用于診斷和治療實體癌的基于微小rna的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于診斷和治療實體癌的新的方法和組合物。本發(fā)明也提供了鑒定腫瘤發(fā)生抑制劑的方法。
【專利說明】用于診斷和治療實體癌的基于微小RNA的方法和組合物
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00780005821.2、申請日為2007年1月3日、發(fā)明名稱為“用于診斷和治療實體癌的基于微小RNA的方法和組合物”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]發(fā)明人:CarloM.Croce, George A.Calin 和 Stefano Volinia
[0003]政府資助
[0004]本發(fā)明全部或部分由來自國立癌癥研究所的項目基金P01CA76259，P01CA81534和P30CA56036資助。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0005]發(fā)明背景
[0006]癌癥(惡性細胞的不受控生長)是現(xiàn)代醫(yī)學紀元的一個主要健康問題，也是發(fā)達國家主導死因之一。在美國，四分之一的死亡由癌癥造成(Jemal, A.等人，CA CancerJ.Clin.52:23-47(2002))。在癌癥中，稱作實體癌的源自器官和實體組織的癌癥(例如結(jié)腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，前列腺癌，胰腺癌)屬于最常鑒定的人癌癥。
[0007]例如，前列腺癌是工業(yè)化國家男性中最常診斷出的非皮膚惡性腫瘤，在美國，八名男性中有一名會在他的生命中發(fā) 生前列腺癌(Simard, J.等人，Endocrinologyl43 (6):2029-40(2002))。在最近的數(shù)十年中，前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)急劇增加，前列腺癌現(xiàn)在是美國和西歐的主導死因(Peschel, R.E.J.ff.Colberg, Lancet4:233-41 (2003) ; Nelson, ff.G.等人，N.Engl.J.Med.349(4):366-81 (2003))。具有前列腺癌的男性的壽命預期平均減少了40%。如果在轉(zhuǎn)移和局部擴散超過包膜之前早期檢測到，前列腺癌經(jīng)常可以治愈(例如使用手術)。但是，如果在從前列腺擴散和轉(zhuǎn)移后診斷出來，前列腺癌通常是具有低治愈率的致命疾病。盡管基于前列腺特異性抗原(PSA)的篩選已經(jīng)輔助前列腺癌的早期診斷，它既不是高靈敏度的，也不是特異性的(Punglia等人，N.Engl.J.Med.349(4): 335-42 (2003))。這意味著，該測試伴隨著高百分比的假陰性和假陽性診斷。結(jié)果是許多情況下癌癥被漏診和對沒有癌癥的那些人的不必要的隨訪活檢。
[0008]乳腺癌仍然是婦女中癌癥相關性死亡的第二大病因，在美國其每年影響著超過180，000名婦女。對于北美的婦女，一生中患乳腺癌的概率現(xiàn)在為八分之一。盡管BRCA1和BRCA2的發(fā)現(xiàn)在鑒定參與乳腺癌的關鍵遺傳因素中是非常重要的步驟，但已逐漸清楚BRCA1和BRCA2的突變只解釋部分對乳腺癌的遺傳易感性(Nathanson，K.L.,等人，Human Mol.Gen.10 (7): 715-720 (2001) ; Anglican Breast Cancer StudyGroup.Br.J.Cancer83 (10): 1301-08 (2000);和 Syr jakoski, K.，等人，J.Natl.CancerInst.92:1529-31 (2000))。盡管對乳腺癌的治療進行了大量研究，但乳腺癌仍然難以有效地診斷和治療，并且在乳腺癌患者中觀察到的高死亡率表明該疾病的診斷、治療和預防需要改進。
[0009]除外皮膚癌，結(jié)腸直腸癌是在美國和加拿大第三最常診斷出的癌癥(在女性中，位于肺癌和乳腺癌之后，在男性中，位于肺癌和前列腺癌之后)。美國癌癥學會估計，在2005年美國將有約145，000例新診斷出的的結(jié)腸直腸癌病例(Cancer Facts andFigures2005.Atlanta, GA:American Cancer Society,2005.可從 www.cancer, org/docroot/STT/stt_0.asp獲得，2005年12月19日訪問)。結(jié)腸直腸癌是美國和加拿大男性和女性癌癥死亡的第二大原因(次于肺癌)。
[0010]2004年美國胰腺癌的年發(fā)病率幾乎等同于年死亡率，分別估計為31，860和31, 270(Cancer Facts and Figures2004.Atlanta,GA:American Cancer Society,2004.可從 www.cancer, org/docroot/ STT/stt_0_2004.asp 獲得,2005 年 8 月 21 日訪問)。具有局部進展和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者具有較差的預后，診斷通常對于治療性手術或放療而言發(fā)生得太遲(Burr，Η.A.，等人，The OncologistlO (3): 183—190, (2005))?；熆梢詾橛行┩砥谝认侔┗颊咛峁┌Y狀的緩解，但是迄今為止它對存活率的影響不大。
[0011]在美國，每年有超過20，000人被診斷出胃癌。美國癌癥學會估計，在2004年美國將有22，710例新診斷出的的胃癌病例(Cancer Facts and Figures2004.Atlanta,GA: American Cancer Society, 2004.可從www.cancer.0rg/docroot/STT/stt_0_2004.asp獲得，2005年8月21日訪問)。因為胃癌可以無癥狀地發(fā)生，到診斷作出時其可能已經(jīng)是晚期。那時治療旨在使患者更舒服和提高生命質(zhì)量。
[0012]在世界范圍內(nèi)，肺癌造成比任何其它形式的癌癥更多的死亡(Goodman，G.E.，Thorax57:994-999 (2002))。在美國，肺癌是男性和女性癌癥死亡的主要原因。在2002年，肺癌死亡率估計是134，900例，超過乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌的總和。相同出處。肺癌也是所有歐洲國家癌癥死亡的主要原因，肺癌-相關死亡的數(shù)目在發(fā)展中國家也快速增加。
[0013]無論在診斷時的疾病階段，所有肺癌患者的五年生存率僅是約13%。這與在該疾病仍然在局部時檢測出的病例的46%的五年生存率形成對比。但是，在該疾病已經(jīng)擴散之前，僅16%的肺癌被發(fā)現(xiàn)。早期檢測是困難的，因為在該疾病已經(jīng)達到晚期之前經(jīng)常觀察不到臨床癥狀。盡管對該癌癥和其它癌癥的治療進行了研究，肺癌仍然難以有效地診斷和治療。
[0014]顯然，負責對特定形式的實體癌(例如前列腺癌，乳腺癌，肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，胰腺癌)的易感性的標記和基因的`鑒定，是今天腫瘤學面臨的主要挑戰(zhàn)之一。需要鑒定早期檢測具有對癌癥的遺傳易感性的個體的方法，以便可以為癌癥的早期檢測和治療制定更有力的篩選和干預方案。癌基因也可以揭示可以被操縱的關鍵分子途徑(例如使用小或大分子量藥物)，且可以導致更有效的治療，無論在首次診斷出特定癌癥時的癌癥階段。
[0015]微小RNA是通過與信使RNA(mRNA)靶雜交并引發(fā)對它的翻譯抑制或較不常見地引起其降解來控制基因表達的一類小的非編碼RNA。miRNA的發(fā)現(xiàn)和研究已揭示在生物發(fā)育和各種細胞過程例如細胞分化、細胞生長和細胞死亡中發(fā)揮重要作用的miRNA介導的基因調(diào)控機制(Cheng，Α.Μ.，等人，Nucleic Acids Res.33:1290-1297 (2005))。近年來的研究表明，特定miRNA的異常表達可參與人的疾病,例如神經(jīng)障礙(Ishizuka, A.，等A, Genes Dev.16:2497-2508 (2002))和癌癥。具體地，已在人慢性淋巴細胞性白血病中發(fā)現(xiàn) miR-16-l 和 / 或 miR-15a 的不當表達(Calin, G.A.,等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.99:15524-15529 (2002))。
[0016]顯然，本領域非常需要改進的檢測和治療實體癌(例如前列腺癌，乳腺癌，肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，胰腺癌)的方法。本發(fā)明提供了用于診斷和治療實體癌的新的方法和組合物。
[0017]發(fā)明概述
[0018]本發(fā)明部分地基于在特定實體癌中具有改變的表達水平的特定miRNA的鑒定。[0019]因此，本發(fā)明包括診斷受試者是否患有實體癌或處于發(fā)生實體癌的風險中的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，將受試者的測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對照樣品中的相應的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。與對照樣品中相應的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加，降低)，指示著受試者患有實體癌或處于發(fā)生實體癌的風險中。所述實體癌可以是源自器官和實體組織的任意癌癥。在某些實施方案中，所述實體癌是胃癌，乳腺癌，胰腺癌，結(jié)腸癌，肺癌或前列腺癌。在具體實施方案中，所述實體癌不是乳腺癌，肺癌，前列腺癌，胰腺癌或胃腸癌。
[0020]在一個實施方案中，在測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR_21,miR-191，miR-17-5p和其組合。在另一個實施方案中，在測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1，miR-24-2,miR-146,miR-155,miR-181b-l，miR_20a，miR-107, miR-32, miR-92-2,miR-214, miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a 和其組合。
[0021]在一個實施方案中，所述實體癌是乳腺癌或肺癌，且在測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-210，miR-213和其組合。
[0022]在另一個實施方案中，所述實體癌是結(jié)腸癌，胃癌，前列腺癌或胰腺癌，且在測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-218-2。
[0023]在一個特定實施方案中，所述實體癌是乳腺癌，且在測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125b-l, miR-125b_2，miR-145, miR-21和其組合。在一個相關實施方案中，所述實體癌是乳腺癌，且測試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-21，miR-29b-2, miR-146, miR-125b_2， miR-125b_l， miR-10b, miR-145, miR_181a， miR-140,miR-213，miR_29a prec，miR-181b_l，miR_199b，miR-29b_l，miR-Ι30a，miR-155,let_7a_2，miR-205, miR_29c，miR-224, miR-100, miR-31, miR_30c，miR-17_5p，miR-210, miR_122a，miR-16-2和其組合。
[0024]在另一個實施方案中，所述實體癌是結(jié)腸癌，且測試樣品中的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-24-l，miR-29b_2，miR-20a, miR-10a, miR-32, miR-203, miR_106a，miR-17_5p， miR_30c， miR-223, miR-126*, miR-128b, miR-21, miR-24-2, miR_99b prec,miR-155, miR-213, miR-150, miR-107, miR-191, miR-221, miR-9-3 和其組合。
[0025]在另一個實施方案中，所述實體癌是肺癌，且測試樣品中的miR基因產(chǎn)物選自:miR-21, miR-205, miR_200b， miR-9-1, miR-210, miR-148, miR-141, miR-132, miR-215,miR-128b, let_7g, miR-16-2, miR-129-l/2prec, miR-126*, miR-142-as, miR_30d,miR-30a_5p，miR-7-2, miR-199a_l, miR-127, miR_34a prec, miR_34a, miR-136, miR-202,miR-196-2, miR-199a_2, let_7a_2，miR-124a_l，miR-149, miR-17_5p，miR-196-lprec,miR-lOa, miR_99b prec, miR-196-1, miR_199b，miR-191, miR-195, miR-155 和其組合。
[0026]在另一個實施方案中，所述實體癌是胰腺癌，且在測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-l, miR-103-2, miR-155, miR-204和其組合。在一個相關實施方案中，所述實體癌是胰腺癌，且測試樣品中的miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-103-1, miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b_2，miR-125b_l，miR-24-1, miR-191,miR-23a, miR-26a_l， miR-125a, miR-130a, miR_26b， miR-145, miR-221, miR-126*,miR-16-2, miR-146, miR-214, miR_99b, miR_128b, miR-155, miR-29b_2, miR_29a, miR-25,miR-16-1，miR_99a，miR-224，miR_30d，miR-92—2，miR-199a_l，miR-223，miR_29c，miR_30b，miR-129-1/2, miR-197, miR-17_5p，miR_30c，miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a_5p，miR-132, miR-181b_l， miR_152prec， miR_23b， miR_20a， miR-222, miR_27a， miR-92-1,miR-21, miR-129-l/2prec，miR-150, miR-32, miR_106a，miR-29b_l 和其組合。
[0027]在另一個實施方案中，所述實體癌是前列腺癌，且測試樣品中的miR基因產(chǎn)物選自:let_7d, miR-128a prec, miR-195, miR-203, let-7a-2prec, miR_34a, miR_20a，miR-218-2, miR_29a，miR-25, miR-95, miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148,miR-191, miR-21, let_7i，miR-198, miR-199a_2，miR_30c，miR-17_5p，miR-92-2, miR-146,miR-181b_lprec， miR-32， miR-206, miR_184prec， miR_29a prec, miR-29b_2， miR-149,miR-181b-l， miR-196-lprec， miR-93-1, miR-223, miR-16-1, miR-101-1, miR-124a_l，miR-26a-l，miR-214, miR_27a，miR-24-1, miR_106a，miR-199a_l 和其組合。
[0028]在另一個實施方案中，所述實體癌是胃癌，且測試樣品中的miR基因產(chǎn)物選自:miR-223, miR-21, miR-218-2, miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR-191, miR-221,miR-125b-2, miR-103-1, miR-214, miR-222, miR-212prec, miR-125b_l，miR-100, miR-107,miR-92-1, miR-96, miR-192, miR_23a，miR-215, miR-7-2, miR-138-2, miR-24-1, miR_99b,miR-33b, miR-24-2 和其組合。
[0029]使用本領域技術人員眾所周知的眾多技術(例如，定量或半定量RT-PCR，RNA印跡分析，溶液雜交檢測)，可以測量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個具體的實施方案中，如下測量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平:從獲自受試者的測試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，使所述靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA-特異性探針寡核苷酸雜交(例如，與包含幾種miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交)，以提供測試樣品的雜交譜，并對比測試樣品雜交譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交譜。測試樣品中至少一種miRNA的信號相對于對照樣品的變化指示著受試者患有實體癌或處于發(fā)生實體癌的風險中。在一個特定實施方案中，使靶寡核苷酸與包含針對選自下述的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交:miR-21，miR-17-5p，miR-191，miR-29b-2，miR-223，miR-128b，miR-199a-l, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b_l， miR_20a, miR-107,miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c，miR-25, miR-221, miR_106a 和其組合。
[0030]本發(fā)明也包括抑制患有或被懷疑患有實體癌(例如前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌)的受試者的腫瘤發(fā)生的方法，其中受試者癌細胞中的至少一種miR基因產(chǎn)物失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))。當至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細胞中減量調(diào)節(jié)時，該方法包括，施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物、分離的變體或miR基因產(chǎn)物或變體的生物活性片段，從而抑制受試者中癌細胞的增殖。在另一個實施方案中，所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-145，miR-155，miR-218-2和其組合。在一個特定的實施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。當至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細胞中增量調(diào)節(jié)時，該方法包括，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達的化合物(在本文中稱作〃抑制miR表達的化合物")，從而抑制受試者中癌細胞的增殖。在一個特定的實施方案中，所述至少一種抑制miR表達的化合物對選自下述的 miR 基因產(chǎn)物是特異性的:miR-21，miR-17_5p，miR-191, miR-29b_2，miR-223,miR-128b, miR-199a_l, miR-24-1, miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b_l， miR_20a,miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c，miR-25, miR-221, miR_106a 和其組合。
[0031]在一個相關實施方案中，抑制受試者中腫瘤發(fā)生的方法另外包括下述步驟:測定受試者癌細胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量，并將細胞中miR基因產(chǎn)物的水平與對照細胞中相應的miR基因產(chǎn)物的水平相對比。如果癌細胞中miR基因產(chǎn)物的表達失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))，該方法另外包括，改變在癌細胞中表達的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的量。在一個實施方案中，在癌細胞中表達的miR基因產(chǎn)物的量小于在對照細胞(例如多個對照細胞)中表達的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的減量調(diào)節(jié)的miR基因產(chǎn)物、分離的變體或miR基因產(chǎn)物或變體的生物活性片段施用給受試者。適用于該實施方案的miR基因產(chǎn)物包括miR-145，miR-155，miR-218-2和其組合，以及其它。在一個特定的實施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-l。在另一個實施方案中，在癌細胞中表達的miR基因產(chǎn)物的量大于在對照細胞(例如多個對照細胞)中表達的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的至少一種用于抑制所述至少一種增量調(diào)節(jié)的miR基因產(chǎn)物的表達的化合物施用給受試者。適用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達的化合物包括、但不限于，抑制miR-21，miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1, miR-24-2,miR-146, miR-155, miR-181b_l, miR_20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c,miR-25, miR-221, miR-106a和其組合的表達的化合物。
[0032]本發(fā)明另外提供了用于治療實體癌(例如前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌)的藥物組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物和藥學上可接受的載體。在一個特定的實施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物對應于在癌細胞中的表達水平比在對照細胞中降低的miR基因產(chǎn)物。在某些實施方案中，所述分離的miR基因產(chǎn)物選自:miR-145，miR-155, miR-218-2和其組合。
[0033]在另一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種抑制miR表達的化合物和藥學上可接受的載體。在一個特定的實施方案中，所述至少一種抑制miR表達的化合物對在癌細胞中的表達大于在對`照細胞中的表達的miR基因產(chǎn)物是特異性的。在某些實施方案中，所述抑制miR表達的化合物對選自下述的一種或多種miR基因產(chǎn)物是特異性的:miR-21, miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1,miR-24-2, miR-146, miR-155, miR-181b_l，miR_20a，miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214,miR-30c, miR-25, miR-221, miR-106a 和其組合。
[0034]本發(fā)明也包括鑒定腫瘤發(fā)生抑制劑的方法，其包括給細胞提供測試試劑，和測量細胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個實施方案中，該方法包括，給細胞提供測試試劑，和測量與實體癌(例如前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌)中降低的表達水平有關的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對照細胞相比，所述細胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加，指示著測試試劑是腫瘤發(fā)生抑制劑。在一個特定的實施方案中，所述與實體癌細胞中降低的表達水平有關的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-145，miR-155,miR-218-2和其組合。
[0035]在其它實施方案中，該方法包括，給細胞提供測試試劑，和測量與實體癌中增加的表達水平有關的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對照細胞相比，所述細胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的降低，指示著測試試劑是腫瘤發(fā)生抑制劑。在一個特定的實施方案中，所述與實體癌細胞中增加的表達水平有關的至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-21，miR-17-5p, miR-191, miR-29b_2，miR-223, miR_128b，miR-199a_l，miR-24-1, miR-24-2,miR-146, miR-155, miR-181b_l, miR_20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c,miR-25, miR-221，miR-106a 和其組合。
[0036]附圖簡述
[0037]本專利或申請文件含有至少一幅彩色附圖。含有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞_的拷貝將在提出請求并支付必要的費用后由官方提供。
[0038]圖1描述了代表6種實體癌(頂部)和相應的正常組織的540個樣品的聚類分析。在樹中包括的miRNA (n=137)代表著其表達水平(減去背景的強度)高于至少50%的分析樣品中的閾值(256)的那些。陣列以中位值為中心，并使用Gene Cluster2.0標準化。使用非中心化的關聯(lián)度量，進行平均關聯(lián)聚類。顏色指示著每個樣品中的微小RNA的表達水平與中位值的差異。
[0039]圖2描述了微小RNA表達數(shù)據(jù)的非監(jiān)督分析。過濾涵蓋乳腺、結(jié)腸、肺、胰腺、前列腺和胃(正常組織和腫瘤)的540個樣品(在圖頂部標明)的微小RNA譜，定中心，并對每個特征標準化。在樣品(水平方向)和特征(垂直方向)上對數(shù)據(jù)進行分級聚類，以平均關聯(lián)和皮爾森關聯(lián)作為相似性度量。樣品名稱指示在圖的頂部，miRNA名稱在左側(cè)。探針I(yè)D指示在括號中，因為相同的微小RNA可以用不同的寡核苷酸測量。顏色指示著每個樣品中的微小RNA的表達水平與中位值的差異。
[0040]圖3描述了實體癌(頂部)之間差異調(diào)節(jié)的miRNA的表達。代表了在至少90%的組織實體癌中存在的61種微小RNA(圖右側(cè))。樹顯示了在log2轉(zhuǎn)化后每個列出的微小RNA的平均絕對表達值。對來自相同組織或腫瘤組織型的所有樣品，計算平均值。以基因的平均值為中心，并使用Gene Clusterf.0標準化。使用歐幾里德距離法，進行平均關聯(lián)聚類。
[0041]圖4描述了在至少75%的實體瘤中存在的miRNA的表達的倍數(shù)變化，其中與正常樣品相比，在不同癌樣品(頂部)中的至少1個腫瘤絕對值高于2。樹顯示了平均倍數(shù)變化(癌癥相對于正常)的log2轉(zhuǎn)化。對來自相同組織或腫瘤組織型的所有樣品，計算平均值。以陣列的平均值為中心，并使用Gene Cluster2.0標準化。使用非中心化的關聯(lián)度量，進行平均關聯(lián)聚類。
[0042]圖5描述了在至少50%的實體瘤的特征中存在的miRNA的表達的倍數(shù)變化(癌癥相對于正常樣品)。樹顯示了平均倍數(shù)變化(癌癥相對于正常)的log2轉(zhuǎn)化。對來自相同組織或腫瘤組織型的所有樣品，計算平均值。以陣列的平均值為中心，并使用GeneCluster2.0標準化。使用非中心化的關聯(lián)度量，進行平均關聯(lián)聚類。
[0043]圖6A描述的條形圖指示了編碼癌蛋白的不同基因的3’ UTR使得能通過微小RNA實現(xiàn)癌調(diào)節(jié)。將螢火蟲螢光素酶表達的相對阻遏(倍數(shù)變化)相對于花蟲螢光素酶對照標準化。PLAG1，多形腺瘤基因1;TGFBR2，轉(zhuǎn)化生長因子β受體II; Rb，視網(wǎng)膜母細胞瘤基因。pGL-3 (Promega)用作空載體。miR-20a，miR-26a_l 和 miR-106 寡 RNA (有義，混雜)用于轉(zhuǎn)染。在下圖中顯示了使用每個靶mRNA的突變版本(其缺少5’miRNA-末端互補位點(MUT))作為對照的第二個實驗。所有實驗一式三份地進行2遍(n=6)。
[0044]圖6B描述的蛋白印跡表明，在某些癌癥(例如肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，胃癌)中，RBl(Rb)蛋白的水平表現(xiàn)出與miR-106a表達水平的負相關。β -肌動蛋白用作標準化的對照。N1，正常樣品；T1和T2，腫瘤樣品。 [0045]圖7描述的RNA印跡顯示了與正常樣品相比乳腺癌樣品(P系列和編號系列)中miR-145的減量調(diào)節(jié)(頂部)和miR-21表達的增量調(diào)節(jié)(底部)。用U6-特異性的探針進行標準化。
[0046]圖8描述的RNA印跡顯示了與正常樣品(K系列)相比，不同內(nèi)分泌胰腺癌樣品(WDET,分化良好的胰腺內(nèi)分泌腫瘤，WDEC，分化良好的胰腺內(nèi)分泌癌，和ACC，胰腺腺泡細胞癌)中miR-103的增量調(diào)節(jié)和miR-155的減量調(diào)節(jié)(頂部)表達，以及與正常樣品(K系列)和不分泌的/無功能的(NF-系列)樣品相比，胰島素瘤(F系列)中miR-204(底部)表達的增量調(diào)節(jié)。使用對5S RNA特異性的探針，進行標準化。
[0047]發(fā)明詳述
[0048]本發(fā)明部分地基于，與正常的對照細胞相比，在與不同實體癌如結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌有關的癌細胞中的表達發(fā)生改變的特定miRNA的鑒定。
[0049]如本文中互換使用的，〃miR基因產(chǎn)物，〃〃微小RNA，〃〃miR，〃或"miRNA"是指來自miR基因的未加工的(例如前體)或加工過的(例如成熟的)RNA轉(zhuǎn)錄物。由于miR基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白，術語"miR基因產(chǎn)物〃不包括蛋白。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱作"miR前體〃或"miRprec"，通常包含長度為約70-100個核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物。miR前體可以用RNA酶(例如，Dicer，Argonaut,或RNA酶III (例如，大腸桿菌RNA酶III))消化加工成有活性的19-25個核苷酸的RNA分子。該有活性的19-25個核苷酸的RNA分子也稱作〃加工過的"miR基因產(chǎn)物或〃成熟的"miRNA。
[0050]所述有活性的19-25個核苷酸的RNA分子可以通過天然加工途徑(例如，使用完整細胞或細胞裂解物)或通過合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶，例如分離的Dicer，Argonaut,或RNA酶III)從miR前體得到。應當理解，所述有活性的19-25個核苷酸的RNA分子也可以通過生物或化學合成直接生成，不從miR前體加工。當在本文中用名稱提及微小RNA時，該名稱對應著前體和成熟形式兩者，除非另有說明。
[0051]表la和lb描述了特定的前體和成熟人微小RNA的核苷酸序列。
[0052]表la-人微小RNA前體序列
[0053]
【權(quán)利要求】
1.診斷受試者是否患有實體癌或處于發(fā)生實體癌的風險中的方法，其包括，測量來自受試者的測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對照樣品中相應的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著受試者患有實體癌或處于發(fā)生實體癌的風險中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-21，miR-191,miR-17-5p和其組合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-21，miR-17-5p，miR-191, miR-29b-2, miR-223, miR_128b， miR-199a_l, miR-24-1， miR-24-2， miR-146,miR-155, miR-181b_l, miR_20a, miR-107, miR-32, miR-92-2, miR-214, miR_30c, miR-25,miR-221, miR-106a 和其組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述實體癌選自:前列腺癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，乳腺癌和結(jié)腸癌。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述實體癌是乳腺癌或肺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-210，miR-213和其組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述實體癌是結(jié)腸癌，胃癌，前列腺癌，或胰腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物是miR-218-2。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述實體癌是乳腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-125b-l, miR125b_2，miR-145, miR-21 和其組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述實體癌是胰腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-l, miR-103-2，miR-155, miR-204 和其組合。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述實體癌和所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自:(i)所述實體癌是乳腺癌，且所述miR基因產(chǎn)物選自:miR-21，miR-29b_2，miR-146,miR-125b_2, miR-125b_l, miR-10b, miR-145, miR_181a, miR-140, miR-213, miR_29a prec,miR-181b_l, miR_199b, miR-29b_l, miR_130a, miR-155, let_7a_2， miR-205, miR_29c,miR-224, miR-100, miR-31，miR_30c，miR-17_5p，miR-210, miR_122a，miR-16-2 和其組合;(ii)所述實體癌是結(jié)腸癌，且所述miR基因產(chǎn)物選自:miR-24-l，miR-29b-2，miR-20a，miR-10a, miR-32, miR-203, miR_106a，miR-17_5p，miR_30c，miR-223, miR-126*，miR_128b,miR-21,miR-24-2,miR-99b prec,miR-155,miR-213,miR-150,miR-107,miR-191,miR-221,miR-9-3和其組合；(iii)所述實體癌是肺癌，且所述miR基因產(chǎn)物選自:miR-21,miR-205, miR_200b,miR-9-1, miR-210, miR-148, miR-141, miR-132, miR-215, miR_128b，let_7g，miR-16-2,miR-129-l/2prec, miR-126*, miR-142-as, miR_30d, miR-30a_5p, miR-7-2, miR-199a_l,miR-127, miR_34a prec, miR_34a, miR-136, miR-202, miR-196-2, miR-199a_2, let-7a_2,miR-124a_l, miR-149, miR-17_5p, miR-196-lprec, miR-10a, miR_99b prec, miR-196-1,miR-199b, miR-191, miR-195, miR-155 和其組合;(iv)所述實體癌是胰腺癌，且所述miR基因產(chǎn)物選自:miR-103-2，miR-103-l,miR-24-2, miR-107, miR-100, miR-125b_2， miR-125b_l， miR-24-1, miR-191, miR_23a,miR-26a_l， miR-125a, miR-130a, miR_26b， miR-145, miR-221, miR-126*, miR-16-2,miR-146, miR-214, miR_99b，miR_128b，miR-155, miR-29b_2，miR_29a，miR-25, miR-16-1，miR-99a, miR-224, miR_30d, miR-92-2, miR-199a_l, miR-223, miR_29c, miR_30b,miR-129-1/2, miR-197, miR-17_5p, miR_30c, miR-7-1, miR-93-1, miR-140, miR-30a_5p,miR-132, miR-181b_l, miR-152prec, miR_23b, miR_20a, miR-222, miR_27a, miR-92-1,miR-21, miR-129-l/2prec, miR-150, miR-32, miR_106a, miR-29b_l 和其組合;(v)所述實體癌是前列腺癌，且所述miR基因產(chǎn)物選自:let-7d,miR-128a prec,miR-195, miR-203,let_7a_2prec，miR_34a，miR-20a,miR-218-2,miR-29a,miR-25,miR-95,miR-197, miR-135-2, miR-187, miR-196-1, miR-148, miR-191, miR-21, let_7i, miR-198,miR-199a_2，miR_30c，miR-17_5p，miR-92-2, miR-146, miR-181b-lprec, miR-32, miR-206,miR-184prec,miR-29a prec,miR-29b_2，miR-149，miR-181b_l，miR-196-lprec，miR-93-1,miR-223, miR-16-1, miR-101-1，miR-124a_l，miR-26a_l，miR-214, miR_27a，miR-24-1,miR-106a, miR-199a_l 和其組合;和 (vi)所述實體癌是胃癌，且所述miR基因產(chǎn)物選自:miR-223，miR-21,miR-218-2,miR-103-2, miR-92-2, miR-25, miR-136, miR-191, miR-221, miR-125b_2， miR-103-1,miR-214, miR-222, miR-212prec, miR-125b_l, miR-100, miR-107, miR-92-1, miR-96,miR-192, miR_23a，miR-215, miR-7-2, miR-138-2，miR-24-1, miR_99b，miR_33b，miR-24-2和其組合。
10.診斷受試者是否患有實體癌或處于發(fā)生實體癌的風險中的方法，其包括:(1)從獲自受試者的測試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測試樣品的雜交譜；和(3)對比測試樣品雜交譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交譜，其中至少一種miRNA的信號的改變指示著受試者患有實體癌或處于發(fā)生實體癌的風險中。
【文檔編號】C12N15/113GK103642900SQ201310493368
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2007年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2006年1月5日
【發(fā)明者】C·M·克羅斯, G·A·卡林, S·沃林尼亞 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會