藥典三種秦艽藥材的dna條形碼鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法。該鑒別方法包括DNA提取與對得到的DNA序列拼接兩大步驟。其中DNA提取通過增加裂解加熱的時間，并且用等體積的酚∶三氯甲烷(1∶1)去除酚及多糖類物質(zhì)的干擾，得到了較好的提取效果。然后將所得到的DNA序列進(jìn)行拼接后對秦艽進(jìn)行鑒定，得到了較好的鑒別效果。
【專利說明】藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002]秦艽為傳統(tǒng)常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為“中品”，性平，味辛、苦，歸胃、肝、膽經(jīng)，根入藥。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)科技在化學(xué)成分，藥理藥效，臨床應(yīng)用等研究中的迅速發(fā)展，秦艽的藥理作用被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，臨床應(yīng)用也越來越廣泛。藥理研究和臨床應(yīng)用表明，秦艽不僅在抗炎鎮(zhèn)痛方面具有明顯的作用，還可以調(diào)節(jié)免疫，抗感冒病毒，抑制念珠菌生長，對心腦血管及肝臟也具有一定的保護(hù)作用，對面癱等神經(jīng)系統(tǒng)疾病效果也很顯著。大葉秦究Gentiana macrophyllaPal1.、粗莖秦究G.crassicaulis Duthie.、和麻花秦究G.straminea Maxim.這三種秦究為中國藥典收載品種。
[0003]DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段(DNA barcode)自身在物種種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)，它可以對物種進(jìn)行快速的自動鑒定。DNA Barcoding的概念由加拿大Paul Hebert首次提出。Paul Hebert等有關(guān)研究表明，可以用線粒體基因(COI)作為一個標(biāo)準(zhǔn)片段來分辨動物界中的近緣物種，線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I (Cytochromeeoxdase I，C0I)是一個600bp的DNA序列。據(jù)此提出可以用單一的小片段基因來代表物種，這如同超市用以區(qū)分成千上萬種不同商品的條形碼，因此把這種小片段基因序列稱作物種的DNA條形碼(DNA barcodes)。DNA是生物的遺傳信息的載體,遺傳信息的不同，決定了生物的多樣性。由于每種生物物種的DNA序列都是唯一的，這就給DNA條形碼提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，DNA每個位點(diǎn)上都有A、T、G、C4種選擇，由于DNA序列中堿基的保守性，幾十個堿基的長度不能提供足夠的編碼信息，所 以目前的DNA條形碼分析都是基于幾百個堿基長度的DNA序列。
[0004]PCR技術(shù)即無細(xì)胞分子克隆法:是指在微量離心管中，加入適量的緩沖液、模板DNA、四種脫氧單核苷酸、耐熱性多聚酶以及一對合成DNA的引物，通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段組成一個循環(huán)，每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)增長一倍，一般樣品經(jīng)過30-40次循環(huán)，最終使基因放大數(shù)百萬倍，最終得到擴(kuò)增了百萬倍的特異區(qū)段的DNA的方法。這種技術(shù)由Kary B.Mullis (穆利斯(美))創(chuàng)建。在此之前Khorana (1971)等曾提出DNA在體外變性后，與適當(dāng)引物雜交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的設(shè)想；1983年，Mullis發(fā)明了 PCR技術(shù)，使Khorana的設(shè)想得以實現(xiàn)；1988年Saiki等又將耐熱DNA聚合酶(Taq)引入了 PCR技術(shù)，使PCR變得更加便捷、高效和經(jīng)濟(jì)；1989年美國《Scienee》雜志將PCR列為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首，曾有人比喻1989年為PCR的爆炸年，Mullis也因此榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)具有高度的靈敏性、特異性、操作簡便易行的特點(diǎn)，可被用于基因克隆，基因檢測，基因配型，基因鑒定等研究領(lǐng)域，從而逐漸而成為人類學(xué)研究、法醫(yī)學(xué)檢驗、基因工程產(chǎn)品、基因治療、基因診斷中的一種廣泛性技術(shù)手段。PCR技術(shù)的興起，無疑對DNA條形碼鑒定帶來了便利，利用了 PCR技術(shù)可對需要的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，繼而進(jìn)行測序等后續(xù)實驗。
[0005]目前，DNA條形碼已經(jīng)在動物中得到廣泛應(yīng)用，它不僅可以對動物物種進(jìn)行鑒定分類，還可以擴(kuò)充物種的DNA條形碼信息，并且可以發(fā)現(xiàn)新種和隱存種。其在植物中的研究也正在快速開展，這項技術(shù)對于非分類學(xué)專業(yè)工作者對有關(guān)材料進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，尤其是對于藥材的鑒定帶來了便捷。除此之外，植物DNA條形碼技術(shù)還可以用于辨別食草動物日常取食材料、監(jiān)測植物根系的空間分布格局、發(fā)現(xiàn)隱形物種、以及研究入侵植物。但是各種DNA片段在不同類群中的應(yīng)用效果不同，目前仍未獲得統(tǒng)一的植物條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段，可以運(yùn)用于各物種的鑒別。因此，當(dāng)前的研究熱點(diǎn)仍然是尋找一種可能的條形碼片段，可以進(jìn)行更大規(guī)模的分析和整體評價。許多學(xué)者對此進(jìn)行了積極深入的探索，目前也得出了多種條形碼片段或組合方法，但至今仍未達(dá)成明確的共識。Kress等通過對核基因ITS 和 9 個質(zhì)體基因片段(trnK_rpsl6、trnH-psbA、rpl36_rps8、atpB-rbcL、ycf6_psbM、trnV-atpE、trnC_ycf6、psbM-trnD和trnL-trnF)序列進(jìn)行實驗分析,提出了片段組合的方案，他認(rèn)為ITS+trnH-psbA組合將在有花植物中得到廣泛應(yīng)用。在此之后Chase等提出 rpoCl+rpoB+matK 或 rpoCl+matK+trnH-psbA 片段組合；與此同時 K1-Joong Kim 等提出matK+atpF-atpH+psbK-psbI 或 matK+atpF-atpH+trnH-psbA 片段組合；Kress 和 Erickson同時提出rbcL+trnH-psbA可以對陸生植物進(jìn)行識別和鑒定。國際植物條形碼工作組(TheConsortium for the Barcode of Life Plant Working Group)推薦葉綠體基因 matK 和rbcL作為陸生植物的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼片段。
[0006]有關(guān)研究表明ITS (包含ITS2)序列和trnH-psbA序列對葫蘆科植物種間鑒定的成功率高，rbcL也可用于種間鑒定，但成功率相對前兩者較低。對于錦葵科植物的鑒別，ITS和psbA-trnH也是較適合的DNA條形碼序列組合。譚麗盈等研究表明葉綠體基因rbcL序列可用于鑒別十大功勞及其偽品。秦民堅等亦用葉綠體rbcL基因?qū)ι涓杉邦愃扑幱弥参锘蛐蛄羞M(jìn)行了分析，結(jié)果表明葉綠體rbcL基因序列可以很好的鑒別5種鳶尾科植物。此法現(xiàn)今已經(jīng)被用于中藥秦艽的鑒別，張得鈞等通過篩選表明ITS序列適合作秦艽基原植物的DNA分子鑒定，羅焜等已經(jīng)將ITS2條形碼直接用于藥材秦艽的鑒別。而組合片段對中藥秦艽的鑒別還未見報道，本研究即探索了適合用于秦艽藥材的條形碼組合片段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法，包括以下步驟:
[0009](I)取過60-80目篩的秦艽藥材粉末加至離心管中，加入適量預(yù)熱的Buffer PCB和巰基乙醇并混勻，65°C左右水浴加熱35-45min，間或混勻；用等體積的酚:三氯甲烷(I: I)反復(fù)混勻，離心后取上清，反復(fù)操作2-3次；加入等體積的三氯甲烷，混勻后離心，吸取上層水相至一個干凈的離心管中，加入等體積Buffer BD，混勻，再加等體積的無水乙醇，混勻后全部加入到吸附柱中，靜置2-5min ;離心，再分別用適量PW Solution和Wash Solution離心，晾干；將吸附柱放入一個干凈的離心管中，加入60°C左右預(yù)熱的TEBuffer，靜置一段時間后離心，即得DNA溶液；[0010](2)將提取的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測序，得到ITS、psbA-trnH和rbcL序列，再將psbA-trnH和rbcL拼接，ITS、psbA-trnH和rbcL拼接,得到兩條拼接序列，分別計算遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]目前中藥DNA條形碼研究多是從原植物葉片中提取DNA，但是在實際運(yùn)用中，我們通常面對的是藥材，這無疑為中藥材的鑒定工作帶來了不便，局限了 DNA用于中藥鑒定的范圍。本實驗在按照Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒說明書基礎(chǔ)上提取秦艽樣品時，葉類樣品中的DNA易于提出，條帶清晰，但是藥材DNA顯示模糊或無條帶顯示，這可能是由于根類藥材不易裂解，并且根類藥材中含有多糖、多酚或者一些此生代謝產(chǎn)物干擾了 DNA的提取。針對這一問題，對有關(guān)提取步驟作出相應(yīng)改變，秦艽藥材DNA提取得到了較好的效果O
[0013]實驗結(jié)果表明ITS、psbA_trnH和rbcL三種條形碼單獨(dú)用于秦究的分子鑒定,均存在一些缺陷，rbcL序列過于保守，psbA-trnH序列種間和種內(nèi)遺傳距離有重疊，而ITS序列雖可用作秦艽分子鑒定，其種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離十分接近，難以確保鑒定的準(zhǔn)確性。為此，分別將psbA-trnH和rbcL兩條序列拼接，將ITS、psbA_trnH和rbcL三條序列拼接，用于秦艽的鑒別，這兩組拼接序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)構(gòu)一致。且ITS的變異位點(diǎn)只有10個，而psbA-trnH+rbcL與ITS+psbA-trnH+rbcL變異位點(diǎn)分別為34個和44個，因此認(rèn)為，組合序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹，能更準(zhǔn)確的表現(xiàn)秦艽的親緣關(guān)系。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1本發(fā)明藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法實施例的部分樣品的PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果(rbcL)。
[0015]圖2是本發(fā)明藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法實施例的ITS序列系統(tǒng)樹。
[0016]圖3是本發(fā)明藥典三種秦究藥材的DNA條形碼鑒別方法實施例的psbA-trnH+rbcL序列系統(tǒng)樹。
[0017]圖4是本發(fā)明藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法實施例的ITS+psbA-trnH+rbcL 序列系統(tǒng)樹。
[0018]圖5是本發(fā)明藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法實施例的和市場藥材psbA-trnH+rbcL序列系統(tǒng)樹。
[0019]圖6是本發(fā)明藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法實施例的秦艽樣品和市場藥材ITS+psbA-trnH+rbcL序列系統(tǒng)樹。
【具體實施方式】
[0020]I實驗儀器與試藥
[0021]1.1實驗儀器
[0022]DDY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，T196PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)，GeCDOCXR凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂Bio-RAD)，HANGPINGJA3003N電子分析天平，KM-15200KUB0TA離心機(jī)，eppendorfCentrrfuge5417R超速冷凍離心機(jī)(德國eppendorf),國華HH-60數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱，BCD-2181E冰箱(榮事達(dá)Royalstar) ,Panasonic NM-S553MF微波爐(上海松下微波爐有限公司)，KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SAXXYO MDF-382E-80°C超低溫冰箱(日本)，Aquapro艾科浦AYJ1-0501-U超純水系統(tǒng)(頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)，LQP-B-4制冰機(jī)(六泉Anke)，PHOTOA干燥箱(上海一恒科技有限公司)，SK-1快速混勻器(國華)，TopPette手動單道可調(diào)式移液器(上海漢林實驗儀器有限公司)；1.5mL，2.0mL離心管(生工生物工程(上海)有限公司)，PCR薄壁管及薄壁管蓋(生工生物工程(上海)有限公司)，微量吸頭(10 μ L，200 μ L，1000 μ L)(生工生物工程(上海)有限公司)。
[0023].1.2實驗試劑
[0024]Ezup 柱式植物基因組 DNA 抽提試劑盒，5 X TBE，I X TE，DNA marker-D，Green-DNADye 核苷酸膠體染料,6 X Clyerol DNALoading Buffer 緩沖液,瓊脂糖(AgaroseB.Low EE0)以上試劑均購于生工生物工程(上海)有限公司，Extaq酶(DRRooATaKaRa)，無水乙醇(AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，異丙醇(AR國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，三氯甲燒(AR上海振企化學(xué)試劑品有限公司)，β_巰基乙醇(Reanta Scientific TechnologyC0.LTD)，PCR擴(kuò)增引物合成(生工生物工程(上海)有限公司)。
[0025].1.3樣品及來源
[0026]樣品來源見表2，其中獐牙菜由全國第四次中藥資源普查舒城調(diào)查隊提供，樣品為從標(biāo)本上取得葉片，其余樣品均為秦艽藥材采自四川省松潘縣 。
[0027]表2樣品來源
[0028]
【權(quán)利要求】
1.藥典三種秦艽藥材的DNA條形碼鑒別方法，其特征在于包括以下步驟: (1)取過60-80目篩的秦艽藥材粉末加至離心管中，加入適量預(yù)熱的BufferPCB和β-巰基乙醇并混勻，65°C左右水浴加熱35-45min，間或混勻；用等體積的酚:三氯甲烷(1: 1)反復(fù)混勻，離心后取上清，反復(fù)操作2-3次；加入等體積的三氯甲烷，混勻后離心，吸取上層水相至干凈的離心管中，加入等體積Buffer BD,混勻，再加等體積的無水乙醇，混勻后全部加入到吸附柱中，靜置2-5min ;離心，再分別用適量PW Solution和WashSolution離心，晾干；將吸附柱放入干凈的離心管中，加入60°C左右預(yù)熱的TE Buffer，靜置后離心，即得DNA溶液； (2)將提取的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測序，得到ITS、psbA-trnH和rbcL序列，再將psbA-trnH和rbcL拼接，ITS、psbA_trnH和rbcL拼接,得到兩條拼接序列，分別計算遺傳距離，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
【文檔編號】C12Q1/68GK103509871SQ201310467652
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】方成武, 張明燕, 孟楣, 彭華勝, 馬宗華, 黃璐琦, 劉守金, 楊青山, 李慶林 申請人:安徽中醫(yī)藥大學(xué)