一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括：步驟1）酵母目標(biāo)突變體的獲得；步驟2）多重逆境篩選；步驟3）候選基因測序；步驟4）抗多重逆境檢驗。本發(fā)明根據(jù)異源功能互補(bǔ)、利用對各種逆境條件均敏感的酵母突變體，快速篩選出植物cDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因?？稍诙虝r間內(nèi)篩選出大量與植物多重逆境抗性相關(guān)的基因，且實驗成本低、操作程序簡單、穩(wěn)定性好、效率高。
【專利說明】一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，涉及一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，具體涉及一種根據(jù)異源功能互補(bǔ)、利用對各種逆境條件均敏感的酵母突變體，快速篩選出植物CDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，由于環(huán)境變化加劇，對世界范圍內(nèi)的作物生長帶來了巨大的影響。據(jù)統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)，適于耕種的土地不足10%，大部分土地處于干旱、高溫、低溫、鹽堿、重金屬等逆境中。而且，因人口的不斷增長對糧食需求的壓力越來越大，迫切需要培育出能在各種非生物脅迫下生長的經(jīng)濟(jì)作物。在植物抗逆性研究中，目的不僅在于從分子水平上解釋植物適應(yīng)逆境的機(jī)制，而且更希望獲得各種抗逆基因，用于作物的抗逆育種。
[0003]目前，已獲得了許多與非生物脅迫抗性有關(guān)的基因，為植物抗逆性的生物工程提供了可靠的理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。對植物抗逆性的分子機(jī)制研究表明，植物的抗逆性是由多基因控制的，而且植物生長在自然界中，往往處于多種逆境條件的共同脅迫下，多種非生物脅迫的同時出現(xiàn)對植物來說是最致命的，最有效應(yīng)對的方法是找出調(diào)控逆境組合反應(yīng)的基因。
[0004]目前，分離抗逆基因的方法很多，但或多或少都存在一些不足。如mRNA差異顯示方法，假陽性比例高；cDNA文庫的差示篩選，容易找到表達(dá)量高的基因，很難找到低拷貝數(shù)、低表達(dá)的基因；圖位克隆法，準(zhǔn)確率高，但是代價昂貴，操作復(fù)雜。最主要的是，這些方法一般僅能得到與某種特定脅迫相關(guān)的若干基因，基因數(shù)量有限，并且只是針對那些遺傳背景和基因組信息齊全的植物。如果能夠快速篩選出非模式抗逆植物資源中的多重逆境抗性相關(guān)的大量基因，將具有非常重要的意義。
[0005]酵母作為研究高等真核生物的一種重要的模式生物，不僅在生物信息學(xué)方面發(fā)揮著重要的作用，其豐富的突變體在其他生物基因克隆和功能驗證等方面也發(fā)揮著重要的作用。多重逆境單細(xì)胞篩選酵母異源互補(bǔ)方法是利用對各種逆境組合敏感的酵母突變體，來建立異源功能互補(bǔ)篩選平臺，篩選植物體內(nèi)控制逆境組合的新基因，將在植物抗逆基因的篩選中發(fā)揮重要作用，為高等真核生物的基因克隆提供了一種捷徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，快速篩選出抗11202、211(:12』(1(:12、似(:1及耐高溫、耐低溫的植物多重逆境抗性基因，該方法具有成本低、操作程序簡單、篩選效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。
[0008]一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步驟:
[0009]步驟I)酵母目標(biāo)突變體的獲得[0010]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫的各種突變體,接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮YPD液體培養(yǎng)基，至分裂2代。收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(OD6tltl=0.4~0.6)，10倍梯度稀釋5次，分別置于含0.5-2.0mmol/L H2O2,20-80mmol/L ZnCl2,50-250mmol/L CdCl2、150-350mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，及分別在高溫37°C、低溫15°C、正常條件(30°C)下置于YPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；從中篩選出對上述逆境條件均敏感的酵母菌株突變體AHogl,作為文庫篩選的宿主菌株。
[0011]步驟2)多重逆境篩選
[0012]用植物cDNA文庫轉(zhuǎn)化步驟I)中篩選出的突變體菌株AHogl得到酵母轉(zhuǎn)化子，并培養(yǎng)于含0.25-1.0mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基上。挑取生長出的單克隆，培養(yǎng)于含
0.25-1.0mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基上。將生長狀態(tài)良好的酵母轉(zhuǎn)化子分別培養(yǎng)于含 0.25-1.0mmol/L H202、5-15mmol/L ZnCl2,20-100mmol/L CdCl2、100-350mmol/L NaCl的營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基上，及分別在高溫37°C、低溫15°C、正常條件(30°C)下置于營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0013]步驟3)候選基因測序
[0014]提取步驟2)中在上述各種逆境條件下都生長良好的酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行測序，所得植物基因進(jìn)行抗多重逆性檢驗。
[0015]步驟4)抗多重逆性檢驗
[0016]選取缺失步驟3)中所得植物基因的植物突變體，與植物野生型同時培養(yǎng)于分別含有 1.0-15mmol/L H202、100_450umol/L ZnCl2、50-350mmol/L CdCl2、50-300mmol/L NaCl、的MS固體培養(yǎng)基，及在高溫37°C、低溫15°C、正常條件22°C下置于MS固體培養(yǎng)基。如果該植物突變體的生長狀態(tài)差于植物野生型，則步驟3)測序得到的基因即為該植物的多重逆境抗性基因。
[0017]進(jìn)一步，所述植物為擬南芥，但不局限與該植物，水稻、二穗短柄草、小麥、大豆、楊樹等多種植物均可適用于該方法，從而篩選出這些植物中與多重逆境抗性相關(guān)的基因。
[0018]所述擬南芥中多重逆境抗性基因為富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
[0019]所述植物的多重逆境抗性基因是指植物中與抗H2O2、ZnCl2、CdCl2、NaCl及抗高溫、低溫環(huán)境相關(guān)的基因。
[0020]優(yōu)選地，步驟I)中，YPD固體培養(yǎng)基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl濃度分別為1.0-2.0mmol/L、30_60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。
[0021]更優(yōu)選地，步驟I)中，YPD固體培養(yǎng)基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl濃度分別為 1.5mmol/L、50mmol/L、200mmol/L、300mmol/Lo
[0022]步驟2)中所述營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基的缺失營養(yǎng)成分為亮氨酸。
[0023]優(yōu)選地，步驟2)中，所述營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基所加入H2O2濃度為0.5mmol/L,所述營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl濃度分別為0.25-0.75mmol/L、7.5-15mmol/L、40-lOOmmol/L、150-300mmol/L。
[0024]更優(yōu)選地，步驟2)中，所述營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基加入的H202、ZnCl2, CdCl2,NaCl 濃度分別為 0.5mmol/L、10mmol/L、60mmol/L、200mmol/L。
[0025]優(yōu)選地，步驟4)中，所述MS固體培養(yǎng)基中加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl的濃度分別為 2.0-10mmol/L、200-400umol/L、100-300mmol/L、100-300mmol/L。[0026]更優(yōu)選地，步驟4)中，所述MS固體培養(yǎng)基中加入的H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl的濃度分別為 H202、ZnCl2、CdCl2、NaCl 的濃度分別為 7.5mmol/L、350umol/L、250mmol/L、200mmol/
L0
[0027]本發(fā)明所用的YPD液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、SD液體培養(yǎng)基、SD固體培養(yǎng)基、MS固體培養(yǎng)基均為市售常規(guī)產(chǎn)品。
[0028]本發(fā)明所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法從多種酵母突變體中篩選出對各種逆境條件(抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高溫、低溫環(huán)境)均敏感的酵母突變體AHogl,將該酵母突變體作為宿主菌株，并根據(jù)異源功能互補(bǔ)，快速篩選出植物cDNA文庫中對多種逆境都具有抗性的抗逆基因，具體的篩選流程圖參見圖1。本發(fā)明以擬南芥為例，將擬南芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母突變體△ Hogl得到酵母轉(zhuǎn)化子，并將酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行多重逆境抗性檢測，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化了擬南芥基因I的酵母轉(zhuǎn)化子對所述各種逆境處理均表現(xiàn)出抗性，對該基因I進(jìn)行測序，通過比對，確認(rèn)該基因I為擬南芥中富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620，從而快速篩選出擬南芥中抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高溫、低溫條件的多重逆境抗性基因為富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
[0029]本發(fā)明的有益效果如下:
[0030]1.本發(fā)明利用的是單細(xì)胞系統(tǒng)-酵母，酵母菌為真核生物，與植物表達(dá)系統(tǒng)更為接近，也具有糖基化、二硫鍵形成以及蛋白質(zhì)折疊翻譯后加工等過程，從而使得篩選出的植物基因所編碼的蛋白功能正常發(fā)揮，多重逆境抗性基因假陽性的概率大大降低。
[0031]2.本發(fā)明可在短時間內(nèi)篩選出大量與植物多重逆境抗性相關(guān)的基因，且實驗成本低、操作程序簡單、穩(wěn)定性好、效率高 。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為本發(fā)明利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的篩選流程圖；
[0033]圖2為本發(fā)明實施例1酵母野生型和各種突變體在不同逆境條件下的生長情況圖，突變體1:AStel，突變體2:ABckl，突變體3:APbs2，突變體4:AMkkl，突變體5:△ Hogl，突變體 6:ASLT2，突變體 7: AMsn2 ；
[0034]圖3為本發(fā)明實施例1中擬南芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母突變體Λ Hogl后在含H2O2的營養(yǎng)缺陷SD培養(yǎng)基上的生長情況圖；
[0035]圖4為本發(fā)明實施例1中已經(jīng)轉(zhuǎn)化了基因I的酵母轉(zhuǎn)化子在多重逆境條件下的生長情況圖；
[0036]圖5為本發(fā)明實施例1中富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發(fā)生突變的擬南芥突變體在多重逆境條件下的生長情況圖。
【具體實施方式】
[0037]以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但所述實施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)說明的是，以下實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。[0038]如無特殊說明，本發(fā)明所述各實驗材料及生物用品均為市售常規(guī)產(chǎn)品，所用生物學(xué)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用方法實施。
[0039]實施例1
[0040]1、多重逆境敏感性酵母菌株的獲得
[0041]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫中各種菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮YPD培養(yǎng)基，至分裂2代。收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(OD6tltl=0.4-0.6)，10倍梯度稀釋后，共梯度稀釋5次，置于分別含有1.5mmol/LH202、50mmol/L ZnCl2,200mmol/L CdCl2,300mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 30°C、培養(yǎng)48h，并同時，在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置于將不含上述成分的YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。
[0042]觀察酵母野生型和各種酵母突變體在不同逆境條件下的生長情況，篩選出對上述6種逆境條件均敏感的酵母突變體，各酵母突變體的生長情況以以下7種酵母突變體為例(突變體1: Λ Stel，突變2: Λ Bckl，突變體3: Λ Pbs2，突變體4: Λ Mkkl，突變體5: AHogl,突變體6:ASLT2，突變體7:AMsn2)，具體結(jié)果參看圖2。其中，其他的酵母突變體的生長情況均與圖2中突變體1-4及突變體6-7的生長情況類似，在此不再一一羅列。
[0043]從圖2可以看出突變體5即突變體AHogl對各種逆境條件均敏感，適合作為文庫篩選的宿主菌株。
[0044]2、擬南芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母突變體
[0045]2.1取適量過夜培養(yǎng)于YPD液體培養(yǎng)基的突變體Λ Hogl菌液，接種于300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基，至OD600=0.2~0.3，30°C恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6。
[0046]2.2室溫離心5000rpm、5m`in，棄上清，加入25_50ml無菌水重懸洗滌酵母沉淀細(xì)胞，離心棄上清，重復(fù)洗滌一次，沉淀用1.5ml TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞。
[0047]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入以下成分:cDNA文庫質(zhì)粒lOOug，和10mg/ml的鮭魚精DNA200ul，振蕩混勻。
[0048]2.4 加入 6ml PEG/LiAc，劇烈振蕩，30°C恒溫，200rpm 振蕩培養(yǎng) 30min。
[0049]2.5加入700ul DMSO,緩緩倒置混勻(不能振蕩)，42°C水浴熱休克5min，迅速插入冰浴冷卻l-2min。
[0050]2.6室溫離心2500rpm、5min,盡量棄盡上清，以IOml無菌水重懸沉淀細(xì)胞,涂布于含0.5mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培養(yǎng)3_5天。結(jié)果參看圖3，從圖3可以看出平板上長出單克隆數(shù)量多，菌落密度大，說明轉(zhuǎn)化效率高，滿足植物cDNA文庫篩選要求。
[0051]挑取生長出的單克隆，培養(yǎng)于含0.5mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基(不含亮氨酸)上。
[0052]3、利用多重逆境檢驗所得到的轉(zhuǎn)化子的抗逆性
[0053]將上述所得到的酵母轉(zhuǎn)化子和已經(jīng)轉(zhuǎn)化了空載體pGADGH的空載體酵母轉(zhuǎn)化子，接種于營養(yǎng)缺陷型SD液體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮營養(yǎng)缺陷型液體SD培養(yǎng)基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度 3 次，置于含0.Smmol /T, H2O2、10mmol /T, ZnCl2、60mmol/L CdCl2、200mmol/LNaCl 的營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)中，培養(yǎng)條件為30°C、培養(yǎng)48h，并同時在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C )下置于將不含上述成分的SD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)48h。每個轉(zhuǎn)入文庫質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子做3個重復(fù)，其中轉(zhuǎn)化了基因I的酵母轉(zhuǎn)化子對上述各種逆境處理均表現(xiàn)出抗性，已經(jīng)轉(zhuǎn)化了基因I的酵母轉(zhuǎn)化子在多重逆境條件下的生長情況如圖4所示。
[0054]4、對在多重逆境條件有抗性的質(zhì)粒，進(jìn)行測序
[0055]提取上述步驟3中在各種逆境條件下都生長良好的含基因I的酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQ ID N0:1所示，具體如下:
[0056]TTTCTTTTCGGTGATGAGAACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCTCAACCAAACCCACTAAATATCTACATTACCAAAAATGTTCACAAAATCTATCCTTTTGGCTTCTCTTCTTATCATCATCCTCGTCTCTGCAACTGAATCAGCTCGTCAAAAGAGCGGGAACGATGGTTTAGGATTCGGTGGTGTACCCGGATCCGGATTTATACCCGGGTTTGGAAACGGGTTTCCGGGGACTGGAGTTGGTGGTGGATACGGTGGAGGGTTTGGTGGTCCTAGCGGAGGGTTTGGGAAAGGAGGTGTGGTGAGACCAACGGTTACTTGCAAAGAGAAAGGACCTTGTAACGGCAAGAAGCTTAGGTGTCCTGCTAAGTGTTTCAAATCTTTTAGCCGCTCCGGGAAAGGATACGGCGGTGGAGGTGGCGGTGGAGGATGTACTATGGATTGTAAGAAGAAGTGTATCGCTTATTGTTAAGATATAATAAAGATCACATCATCTTTATAATATATAGTCATTATGATGGTTATGTATTTTCTATGTTATAGCCTATAGATTATGAGATCATGAGGATCCTTTTGTCTTGATTCGATTTGTAGCAGTTTTATATGCATAATATATGGTTGTGATGAATAAATGAGGGAACTTTACTGTTTTCTCTATTGTATGTTTGTGTAAGAGATTCTAAGTTAATTGTGATTTGATCTGTTTTATGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGATCTATGAATCGTAGATACTGAAAAACCCCGCAAGTTCACTTCAACTGTGCATCGTGCACCATCTCAATTTCTTTCATTTATACATCGTTTTGCCTTCTTTTATGTAACTATACTCCTCTAAGTTTCAATCTTGGCCATGTAACCTCTGATC [0057]經(jīng)比對(網(wǎng)址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知該基因 I 為富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0058]5、利用多重逆境檢驗富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。
[0059]根據(jù)測序結(jié)果，選取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發(fā)生突變的擬南芥突變體(即不再編碼出富含甘氨酸蛋白的擬南芥植株)。將擬南芥野生型(品種哥倫比亞)和突變體種子用75%酒精消毒lmin，無菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播種于MS固體培養(yǎng)基。14天后，選取生長正常的植株，轉(zhuǎn)移至分別含7.5mmol/L H202、350umol/L ZnCl2,250mmol/L CdCl2,200mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)條件為22°C、培養(yǎng)7天)及在高溫37°C、低溫15 °C、正常溫度22 °C條件下置于MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(培養(yǎng)7天)，生長情況如圖5所示。從圖5可知，該基因發(fā)生突變的擬南芥突變體，在H202、NaCl、CdCl2、ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C等逆境條件下，相對于野生型，均表現(xiàn)出敏感，即擬南芥野生型有基因AT4G21620的正常功能，生長良好，擬南芥突變體喪失該基因功能，生長狀態(tài)較差。
[0060]綜上所述，說明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高擬南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C的逆境條件下的抗逆性，在擬南芥多重逆境抗性方面具有重要作用。
[0061]實施例2
[0062]1、多重逆境敏感性酵母菌株的獲得
[0063]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫中各種菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮YPD培養(yǎng)基，至分裂2代。收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(OD6tltl=0.4-0.6)，10倍梯度稀釋5次，置于分別含有0.5mmol/L H202、20mmol/LZnCl2,50mmol/L CdCl2、150mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 30°C、培養(yǎng) 48h，并同時，在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置于將不含上述成分的YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。
[0064]觀察酵母野生型和各種酵母突變體在不同逆境條件下的生長情況，篩選出對上述6種逆境條件均敏感的酵母突變體，可以看出突變體AHogl對各種逆境條件均敏感，適合作為文庫篩選的宿主菌株。
[0065]2、擬南芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母突變體
[0066]2.1取適量過夜培養(yǎng)于YPD液體培養(yǎng)基的突變體Λ Hogl菌液，接種于300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基，至OD600=0.2~0.3，30°C恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6。
[0067]2.2室溫離心5000rpm、5min，棄上清，加入25_50ml無菌水重懸洗滌酵母沉淀細(xì)胞，離心棄上清，重復(fù)洗滌一次，沉淀用1.5ml TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞。
[0068]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入以下成分:cDNA文庫質(zhì)粒lOOug，和10mg/ml的鮭魚精DNA200ul，振蕩混勻。
[0069]2.4 加入 6ml PEG/LiAc,劇烈振蕩，30°C恒溫，200rpm 振蕩培養(yǎng) 30min。
[0070]2.5加入700ul DMSO,緩緩倒置混勻(不能振蕩)，42°C水浴熱休克5min，迅速插入冰浴冷卻l-2min。
[0071]2.6室溫離心2500rpm、5min,盡量棄盡上清，以IOml無菌水重懸沉淀細(xì)胞,涂布于含0.5mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培養(yǎng)3_5天。從生長結(jié)果看出平板上長出單克隆數(shù)量多，菌落密度大，說明轉(zhuǎn)化效率高，滿足植物cDNA文庫篩選要求。
[0072]挑取生長出的單克隆，培養(yǎng)于含0.5mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基(不含亮氨酸)上。
[0073]3、利用多重逆境檢驗所得到的轉(zhuǎn)化子的抗逆性
[0074]將上述所得到的酵母轉(zhuǎn)化子和已經(jīng)轉(zhuǎn)化了空載體pGADGH的空載體酵母轉(zhuǎn)化子，接種于營養(yǎng)缺陷型SD液體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮營養(yǎng)缺陷型SD液體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度稀釋 3 次，置于含 0.25mmol/L H2O2,5.0mmol/L ZnCl2,20mmol/L CdCl2'100mmol/LNaCl的營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)中，培養(yǎng)條件為30°C、培養(yǎng)48h，并同時在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置于將不含上述成分的SD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。每個轉(zhuǎn)入文庫質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子做3個重復(fù)，其中轉(zhuǎn)化了基因I的酵母轉(zhuǎn)化子對上述各種逆境處理均表現(xiàn)出抗性。
[0075]4、對在多重逆境條件有抗性的質(zhì)粒，進(jìn)行測序
[0076]提取上述步驟3中在各種逆境條件下都生長良好的含基因I的酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO:1所示。
[0077]經(jīng)比對(網(wǎng)址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知該基因 I 為富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0078]5、利用多重逆境檢驗富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。[0079]根據(jù)測序結(jié)果，選取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發(fā)生突變的擬南芥突變體(即不再編碼出富含甘氨酸蛋白的擬南芥植株)。將擬南芥野生型品種哥倫比亞和突變體種子用75%酒精消毒lmin，無菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播種于MS固體培養(yǎng)基。14天后,選取生長正常的植株,轉(zhuǎn)移至分別含1.0mmol/L H202> 100umol/L ZnCl2、50mmol/LCdCl2,50mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)條件為22°C、培養(yǎng)7天)及在高溫37°C、低溫15°C、正常溫度22°C條件下置于MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(培養(yǎng)7天)。從其生長情況可知，該基因發(fā)生突變的擬南芥突變體，在H202、NaCl, CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C等逆境條件下，相對于野生型，均表現(xiàn)出敏感，即野生型有基因AT4G21620的正常功能，生長良好，突變體喪失該基因功能，生長狀態(tài)較差。
[0080]綜上所述，說明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高擬南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C的逆境條件下的抗逆性，在擬南芥多重逆境抗性方面具有重要作用。
[0081]實施例3
[0082]1、多重逆境敏感性酵母菌株的獲得
[0083]將酵母野生型(Saccharomyces cerevisiae)和酵母突變體庫中各種菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮YPD培養(yǎng)基，至分裂2代。收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(0D600=0.4-0.6)，10倍梯度稀釋5次，置于分別含有2.0mmol/L H202、80mmol/LZnCl2,250mmol/L CdCl2,350mmol/L NaCl 的 YPD 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 30°C、培養(yǎng) 48h，并同時，在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置于將不含上述成分的YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。
[0084]觀察酵母野生型和各種酵母突變體在不同逆境條件下的生長情況，篩選出對上述6種逆境條件均敏感的酵母突變體，可以看出突變體AHogl對各種逆境條件均敏感，適合作為文庫篩選的宿主菌株。
`[0085]2、擬南芥cDNA文庫轉(zhuǎn)化酵母突變體
[0086]2.1取適量過夜培養(yǎng)于YPD液體培養(yǎng)基的突變體Λ Hogl菌液，接種于300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基，至OD600=0.2~0.3，30°C恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6。
[0087]2.2室溫離心5000rpm、5min，棄上清，加入25_50ml無菌水重懸洗滌酵母沉淀細(xì)胞，離心棄上清，重復(fù)洗滌一次，沉淀用1.5ml TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞。
[0088]2.3取Iml用1.5ml TE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入以下成分:cDNA文庫質(zhì)粒lOOug，和10mg/ml的鮭魚精DNA200ul，振蕩混勻。
[0089]2.4 加入 6ml PEG/LiAc,劇烈振蕩，30°C恒溫，200rpm 振蕩培養(yǎng) 30min。
[0090]2.5加入700ul DMSO,緩緩倒置混勻(不能振蕩)，42°C水浴熱休克5min，迅速插入冰浴冷卻l-2min。
[0091]2.6室溫離心2500rpm、5min,盡量棄盡上清，以IOml無菌水重懸沉淀細(xì)胞,涂布于含0.5mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基(不含亮氨酸)上，30°C倒置培養(yǎng)3_5天。從生長結(jié)果可以看出平板上長出單克隆數(shù)量多，菌落密度大，說明轉(zhuǎn)化效率高，滿足植物cDNA文庫篩選要求。
[0092]挑取生長出的單克隆，培養(yǎng)于含0.5mmol/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基(不含亮氨酸)上。[0093]3、利用多重逆境檢驗所得到的轉(zhuǎn)化子的抗逆性[0094]將上述所得到的酵母轉(zhuǎn)化子和已經(jīng)轉(zhuǎn)化了空載體pGADGH的空載體酵母轉(zhuǎn)化子，接種于營養(yǎng)缺陷型SD液體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)中，30°C過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮營養(yǎng)缺陷型SD液體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)，至分裂2代，收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(0D_=0.4~0.6)，10 倍梯度稀釋 3 次，置于含 1.0mmol/L H202、15mmol/L ZnCl2、100mmol/L CdCl2,350mmol/LNaCl的營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基(不含亮氨酸)中，培養(yǎng)條件為30°C、培養(yǎng)48h，并同時在高溫37°C、低溫15°C和正常條件(30°C)下置于將不含上述成分的SD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。每個轉(zhuǎn)入文庫質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子做3個重復(fù)，其中轉(zhuǎn)化了基因I的酵母轉(zhuǎn)化子對上述各種逆境處理均表現(xiàn)出抗性。
[0095]4、對在多重逆境條件有抗性的質(zhì)粒，進(jìn)行測序
[0096]提取上述步驟3中在各種逆境條件下都生長良好的含基因I的酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO:1所示。
[0097]經(jīng)比對(網(wǎng)址http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)得知該基因 I 為富含甘氨酸蛋白基因(AT4G21620)。
[0098]5、利用多重逆境檢驗富含甘氨酸蛋白基因的抗逆性。
[0099]根據(jù)測序結(jié)果，選取富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620發(fā)生突變的擬南芥突變體(即不再編碼出富含甘氨酸蛋白的擬南芥植株)。將擬南芥野生型品種哥倫比亞和突變體種子用75%酒精消毒lmin，無菌水洗3次，再用5%漂白粉消毒15min，播種于MS固體培養(yǎng)基。14天后,選取生長正常的植株,轉(zhuǎn)移至分別含15mmol/L H202、450umol/L ZnCl2、350mmol/LCdCl2,300mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)條件為22°C、培養(yǎng)7天)及在高溫37°C、低溫15°C、正常溫度22 °C條件下置于MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(培養(yǎng)7天)。從其生長情況可知，該基因發(fā)生突變的擬南芥突變體，在11202、似(:1、0(1(:12、211(:12、高溫371:、低溫15°C等逆境條件下，相對于擬南芥野生型，均表現(xiàn)出敏感，即擬南芥野生型有基因AT4G21620的正常功能，生長良好，突變體喪失該基因功能，生長狀態(tài)較差。
[0100]綜上所述，說明富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620可提高擬南芥在!1202、NaCl,CdCl2, ZnCl2、高溫37°C、低溫15°C的逆境條件下的抗逆性，在擬南芥多重逆境抗性方面具
有重要作用。
【權(quán)利要求】
1.一種利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，包括如下步驟: 步驟1)酵母目標(biāo)突變體的獲得 將酵母野生型和各種酵母突變體，接種于Yro液體培養(yǎng)基中，30°c過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入新鮮YPD液體培養(yǎng)基，至分裂2代。收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(0D_=0.4~0.6)，10倍梯度稀釋 5 次，分別置于含 0.5-2.0mmoI/L H202、20-80mmol/L ZnCl2、50-250mmol/LCdCl2、150-350mmol/L NaCl的YPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，及分別在37°C、15°C、30°C條件下置于YPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；從中篩選出對上述逆境條件均敏感的酵母菌株突變體AHogl，作為文庫篩選的宿主菌株； 步驟2)多重逆境篩選 用植物cDNA文庫轉(zhuǎn)化步驟I)中篩選出的突變體菌株AHogl得到酵母轉(zhuǎn)化子，并培養(yǎng)于含0.25-1.0mmoI/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基上；挑取生長出的單克隆，培養(yǎng)于含0.25-1.0mmoI/L H2O2的營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基上；將生長狀態(tài)良好的酵母轉(zhuǎn)化子分別培養(yǎng)于含 0.25-1.0mmol/L H202、5-15mmol/L ZnCl2,20-100mmol/L CdCl2、100-350mmol/L NaCl的營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基上，及分別在37°C、15°C、30°C條件下置于營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 步驟3)候選基因測序 提取步驟2)中在上述各種逆境條件下都生長良好的酵母轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行測序，所得植物基因進(jìn)行抗多重逆性檢驗； 步驟4)抗多重逆性檢驗 選取缺失步驟3)中所得多重逆境抗性基因的植物突變體，與植物野生型同時培養(yǎng)于含1.0-15mmol/L H202、100_450umol/L ZnCl2、50-350mmol/L CdCl2、50-300mmol/L NaClJAMS固體培養(yǎng)基及在37°C、15°C、22°C條件下置于MS固體培養(yǎng)基；如果該植物突變體的生長狀態(tài)差于植物野生型，則步驟3)測序得到的植物基因即為該植物的多重逆境抗性基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述植物為擬南芥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述擬南芥中多重逆境抗性基因為富含甘氨酸蛋白基因AT4G21620。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，所述多重逆境抗性基因是指植物中與抗H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl及抗高溫、低溫環(huán)境相關(guān)的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步驟I)中，YPD固體培養(yǎng)基中加入的H2O2、ZnCl2、CdCl2、NaCl濃度分別為1.0-1.5mmol/L、30_60mmol/L、100-250mmol/L、200-350mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步驟2)中所述營養(yǎng)缺陷型SD培養(yǎng)基的缺失營養(yǎng)成分為亮氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步驟2)中，所述營養(yǎng)缺陷型SD固體培養(yǎng)基加入的H202、ZnCl2, CdCl2, NaCl濃度分別為0.25-0.75mmol/L、7.5-15mmol/L、40_lOOmmol/L、15Q-300mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用酵母快速篩選植物多重逆境抗性基因的方法，其特征在于，步驟4)中，所述MS固體培養(yǎng)基中加入的H202、ZnCl2.CdCl2.NaCl的濃度分別為2.0-10mmol/L、200-400umol/L、100_300mmol/L、100_300mmol/L。
【文檔編號】C12N15/81GK103509876SQ201310509029
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】儲昭慶, 李鵬 申請人:上海辰山植物園