一種制備磷脂酰絲氨酸的方法
【專利摘要】一種制備磷脂酰絲氨酸的方法，包括以下步驟：將磷脂酰膽堿或含有磷脂酰膽堿的天然磷脂與吐溫-80、L-絲氨酸、氯化鈣、緩沖溶液、磷脂酶D混合，在35-45℃攪拌反應(yīng)8-10h；反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)粗品析出并上浮，離心分離水相和反應(yīng)粗品，將分離得到的反應(yīng)粗品用水洗滌，并離心過(guò)濾；離心過(guò)濾后的反應(yīng)粗品加入無(wú)水乙醇浸泡，攪拌，再離心過(guò)濾；對(duì)離心過(guò)濾后產(chǎn)物真空干燥，即得磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品。本發(fā)明的目的是提供一種新的制備磷脂酰絲氨酸的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的副產(chǎn)物磷脂酸較多，轉(zhuǎn)化率不理想，生產(chǎn)成本高的問(wèn)題。
【專利說(shuō)明】一種制備磷脂酰絲氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備穩(wěn)定的粉末磷脂酰絲氨酸的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]磷脂是磷酸甘油脂的簡(jiǎn)稱，對(duì)生物膜的生物活性和機(jī)體的正常代謝有重要的調(diào)節(jié)功能。通常所說(shuō)的磷脂是指含有磷元素的脂肪物質(zhì)，它是多種磷脂的混合物，成分主要為磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)等。
[0003]磷脂酰絲氨酸是一種唯一能夠調(diào)控細(xì)胞膜關(guān)鍵蛋白功能的磷脂，對(duì)許多細(xì)胞代謝過(guò)程有重要的調(diào)節(jié)作用，其主要功能是可提高腦細(xì)胞活力，對(duì)治療腦萎縮、預(yù)防老年癡呆癥，改善老年人的大腦功能有很好的療效；同時(shí)修復(fù)大腦損傷、治療兒童多動(dòng)癥具有非常顯著的作用；另外可以促進(jìn)腦疲勞的恢復(fù)、平衡情緒、緩解抑郁也有一定的療效。
[0004]磷脂酰絲氨酸的制備方法主要有提取法和酶轉(zhuǎn)化法。其中提取法主要是從植物細(xì)胞、動(dòng)物的卵磷脂中提取PS，植物中的PS含量較少，所以提取法以動(dòng)物的卵磷脂中提取為主，從動(dòng)物中提取主要是動(dòng)物的大腦及內(nèi)臟，目前國(guó)外大部分以牛、羊、兔、馬、驢等家禽的動(dòng)物腦為原料來(lái)提取PS。近年來(lái)，由于瘋牛病的等動(dòng)物疾病的原因，利用動(dòng)物細(xì)胞提取PS的方法，其提取的產(chǎn)品的安全性收到人們的懷疑，現(xiàn)在已處于淘汰邊緣。
[0005]酶轉(zhuǎn)化法主要是以天然的卵磷脂為基質(zhì)，加入絲氨酸，在磷脂酶D的作用下，生成磷脂酰絲氨酸?？茖W(xué)文獻(xiàn)和專利報(bào)道了將磷脂酰膽堿通過(guò)磷脂酶D催化為磷脂酰絲氨酸的方法，這些方法大部分是通過(guò)水/有機(jī)溶劑的兩相體系，但兩相體系有機(jī)溶劑使用量大，難以除去，同時(shí)增加了反應(yīng)成本。有研究者開始研究單一水相反應(yīng)，專利EP1310563描述了在不使用洗滌劑和/或鈣鹽的水相中制備PS的方法，該方法需要在水中將包括磷脂，羥基接受體和磷脂酶的起始混合物勻漿。專利JP2002051794和DE102004002053公布的在純水體系中制備PS的方法也要借助特殊的均質(zhì)化設(shè)備。專利CN101230365采用單一水相，但水相用量大，最大用到了反應(yīng)基質(zhì)的10倍，其L-絲氨酸的用量為反應(yīng)基質(zhì)的4-6倍量，同時(shí)在反應(yīng)結(jié)束后用到了有機(jī)溶劑萃取，引入了有機(jī)溶劑的同時(shí)也增加了反應(yīng)成本。專利CN102676600描述了在均相介質(zhì)Y-戊內(nèi)酯、2-甲基四氫呋喃或其混合物中進(jìn)行反應(yīng)，增加了生產(chǎn)成本。而在專利CN101230365中反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，反應(yīng)溫度高，造成反應(yīng)產(chǎn)物中PA含量高，PS轉(zhuǎn)化率低，反應(yīng)產(chǎn)物品質(zhì)差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種新的制備磷脂酰絲氨酸的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的副產(chǎn)物磷脂酸較多，轉(zhuǎn)化率不理想，生產(chǎn)成本高的問(wèn)題。
[0007]本發(fā)明采用如下解決方案:
[0008]一種制備磷脂酰絲氨酸的方法，主要包括以下步驟:
[0009](I)將磷脂酰膽堿或含有磷脂酰膽堿的天然磷脂與吐溫-80、L-絲氨酸、氯化鈣、緩沖溶液、磷脂酶D混合，在35-45°C攪拌反應(yīng)8-10h ；
[0010]其中，吐溫-80為天然磷脂質(zhì)量的0.1-ο.5%，L-絲氨酸為天然磷脂質(zhì)量的2-3倍，緩沖溶液的PH值為5.1-5.5，緩沖溶液的加入量為天然磷脂質(zhì)量的5-6倍，磷脂酶D的加入量為每g天然磷脂20-50U，氯化鈣與緩沖溶液的比例為1.5-1.8g/100mL ；
[0011](2)反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)粗品析出并上浮，離心分離水相和反應(yīng)粗品，將分離得到的反應(yīng)粗品用水洗滌，并離心過(guò)濾；
[0012](3)離心過(guò)濾后的反應(yīng)粗品加入無(wú)水乙醇浸泡，攪拌，再離心過(guò)濾；
[0013](4)對(duì)離心過(guò)濾后產(chǎn)物真空干燥，即得磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品。
[0014]基于上述基本方案，本發(fā)明還作如下優(yōu)化限定和改進(jìn):
[0015] 上述緩沖溶液的配置選用醋酸-醋酸鈉體系或磷酸氫二鈉-磷酸體系。
[0016]上述步驟(3)中無(wú)水乙醇加入量為此時(shí)反應(yīng)粗品質(zhì)量的2-4倍，無(wú)水乙醇浸泡2-4h后攪拌l_2h，再離心過(guò)濾。
[0017]上述步驟(2)中水洗滌倍量為此時(shí)反應(yīng)粗品的0.5-1倍。
[0018]上述步驟(4)中真空干燥的參數(shù)為溫度50±2°C，真空度0.08±0.005Mpa。
[0019]本發(fā)明所述的天然磷脂來(lái)源廣泛，優(yōu)選大豆磷脂、葵花籽磷脂、蛋黃磷脂。其中磷脂酰膽堿含量在10-95%均可發(fā)生反應(yīng)，更優(yōu)選經(jīng)純化后的高含量磷脂酰膽堿。
[0020]本發(fā)明所述的磷脂酶D可來(lái)源于植物和微生物。植物來(lái)源包括白菜、菠菜、甘藍(lán)、胡蘿卜等，微生物來(lái)源包括鏈霉菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌等，優(yōu)選酶活較高的鏈霉菌產(chǎn)酶。[0021 ] 本發(fā)明的有益效果和特點(diǎn):
[0022]本發(fā)明利用吐溫-80的乳化作用使反應(yīng)基質(zhì)形成膠狀，無(wú)需特殊的均質(zhì)化設(shè)備，同時(shí)縮短了反應(yīng)時(shí)間增加了轉(zhuǎn)化率。
[0023]在整個(gè)工藝過(guò)程除乙醇外無(wú)其它有機(jī)溶劑帶入，保證了產(chǎn)品的綠色健康。經(jīng)試驗(yàn)證明反應(yīng)產(chǎn)物用無(wú)水乙醇浸泡可破壞掉帶入產(chǎn)品中的磷脂酶D活性，使產(chǎn)品穩(wěn)定性更好，同時(shí)無(wú)水乙醇可溶解掉反應(yīng)產(chǎn)物中的油溶性成分，使最終產(chǎn)品的流動(dòng)性，味道，色澤更好，可以更好地用來(lái)制備含磷脂酰絲氨酸的膠囊或其他保健食品。
[0024]整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，周期短、投資小，成本低。反應(yīng)產(chǎn)物收率高，純度聞，品質(zhì)好。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]在反應(yīng)罐中加入20g磷脂酰膽堿含量為50.98%的大豆磷脂，L-絲氨酸40g，吐溫-800.02g,氯化鈣1.6g，緩沖溶液選用醋酸鈉-醋酸體系，PH值5.5，緩沖溶液加入量IOOmL,磷脂酶D酶活為5000U/g，加入量為l00mg。攪拌并保持反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間8h,檢測(cè)轉(zhuǎn)化率，離心過(guò)濾，離心后濾渣加入水20mL洗滌三次，并離心過(guò)濾的反應(yīng)粗品，反應(yīng)粗品加入無(wú)水乙醇100mL,浸泡2h后攪拌lh，離心過(guò)濾，真空干燥得到17.28g PS含量為56.48%的粉末磷脂。
[0028]實(shí)施例2
[0029]在反應(yīng)罐中加入50g磷脂酰膽堿含量為80.68%的葵花籽磷脂，L-絲氨酸150，吐溫-800.2g，氯化鈣6.0g,緩沖溶液選用醋酸鈉-醋酸體系，PH值5.3，緩沖溶液加入量400mL，磷脂酶D酶活為5000U/g，加入量為400mg。攪拌并保持反應(yīng)溫度40°C，反應(yīng)時(shí)間IOh,檢測(cè)轉(zhuǎn)化率，離心過(guò)濾，離心后濾渣加入水50mL洗滌三次，并離心過(guò)濾的反應(yīng)粗品，反應(yīng)粗品加入無(wú)水乙醇400mL，浸泡2h后攪拌lh，離心過(guò)濾，真空干燥得到44.88g PS含量為87.75%的粉末磷脂。
[0030]實(shí)施例3
[0031]在反應(yīng)罐中加入50g磷脂酰膽堿含量為21.62%的大豆磷脂，L-絲氨酸100g，吐溫-800.25g，氯化鈣6.0g,緩沖溶液選用磷酸氫二鈉-磷酸體系，PH值5.1，緩沖溶液加入量300mL，磷脂酶D酶活為5000U/g，加入量為220mg。攪拌并保持反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間IOh,檢測(cè)轉(zhuǎn)化率，離心過(guò)濾，離心后濾渣加入水50mL洗滌三次，并離心過(guò)濾的反應(yīng)粗品，反應(yīng)粗品加入無(wú)水乙醇300mL，浸泡a后攪拌lh，離心過(guò)濾，真空干燥得到33.89g PS含量為30.27%的粉末磷脂。
[0032]實(shí)施例4
[0033]在反應(yīng)罐中加入50g磷脂酰膽堿含量為30.89%的蛋黃磷脂，L-絲氨酸120g，吐溫-800.15g，氯化鈣8.0,緩沖溶液選用磷酸氫二鈉-磷酸體系，PH值5.3，緩沖溶液加入量500mL，磷脂酶D酶活為5000U/g，加入量為400mg。攪拌并保持反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間8h,檢測(cè)轉(zhuǎn)化率，離心過(guò)濾，離心后濾渣加入水50mL洗滌三次，并離心過(guò)濾的反應(yīng)粗品，反應(yīng)粗品加入無(wú)水乙醇400mL，浸泡a后攪拌lh，離心過(guò)濾，真空干燥得到41.27g PS含量為35.78%的粉末磷脂。
[0034]各實(shí)施例中反應(yīng)產(chǎn)物成分含量以及轉(zhuǎn)化率見下表1。
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種制備磷脂酰絲氨酸的方法，主要包括以下步驟: (1)將磷脂酰膽堿或含有磷脂酰膽堿的天然磷脂與吐溫-80、L-絲氨酸、氯化鈣、緩沖溶液、磷脂酶D混合，在35-45°C攪拌反應(yīng)8-10h ； 其中，吐溫-80為天然磷脂質(zhì)量的0.1-0.5%，L-絲氨酸為天然磷脂質(zhì)量的2-3倍，緩沖溶液的PH值為5.1-5.5，緩沖溶液的加入量為天然磷脂質(zhì)量的5-6倍，磷脂酶D的加入量為每g天然磷脂20-50U，氯化鈣與緩沖溶液的比例為1.5-1.8g/100mL ； (2)反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)粗品析出并上浮，離心分離水相和反應(yīng)粗品，將分離得到的反應(yīng)粗品用水洗滌，并離心過(guò)濾； (3)離心過(guò)濾后的反應(yīng)粗品加入無(wú)水乙醇浸泡，攪拌，再離心過(guò)濾； (4)對(duì)離心過(guò)濾后產(chǎn)物真空干燥，即得磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于: 所述緩沖溶液的配置選用醋酸-醋酸鈉體系或磷酸氫二鈉-磷酸體系。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于: 步驟(3)中無(wú)水乙醇加入量為此時(shí)反應(yīng)粗品質(zhì)量的2-4倍，無(wú)水乙醇浸泡2-4h后攪拌1-2h，再離心過(guò)濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于:步驟(2)中水洗滌倍量為此時(shí)反應(yīng)粗品的0.5-1倍`。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于:步驟(4)中真空干燥的參數(shù)為溫度50±2°C，真空度0.08±0.005Mpa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述的制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于:所述的天然磷脂來(lái)源于大豆磷脂、葵花籽磷脂或蛋黃磷脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一所述的制備磷脂酰絲氨酸的方法，其特征在于:所述的磷脂酶D來(lái)源于植物和微生物，其中植物來(lái)源包括白菜、菠菜、甘藍(lán)和胡蘿卜，微生物來(lái)源包括鏈霉菌、大腸桿菌和沙門氏桿菌。
【文檔編號(hào)】C12P13/06GK103555783SQ201310508296
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月24日
【發(fā)明者】李艷, 趙江, 張永利, 寇玉鋒 申請(qǐng)人:陜西源邦生物技術(shù)有限公司