焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的引物和方法，正向引物序列為SEQIDNO1；反向引物序列為SEQIDNO2；測(cè)序引物序列為SEQIDNO3；方法包括下列步驟：首先依據(jù)花生Arah6基因設(shè)計(jì)特異性PCR引物和焦磷酸測(cè)序引物；再提取待測(cè)樣品的DNA，然后分別以Arah6基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，若引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為239bp，則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板，再進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，最后根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果來判定樣品中是否含有過敏原成分。本發(fā)明所建立的花生過敏原基因Arah6焦磷酸測(cè)序方法能夠快速對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序，具有較高的特異性；該方法具有準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定性好、靈敏、特異性高的特點(diǎn)。
【專利說明】焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的引物和方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明屬于食源性過敏原的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種采用焦磷酸測(cè)序(.Pyrosequencing)技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的引物和方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
過敏性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的3大疾病之一，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題，世界各國(guó)過敏反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率高達(dá)10%~30%，此類型疾病包括食物過敏、過敏性哮喘和過敏性鼻炎等，是臨床上的常見病、多發(fā)病。世界糧農(nóng)組織(FAO) 1995年報(bào)告，90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼海產(chǎn)品、花生、大豆、堅(jiān)果類和小麥引起。食物中能使機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)抗原分子稱為食物過敏原，它們大多為蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，花生是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、深受人們喜愛的常見食物，花生過敏占食物過敏的10%~47%，因此花生蛋白是重要的食物過敏原?；ㄉ澄镞^敏可引起過敏性腸炎、過敏性皮炎等過敏性疾病，嚴(yán)重的甚至?xí)l(fā)生過敏休克和過敏性死亡。國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道食用花生食物引起過敏性死亡的病例。鑒于目前尚無根治這類疾病的方法，為此，美國(guó)及歐盟等國(guó)家要求在食品標(biāo)簽上加注花生等主要過敏原成分標(biāo)簽以防止過敏患者誤食。同時(shí)，美國(guó)及歐盟等國(guó)家開始對(duì)部分進(jìn)口食品進(jìn)行花生過敏原抽檢，而我國(guó)食品出口企業(yè)常因食品過敏原標(biāo)注不正確而遭遇退貨。因此，有必要開發(fā)一種實(shí)用、靈敏、特異的花生過敏原成分檢測(cè)方法。
[0003]花生是“90年代中國(guó)食物結(jié)構(gòu)改革與發(fā)展綱要”中提出的重點(diǎn)開發(fā)利用植物蛋白之一。隨著國(guó)民飲食結(jié)構(gòu)的變化，花生消費(fèi)將不斷增加，花生過敏發(fā)病率可能會(huì)呈上升的趨勢(shì)。重組過敏原是當(dāng)今乃至未來變態(tài)反應(yīng)學(xué)的重要研究方向。目前國(guó)內(nèi)未見利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行花生過敏原成分鑒定的研究報(bào)道，本發(fā)明首次建立了基于花生Ara h 6基因的過敏原成分的焦磷酸測(cè)序快速檢測(cè)方法，將為我國(guó)進(jìn)出口花生及其制品的過敏原快速檢測(cè)提供很好的技術(shù)支撐和食品安全保障。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種花生過敏原成分的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)確證方法，以克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的主要原理是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，通過測(cè)序引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增單鏈脫氧核糖核酸模板雜交，與脫氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和底物(APS)、熒光素孵育，逐一加入四種三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs):三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸dCTP、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸dGTP，如與模板配對(duì)，此三磷酸堿基脫氧核苷酸與引物的末端形成共價(jià)鍵，釋放焦磷酸基團(tuán)(PPi);腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情況下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素轉(zhuǎn)化，氧化熒光素發(fā)出與腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可見光信號(hào)；光信號(hào)由電荷耦合器件(CCD)收集并由軟件轉(zhuǎn)化為峰；每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未摻入的三磷酸堿基脫氧核苷酸由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系，利用光信號(hào)轉(zhuǎn)化得到的峰圖，對(duì)樣品中的目標(biāo)基因進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。
[0006]一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的方法，包括下列步驟:
首先依據(jù)花生Ara h 6基因設(shè)計(jì)特異性引物及焦磷酸測(cè)序引物；再提取待測(cè)樣品的脫氧核糖核酸(DNA)，然后分別以Ara h 6基因的特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增；用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，若引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為239 bp，則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板，再進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，最后根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果來判定樣品中是否含有花生過敏原。
[0007]設(shè)計(jì)的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的引物:
正向引物序列為 SEQ ID NO 1:5’ - AAGCTGCGAGAGGCAGGTAGA -3’。
[0008]反向引物序列為SEQ ID NO 2:5’ -TTTGCCTGTCCTGCAACCTAT-3’ ； 5’ 進(jìn)行生物素
[0009]測(cè)序引物序列為SEQ ID NO 3:5’ - GCTCATCGCAGCACC -3，。
[0010]花生過敏原基因Ara h 6的目標(biāo)序列為SEQ ID NO 4:TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT ;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為239 bp ；
具體包括下列步驟:
(一)DNA模板的制備
樣品處理:取花生等試驗(yàn)材料，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勾備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品于50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩沖液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜后，13 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒后用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清到新的2 mL印pendorf離心管中后加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存?zhèn)溆茫?br> (二)PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標(biāo)記上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余擴(kuò)增產(chǎn)物用于焦磷酸測(cè)序；
(三)焦磷酸測(cè)序
將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關(guān)閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測(cè)序板中，該板中預(yù)先加入測(cè)序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;將96孔測(cè)序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，設(shè)定程序，堿基的加入為ATCG 6-10個(gè)重復(fù)，根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定，由儀器程序自動(dòng)給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行反應(yīng)。
[0011]本發(fā)明所建立的花生過敏原基因Ara h 6的焦磷酸檢測(cè)方法能夠快速對(duì)目的基因進(jìn)行測(cè)序，尚未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。具有較高的特異性；該方法具有快速、穩(wěn)定性好、靈敏、特異高的特點(diǎn)。焦磷酸測(cè)序技術(shù)作為一種短片段測(cè)序方法，操作簡(jiǎn)單方便，可程序化，能夠很好地保證測(cè)序結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，另外該方法檢測(cè)速度快，40 min內(nèi)即可準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的測(cè)定出96個(gè)樣品目的片段的基因序列，可滿足快速檢測(cè)的需求，具有不可替代的作用。
[0012]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明實(shí)施例1 PCR擴(kuò)增引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中，M:DL 500 DNAMarker ;1_10分別為花生樣品；11_17分別為綠豆、赤豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、大豆。
[0013]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1特異性實(shí)驗(yàn)中部分焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖。
[0014]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中，M:DL 500 DNA Marker ；1為利群超市購(gòu)買的花生醬樣品。
[0015]圖4為本發(fā)明實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)結(jié)果焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖。
[0016]圖5為本發(fā)明實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中，M:DL 500 DNA Marker ；1為利群超市購(gòu)買的餅干樣品。
[0017]圖6為本發(fā)明實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)結(jié)果焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖。
[0018]【具體實(shí)施方式】:
下面通過具體實(shí)施例并結(jié)合附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0019]實(shí)施例1:PCR擴(kuò)增引物特異性實(shí)驗(yàn)
(I)樣品材料:花生樣品為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)用樣品；從青島市撫順路批發(fā)市場(chǎng)購(gòu)買綠豆、赤豆、豌豆、蠶豆、蕓豆、扁豆、大豆樣品。
[0020](2) DNA模板的制備
樣品處理:取100g花生等試驗(yàn)材料，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品于50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩沖液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜后，13 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒后用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清到新的2 mL印pendorf離心管中后加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存?zhèn)溆茫?br> (3)PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標(biāo)記上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余擴(kuò)增產(chǎn)物用于焦磷酸測(cè)序；
擴(kuò)增結(jié)果見圖1，結(jié)果表明只有花生樣品能夠有效擴(kuò)增出目的片斷，其余樣品無特異性片斷出現(xiàn)。
[0021](4)焦磷酸測(cè)序 將花生等的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入S印harose beads 3 yL和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關(guān)閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測(cè)序板中，該板中預(yù)先加入測(cè)序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測(cè)序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，設(shè)定程序，堿基的加入為ATCG 6-10個(gè)重復(fù)，根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定，由儀器程序自動(dòng)給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行反應(yīng)。
[0022]焦磷酸測(cè)序結(jié)果見圖2。
[0023]測(cè)序結(jié)果為TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，與預(yù)期一致能夠有效測(cè)出目標(biāo)序列，并鑒定出含有花生過敏原成分。
[0024]實(shí)施例2:檢測(cè)某一花生樣品中是否含有花生過敏原成分
(I)樣品材料:如海利群超市購(gòu)買的花生醫(yī)樣品。
[0025](2) DNA模板的制備
樣品處理:取100 g花生醬樣品，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分液氮研磨混勻備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品于50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩沖液和20 UL蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜后，13 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒后用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清到新的2 mL印pendorf離心管中后加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存?zhèn)溆茫?br> (3) PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標(biāo)記上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余擴(kuò)增產(chǎn)物用于焦磷酸測(cè)序。
[0026]擴(kuò)增結(jié)果見圖3，結(jié)果表明該方法能夠有效擴(kuò)增出花生醬樣品的特異性片斷。[0027](4)焦磷酸測(cè)序
將花生醬樣品的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入Sepharose beads3 μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~IOs,關(guān)閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測(cè)序板中，該板中預(yù)先加入測(cè)序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測(cè)序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，設(shè)定程序，堿基的加入為ATCG 6-10個(gè)重復(fù)，根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定，由儀器程序自動(dòng)給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行反應(yīng)。
[0028]焦磷酸測(cè)序結(jié)果見圖4。
[0029]測(cè)序結(jié)果為TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，能準(zhǔn)確鑒定出此樣品含有花生過敏原成分。
[0030]實(shí)施例3:超市購(gòu)買樣品檢驗(yàn)是否含有花生過敏原成分
(I)樣品材料:從前海利群超市購(gòu)買的餅干。
[0031](2) DNA模板的制備
樣品處理:取50 g樣品，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分液氮研磨混勻備用; DNA模板的提取:取200 mg樣品于50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩沖液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜后，13 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒后用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清到新的2 mL印pendorf離心管中后加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存?zhèn)溆茫?br> (3)PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標(biāo)記上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù):94 °C預(yù)變性5 min, 94°C變性20 S，58 °C退火30 s，72°C延伸20 S，50個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應(yīng)產(chǎn)物5 UL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余擴(kuò)增產(chǎn)物用于焦磷酸測(cè)序。
[0032]擴(kuò)增結(jié)果見圖5，結(jié)果表明餅干樣品中能夠有效擴(kuò)增出特異性片斷。
[0033](4)焦磷酸測(cè)序
將餅干樣品的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入Sepharose beads 3μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關(guān)閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測(cè)序板中，該板中預(yù)先加入測(cè)序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測(cè)序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，設(shè)定程序，堿基的加入為ATCG 6-10個(gè)重復(fù)，根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定，由儀器程序自動(dòng)給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行反應(yīng)。
[0034]焦磷酸測(cè)序結(jié)果見圖6。
[0035]測(cè)序結(jié)果為TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，表明該餅干樣品中含有花生過敏原成分。
【權(quán)利要求】
1.一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的引物，其特征在于: 正向引物序列為SEQ ID NO I ； 反向引物序列為SEQ ID NO 2 ； 測(cè)序引物序列為SEQ ID NO 3。
2.一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)花生過敏原成分的方法，其特征在于，包括下列步驟: 首先依據(jù)花生Ara h 6基因設(shè)計(jì)特異性引物及焦磷酸測(cè)序引物；再提取待測(cè)樣品的脫氧核糖核酸(DNA)，然后分別以花生Ara h 6基因的特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增；用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，若引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為239 bp，則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板，再進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，最后根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果來判定樣品中是否含有花生過敏原成分；花生Ara h 6基因PCR及測(cè)序引物為: 正向引物序列為SEQ ID NO I ； 反向引物序列為SEQ ID NO 2 ;5’進(jìn)行生物素標(biāo)記； 測(cè)序引物序列為SEQ ID NO 3 ； 花生Ara h 6基因的目標(biāo)序列為SEQ ID NO 4 ;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為239 bp ； 具體包括下列步驟: (一)DNA模板的制備 樣品處理:取花生等試驗(yàn)材料，用滅菌潔凈研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勾備用； DNA模板的提取:取200 mg樣品于50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩沖液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜后，13 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒后用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫靜置.60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的2 mL印pendorf離心管中后加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存?zhèn)溆茫? (二)PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標(biāo)記上游引物和下游引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，其余擴(kuò)增產(chǎn)物用于焦磷酸測(cè)序； (三)焦磷酸測(cè)序 將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，在產(chǎn)物中分別加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ； 打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關(guān)閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測(cè)序板中，該板中預(yù)先加入測(cè)序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;將96孔測(cè)序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，設(shè)定程序，堿基的加入為ATCG 6-10個(gè)重復(fù)，根據(jù)程序給定劑量(該劑量根據(jù)樣本數(shù)的多少而定，由儀器程序自動(dòng)給出)，在試劑艙中加入酶混 合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測(cè)序板放入機(jī)箱中進(jìn)行反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103540671SQ201310508383
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】房保海, 金瑩, 于仕超, 孫濤, 賈俊濤, 姜英輝, 譚樂義 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心