擬南芥At5g61350基因在根系發(fā)育方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及擬南芥At5g61350基因在調(diào)控植物根系發(fā)育方面的應(yīng)用。擬南芥At5g61350基因所編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控著NH4+的轉(zhuǎn)運，該基因突變體，即缺失At5g61350基因或者At5g61350基因沉默的擬南芥對銨鹽不耐受?，F(xiàn)有技術(shù)中，雖然預(yù)測At5g61350基因與植物根系生長發(fā)育相關(guān)，但由于缺少相關(guān)實驗證明，因此關(guān)于該基因的確切功能一直未能得到確認(rèn)。發(fā)明人通過一些列實驗證明，擬南芥At5g61350基因與NH4+轉(zhuǎn)運相關(guān)，參與了NH4+通過調(diào)控根毛尖端Ca2+濃度梯度來控制根毛生長的這一通路來調(diào)控根系的發(fā)育生長，從而為利用這一基因來培育新的作物品系提供了新的可能。
【專利說明】擬南芥At5g61350基因在根系發(fā)育方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及擬南芥基因在調(diào)控植物根系發(fā)育方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]氮是植物最重要的營養(yǎng)元素之一，約占植物干重的1%_5%，其中硝酸鹽和銨鹽是植物從土壤中獲取氮營養(yǎng)的主要來源。銨(ammonium，NH4+)作為氮營養(yǎng)主要提供者之一，由于植物針對銨離子同化時消耗的能量少于硝酸根離子，所以往往優(yōu)先吸收銨離子。同時銨離子作為重要的信號分子參與了許多生理過程的調(diào)節(jié)，因此研究植物細胞對銨離子的轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有十分重要的意義。
[0003]擬南芥基因?qū)儆?CrRLKlL (Receptor like kinase)類受:體蛋白激酶基因，其CDS長度為2529bp，編碼842個氨基酸的蛋白，已有研究表明其與植物根系根毛發(fā)育相關(guān)，但是尚未見到有關(guān)該基因與NH4+轉(zhuǎn)運有關(guān)的研究報告，而由此介導(dǎo)的根系生長更未見到相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供擬南芥基因在植物根系生長發(fā)育方面的應(yīng)用，以拓展基因J t5g61350的應(yīng)用范圍。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
擬南芥基因在植物根系生長發(fā)育方面的應(yīng)用，該基因所編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控NH4+的轉(zhuǎn)運。
[0006]所述擬南芥基因在植物根系生長發(fā)育方面的應(yīng)用，擬南芥
基因突變體，即缺失基因或者基因沉默的擬南芥對銨鹽不耐受，即缺矢At5g61350基因或者基因沉默的擬南芥在有銨鹽存在時無法形成正常的根毛。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)中，雖然有對擬南芥基因功能的預(yù)測，預(yù)測該基因與植物根系生長發(fā)育相關(guān)，但是由于缺少相關(guān)實驗證明，因此關(guān)于該基因的確切功能一直未能得到確認(rèn)。發(fā)明人通過一系列實驗證明，擬南芥基因通過與NH4+轉(zhuǎn)運相關(guān)，參與了NH4+通過調(diào)控根毛尖端Ca2+濃度梯度形成來控制根毛生長的這一通路來調(diào)控根系的發(fā)育生長，從而為利用這一基因來培育新的作物品系提供了新的可能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為MS培養(yǎng)基上生長7天的擬南芥WT、cap 1-1和超表達回補幼苗根；
圖2為MS培養(yǎng)基上生長的擬南芥ca/77-7根毛缺失Ca2+濃度梯度；a_d和e_h分別是Wt和capl-Ι的不同生長期根毛的透射光掃描圖和YC3.6的熒光掃描圖；
圖3為缺失銨(NH4+)的MS培養(yǎng)基上生長7天的擬南芥WT和capl-Ι幼苗的根；圖4為擬南芥沐7J5?基因亞細胞定位；
圖5為擬南芥根毛細胞內(nèi)外NH4+轉(zhuǎn)運情況。
【具體實施方式】
[0009]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的解釋說明。
實施例
[0010]擬南芥J t5g61350基因的⑶S長度為2529bp，編碼842個氨基酸的蛋白，屬于CrRLKlL (Receptor like kinase)類受體蛋白激酶基因，現(xiàn)有研究表明，該基因與根系根毛發(fā)育相關(guān)，但是這些研究多是基于基因芯片的預(yù)測性研究，缺乏實質(zhì)性的證據(jù)。為此，發(fā)明人以擬南芥At5g61350基因突變體為基礎(chǔ)，對該基因的功能進行了深入研究。
[0011]擬南芥基因突變體從擬南芥資源中心(ABRC,0hio State University)獲得，所述擬南芥沐7基因突變體為T-DNA插入突變體(ca/77-7 )。
[0012]實驗一、發(fā)明人首先證明了擬南芥沐7J5?基因與植物根毛發(fā)育相關(guān)
將擬南芥野生型(WT)和突變體(ca/77-7)種子在1.2%瓊脂的MS培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)間，光/暗周期為16/8h，溫度22°C，相對濕度70%的條件下萌發(fā)并豎直生長I周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體(ca/77-7)的根毛發(fā)育明顯受到抑制，如圖1所示，野生型和突變體差別主要表現(xiàn)在根毛長度和形態(tài)上。圖1中#1和#2則是將At5g61350基因通過PCR的手段將基因的cDNA片段從野生型擬南芥中克隆出來并連在超表達載體pCAMBIA super-1300上，利用擬南芥花侵染轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入突變體中，在潮霉素上篩選得到轉(zhuǎn)基因純合體中，與野生型和突變體同時在MS上生長，生長條件與上面一致，發(fā)現(xiàn)由于該基因的轉(zhuǎn)入，突變體的根毛生長表型得以恢復(fù)，根毛恢復(fù)與野生型一致的發(fā)育。
[0013]上述結(jié)果揭示At5g61350基因與根系根毛的生長發(fā)育極度相關(guān)。
[0014]實驗二、發(fā)明人證明了擬南芥基因調(diào)控根毛發(fā)育的機制
現(xiàn)有研究表明，根毛細胞中鈣離子梯度是根毛生成和發(fā)育所必需的，在根毛細胞中抑制鈣梯度將會導(dǎo)致根毛生長的停止。
[0015]為此，發(fā)明人利用細胞生物學(xué)的熒光成像技術(shù)(顯微共聚焦；FV1000，Olympus，Tokyo, Japan)對擬南芥突變體(ca/?7-7)中的Ca2+進行了檢測,與野生型不同，capl-l突變體根毛尖端的Ca2+并不能形成濃度梯度分布。由此可以證明，擬南芥基因通過影響根毛細胞中Ca2+濃度梯度的形成來控制根毛的伸長。
[0016]為進一步證明基因參與調(diào)控根毛細胞中Ca2+濃度梯度形成，發(fā)明人將鈣監(jiān)測鈣量的載體YC3.6轉(zhuǎn)入WT和ca/77-7，利用共聚焦檢測技術(shù)對根毛細胞內(nèi)Ca2+濃度進行監(jiān)測。如圖2所示，結(jié)果鈣共聚焦監(jiān)測表明，突變體中缺失了根毛生長發(fā)育必須的鈣梯度。
[0017]以上這些結(jié)果表明，擬南芥基因通過調(diào)控根毛發(fā)育必要的生理指標(biāo)從而調(diào)控了根毛的生長。
[0018]實驗三、擬南芥基因調(diào)控根毛發(fā)育的分子機理
如圖3所示，通過圖3A根毛形態(tài)和圖3B根毛數(shù)量及長度的對比，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)只有在去除NH4+的MS培養(yǎng)基上生長時capl-Ι突變體才能形成正常根毛，并且根毛的長度和數(shù)量幾乎與野生型沒有差別。而通過進一步的檢測，隨著根毛生長的恢復(fù)，利用鈣共聚焦監(jiān)測表明，擬南芥capl-Ι突變體根毛Ca2+梯度也得以重建。由此可以證明，擬南芥J t5g61350基因參與了一個由NH4+介導(dǎo)的，通過影響胞質(zhì)中Ca2+梯度分布從而調(diào)控根毛發(fā)育的信號通路。
[0019]實驗四、驗證擬南芥沐7基因調(diào)控根毛發(fā)育的分子機理
為進一步驗證擬南芥AS沐基因參與由NH4+介導(dǎo)的，通過影響胞質(zhì)中Ca2+濃度梯度分布從而調(diào)控根毛發(fā)育的信號通路的分子機理，發(fā)明人利用報告基因GFP對擬南芥At5g61350基因進行了亞細胞定位，將克隆的構(gòu)建在報告基因GFP的表達載體pHBT上，通過將構(gòu)建好的載體pHBT-GFP-At5g61350和對照載體pHBT-GFP-NOS轉(zhuǎn)化洋蔥表皮，如圖4A所示,及擬南芥原生質(zhì)體,如圖4B所示,發(fā)現(xiàn)目的基因表達在液泡膜，并且在圖4B中，還將液泡分離出來，結(jié)果清楚地表明，在轉(zhuǎn)對照的材料中GFP的熒光不見了，Wi轉(zhuǎn)At5g61350的載體則熒光定位在夜泡膜上。由上充分證明，擬南芥基因所表達的蛋白定位于液泡膜上，而液泡作為細胞的NH4+庫在調(diào)節(jié)細胞銨濃度平衡上具有重要的作用，銨在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及植物界熟知的銨毒如何在細胞中被調(diào)節(jié)都是研究的熱點。
[0020]為檢驗擬南芥基因所表達蛋白與NH4+轉(zhuǎn)運相關(guān)，發(fā)明人進行了膜片鉗的實驗，實驗情況如下:
發(fā)明人對根毛細胞內(nèi)外NH4+轉(zhuǎn)運情況進行了檢測。如圖5所示，利用膜片鉗技術(shù)(EPC-9patch-clamp amplifier, HEKA Elektronik, Lambrecht, Germany)檢測了根毛原生質(zhì)體質(zhì)膜上銨離子電流的情況，發(fā)現(xiàn)擬南芥ca/77-7突變體內(nèi)向NH4+電流較野生型小，從另一角度證明capl-Ι突變體根毛細胞質(zhì)中的NH4+含量相對較高，反饋抑制了 NH4+的內(nèi)流。
[0021 ] 說明擬南芥J t5g61350基因表達的蛋白作為NH4+的感受體，可以感知NH4+并激活NH4+的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，使胞質(zhì)中的NH4+濃度維持一個正常水平，保護植物體免受NH4+鹽毒害。
[0022]綜上，發(fā)明人認(rèn)為，擬南芥J t5g61350基因翻譯、表達的蛋白，作為一種定位于液泡膜的受體激酶，用作NH4+的感受子，通過介導(dǎo)胞質(zhì)中NH4+的轉(zhuǎn)運，進而調(diào)整胞內(nèi)Ca2+梯度的形成，最終調(diào)控根毛的頂端生長，這一成果對于調(diào)整植物生長過程中銨鹽的使用、植物品種根系培育及培育銨鹽吸收及轉(zhuǎn)運作物新品種具有重要的理論和生產(chǎn)意義。
【權(quán)利要求】
1.擬南芥沐7J5?基因在植物根系生長發(fā)育方面的應(yīng)用，其特征在于，該基因所編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控NH4+的轉(zhuǎn)運。
2.如權(quán)利要求1所述擬南芥沐7J5?基因在植物根系生長發(fā)育方面的應(yīng)用，其特征在于，擬南芥基因突變體，^^Α?5^61350基因或者基因沉默的擬南芥對銨鹽不耐受。
【文檔編號】C12N15/54GK103614397SQ201310605513
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】白玲, 周云, 馬曉楠, 張國增, 宋純鵬 申請人:河南大學(xué)