為EcoRI酶切位點；
SEQIDN0.4:FCP-R:5' -TTAAGAGCTCGGTGAGGAAGGAG-3'，其中，劃線部分為Sac I酶切位點；
SEQIDN0.5:G418-F:5' -TATAATAGGATCCACTATAGGAGG-3'， 其中，劃線部分為BamH I酶切位點；
SEQIDN0.6:G418-R:5' -AGACAGCGAGCTTCTAGATTTAG-3'， 其中，劃線部分為Xba I酶切位點。
4.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟5)中，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、52°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin的擴增，保存于4°C ； 在步驟9)中，所述PCR擴增的反應(yīng)條件可為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、56°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin的擴增，保存于4°C ； 在步驟13)中，所述PCR擴增的反應(yīng)條件可為:94°C預(yù)變性5min后進行94°C變性30s、51°C復(fù)性30s、72°C延伸Imin的35個循環(huán)，72°C再延伸IOmin的擴增，保存于4°C。
5.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟6)、10)和14)中，所述質(zhì)粒采用pMD19-T質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟6)和7)中，所述雙酶切采用的酶為Pst I和Sal I。
7.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟10)和11)中，所述雙酶切采用EcoRI和Sac I。
8.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟14)和15)中，所述雙酶切采用Xba I和BamH I。
9.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟16)中，所述去除細胞表面碳酸鈣采用MES-NaOH緩沖液，其配方為:0.5mol/L2-N-嗎啉代-乙磺酸，PH5.5。
10.如權(quán)利要求1所述海洋球石藻真核表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于在步驟17)中，所述電轉(zhuǎn)化方法采用Ifepes電擊緩沖液，其配方為:0.080mol/L KCl, 0.005mol/LCaCl2,0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇，0.01mol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH7.2。
【文檔編號】C12N15/66GK103642831SQ201310626234
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】劉靜雯, 蔡慧農(nóng), 蔡藝欽 申請人:集美大學(xué)