利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶dck的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法。步驟包括：將通過修飾加有His標(biāo)簽的dck基因及polh基因分別克隆到啟動(dòng)子表達(dá)載體以構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體；將重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，獲得重組穿梭載體Bacmid；Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，獲得重組病毒多角體；重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達(dá)，并通過Ni-NTA親和層析純化，獲得具有一定酶活性的脫氧胞苷激酶。本發(fā)明的有益效果在于經(jīng)口添食家蠶，使脫氧胞苷激酶dck基因在家蠶體中表達(dá)純化，與人工注射家蠶相比，省時(shí)省力提高了生產(chǎn)效率，為家蠶生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)化提供了技術(shù)支撐，并為抗腫瘤藥物DCK的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，拓寬了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人類急需的蛋白藥物、基因工程疫苗等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。
【專利說明】利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脫氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase, DCK)是人體四大激酶之一,它是催化抗病毒核苷類藥物在人體內(nèi)磷酸化，發(fā)揮藥效的關(guān)鍵酶。它是一種大小為61KD的磷酸激酶，包括兩個(gè)30.5KD的相同亞基，是脫氧核苷酸生物合成補(bǔ)救途徑中的關(guān)鍵酶，在維持正常的脫氧核苷酸方面起著重要的生理學(xué)作用。DCK缺陷與抗病毒和抗腫瘤藥物的抗性有重要的關(guān)系，它可以激活細(xì)胞毒性核苷三磷酸衍生物的活化，在細(xì)胞耐藥性和藥物敏感性方面有著重要的作用。隨著核苷類抗腫瘤藥物毒性及抗性機(jī)理研究的不斷深人，將有助于人們開闊思路，設(shè)計(jì)出療效更高的新一代藥物，從而為腫瘤的研究和治療作出貢獻(xiàn)。
[0003]DCK類化合物經(jīng)過十幾年的發(fā)展，得到了許多高活性的化合物，但由于該類化合物的水溶性差，生 物利用度低，使得該類化合物發(fā)展成臨床用藥進(jìn)展較慢。前藥研究是最有可能將這類化合物發(fā)展成藥的一個(gè)重要方向。研究表明對(duì)邪蒿素類似物的不對(duì)稱雙羥化產(chǎn)物進(jìn)行改造，期望引入氮原子，通過成鹽等方法增加化合物的水溶性，進(jìn)而改善生物利用度。這類化合物具有作用機(jī)制獨(dú)特、活性高、抗耐藥性等特點(diǎn)，值得對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究開發(fā)。
[0004]近年來，Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用，該系統(tǒng)根據(jù)F因子載體的原理，構(gòu)建一種新桿狀病毒穿梭載體Bacmid，并且可以快速，同時(shí)分離多種重組病毒，有效解決了傳統(tǒng)繁瑣的空斑分析來篩選重組病毒的難題。該系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢:(1)重組率有顯著提高，幾乎可達(dá)100%。(2)大大地縮短了構(gòu)建重組病毒所需要的時(shí)間，使由原來的4一6周或更長減少到僅7 —10天。(3)通過藍(lán)白斑篩選重組病毒有針對(duì)性，不會(huì)產(chǎn)生野生型和非重組型病毒污染的問題?？傊?，該技術(shù)可以快速、同時(shí)產(chǎn)生多種重組病毒。
[0005]利用家蠶桿狀病毒作為表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)用最多的是將外源目的基因替代polh基因，利用Pph帶動(dòng)目的基因高效表達(dá)。產(chǎn)生的重組病毒由于沒有多角體蛋白外殼的保護(hù)，只能通過皮下注射的方式接種家蠶，導(dǎo)致效率低下，因此可利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建可同時(shí)表達(dá)dck基因和polh基因的表達(dá)載體，獲得的重組病毒，可經(jīng)口接種家蠶，在家蠶幼蟲中表達(dá)抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶基因dck，并可以經(jīng)過N1-NTA親和層析純化。此方法與人工皮下注射家蠶相比，其優(yōu)點(diǎn)省時(shí)省力，提高了生產(chǎn)效率，便于規(guī)?；a(chǎn)，為家蠶生物反應(yīng)器產(chǎn)業(yè)化提供了技術(shù)支撐，并為脫氧胞苷激酶DCK的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法。[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0008]一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，步驟包括:[0009](I)將通過修飾加有His標(biāo)簽的dck基因及polh基因分別克隆到雙啟動(dòng)子表達(dá)載體以構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體；
[0010](2)將上述重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，獲得重組穿梭載體Bacmid ；
[0011](3)上述Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，獲得重組病毒多角體；
[0012](3)上述重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過N1-NTA親和層析的方法純化，獲得具有酶活性的脫氧胞苷激酶DCK。
[0013]進(jìn)一步地,上述步驟(1)雙啟動(dòng)子表達(dá)載體為pFastBacDual。
[0014]進(jìn)一步地,上述dck基因及polh基因分別插入雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pFastBacDual的PplO和Pph的MCS的下游處構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體。
[0015]進(jìn)一步地,上述步驟(2)中重組穿梭載體Bacmid是通過將min1-Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體Bacmid上mini_attTn7祀位點(diǎn),得到Gen抗性,再通過通過涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG, X-gal的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑過夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取獲得的。
[0016]進(jìn)一步地,上述在步驟(3)中轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)是指重組Bacmid及脂質(zhì)體,分別加入無血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，將兩種溶液混勻，室溫靜置，另取生長良好的Bm細(xì)胞，加入無血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基及重組Bacmid/脂質(zhì)體復(fù)合物，培養(yǎng)一段時(shí)間，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察。
[0017]進(jìn)一步地，上述步驟(3)中定量的重組病毒多角體的濃度為2X107NPB/ml。
[0018]進(jìn)一步地，上述步驟(3)中重組病毒多角體的添食量為每頭蠶8 μ I。
[0019]進(jìn)一步地，上述N1-NTA親和層析純化是指收集受感染的家蠶血液，超聲破碎，離心取上清，與鎳離子親和層析柱結(jié)合，用不同濃度的咪唑緩沖液進(jìn)行洗滌，用IOmM的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，用250mM的咪唑緩沖液洗脫重組蛋白。
[0020]本發(fā)明的有益效果:
[0021]利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體，在家蠶Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中獲得的重組病毒，可經(jīng)口添食家蠶，使抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK基因在家蠶體中表達(dá)，與人工注射家蠶相比，省時(shí)省力，提高了生產(chǎn)效率。此外表達(dá)產(chǎn)物可以進(jìn)行N1-NTA親和層析純化，使獲得較高純度的脫氧胞苷激酶，為抗腫瘤藥物的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，拓寬了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)人類急需的蛋白藥物、基因工程疫苗等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶dck基因方法的流程示意圖；
[0023]圖2為重組雙啟動(dòng)子pFastBac Dual表達(dá)載體的示意圖；
[0024]圖3為dck基因及polh基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測示意圖；其中M為蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)，I~2分別為經(jīng)口添食重組病毒的家蠶第六天和第七天的血液，3~4分別為經(jīng)口添食野生型桿狀病毒的家蠶第六天和第七天的血液，5~6分別為正常家蠶第六天和第七天的血液，箭頭所指32KD處為DCK條帶，29KD處為多角體條帶；
[0025]圖4為dck基因表達(dá)產(chǎn)物Western-blot檢測示意圖；其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為表達(dá)產(chǎn)物DCK，2為陽性對(duì)照，3為陰性對(duì)照；
[0026]圖5為表達(dá)產(chǎn)物純化的SDS-PAGE檢測示意圖；其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為洗脫組分，2為洗滌組分，3為流出組分；
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面根據(jù)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0028]本發(fā)明的整體的方法流程如圖1所示。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)構(gòu)建雙啟動(dòng)子表達(dá)載體:分別以合成好的pFastBacl-dck和野生型病毒株基因組DNA為模板，合成dck基因及polh基因，分別插入到雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pFastBacDual的PplO和Pph的MCS的下游，，設(shè)計(jì)合成引物如下:
[0031]DCK-F (5，-CCGCTCGAGATGTCGTACTACCA-3，),
[0032]DCK-R (5’ -CATGCCATGGTAACAAAGTACTCAAAAAC-3’)
[0033]Polh-F (5，-CGCG GATCCATGCCGAATTATTCATACA-3，)，
[0034]Polh-R(5’-CCCAAGCTTTTAATACGCCGGACCAGTGAACAG-3，)
[0035]插入的酶切位點(diǎn)為，dck(Nco I/Xho I ), polh(BamH I/Hind III)
[0036](2)重組穿梭載體Bacmid:用上述雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，將已構(gòu)建好的重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coli DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，37°C振蕩培養(yǎng)4h,重組穿梭載體Bacmid是通過將mini_Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體Bacmid上min1-attTn7祀位點(diǎn)而產(chǎn)生的，并且得到了 Gen抗性。通過涂布于含有Kan,Gen,Tet, IPTG，X-gal的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選白斑過夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取重組穿梭載體Bacmid,用M13引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。重組雙啟動(dòng)子pFastBac Dual表達(dá)載體如圖2所示。
[0037]注:PCR反應(yīng)體系(25 μ L 反應(yīng)體系):10 X Taq Buffer2.5μ I, dNTPsl.5μ I,混合引物(M13F+M13R) I μ I, Taq polymerase0.2 μ I, ddH20 up to25 μ I,模板(rBacmid) I μ I。
[0038]PCR 擴(kuò)增條件:93°C預(yù)變性 3min，94°C變性 45s，55°C 復(fù)性 45s，72°C延伸 4min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
[0039](3)獲得重組病毒
[0040]取重組穿梭載體Bacmid(7~10 μ g)及脂質(zhì)體8 μ I,并分別加入無血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至100 μ 1，將兩種溶液混勻，室溫靜置20min，另取生長良好的Bm細(xì)胞，用無血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基洗2~3次，再加入800 μ I無血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基及準(zhǔn)備好的重組Bacmid/脂質(zhì)體復(fù)合物200 μ 1，28°C培養(yǎng)3~5h后，吸掉上清，加入2ml含有10%血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，28°C繼續(xù)培養(yǎng)60h后，在顯微鏡下觀察Bm細(xì)胞是否有感染的癥狀，吸取細(xì)胞上清，獲得重組病毒粒子，復(fù)感家蠶細(xì)胞，獲得重組病毒。
[0041](4)抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶dck基因在家蠶幼蟲中表達(dá)[0042]將重組病毒液定量至2X 107NPB/ml并準(zhǔn)備五齡第一天的家蠶幼蟲，第一區(qū)經(jīng)口添食重組病毒液，每頭蠶添食8 μ 1，分別以相同濃度的野生型桿狀病毒和飼水區(qū)作為對(duì)照。每天觀察家蠶的感染情況，并分別在第6天，第7天后收集蠶血，純化多角體，并從中抽提病毒DNA, PCR 驗(yàn)證(引物為 DCK-F/DCK-R)。
[0043](5)表達(dá)產(chǎn)物的純化
[0044]細(xì)胞裂解
[0045]收集感染的蠶的血液，加入LE Buffer (50mM Na2PO4, 300mM Nacl, pH8.0),超聲破碎 20min, 12000r/min 離心 20min,取上清。
[0046]N1-NTA親和層析
[0047]先以5 倍 NTA 體積的 LE buffer 平衡(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，ρΗ8.0,流速 lml/min),然后用 IOmM 咪唑的 Wash buffer (50mM Na2PO4, 300mM Nacl, IOmMimidazole, pH8.0)洗脫，最后用 250mM 咪唑的 Elution Buffer (50mM Na2PO4, 300mMNacl, 250mM imidazole, pH8.0)洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。選定以含250mM濃度咪唑的Elution buffer過柱洗脫得到目的蛋白，純度在90%以上。
[0048]實(shí)施例2
[0049]脫氧胞苷激酶SDS-PAGE鑒定
[0050]樣品處理:取感染的家蠶血液，加入蛋白上樣緩沖液(4%SDS，12%甘油，50mM 1^8，2%巰基乙醇，0.01%溴酚藍(lán)，611 Hcl調(diào)PH調(diào)到6.8)，放入100°C水中煮沸IOmin, 5000rpm 離心 lmin。
[0051]SDS-PAGE:制備12%濃度的分離膠，5%的濃縮膠；樣品處理后上樣電泳，考馬斯亮藍(lán)染色30min,再用脫色液脫色。
[0052]SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3所示，其中Polh蛋白的分子量為29KD，DCK分子量為32KD。分析結(jié)果說明多角體與脫氧胞苷激酶DCK均得到了表達(dá)。
[0053]實(shí)施例3
[0054]脫氧胞苷激酶Western-blot鑒定
[0055]SDS-PAGE 電泳
[0056]轉(zhuǎn)膜:取下SDS-PAGE膠，甲醇預(yù)浸透硝酸纖維素膜(NC)、定性濾紙以及纖維墊，放在電泳槽轉(zhuǎn)移液內(nèi)，以夾三明治方式，依次放入纖維墊，三層濾紙，膠體，硝酸纖維素膜，三層濾紙，纖維墊，夾牢并徹底清除內(nèi)部的氣泡，放入裝滿轉(zhuǎn)移緩沖液的槽中，正確接通電極，150mA恒流轉(zhuǎn)膜2h ;抗體標(biāo)記:將轉(zhuǎn)有蛋白的NC膜取出，浸入抗體封閉液中，搖床上室溫孵育30min，然后用TBST洗膜3次，每次lOmin，將NC膜浸入His —抗(1:3000)孵育液，搖床上室溫孵育Ih，以TBST洗膜，方法同前，之后將NC膜浸入羊抗鼠二抗(I:5000)孵育液中，搖床上室溫孵育lh，再以TBST洗膜，方法同前。顯色成像:利用辣根過氧化物酶顯色劑的化學(xué)熒光方法來檢測蛋白的位置和大小。
[0057]Western-blot檢測結(jié)果如圖4所示，目的蛋白DCK分子量為32KD，進(jìn)一步表明DCK在家蠶幼蟲中得到了表達(dá)。
[0058]上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，步驟包括: (1)將通過修飾加有His標(biāo)簽的dck基因及polh基因分別克隆到雙啟動(dòng)子表達(dá)載體以構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體； (2)將所述重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中,提取質(zhì)粒,獲得重組穿梭載體Bacmid ； (3)所述Bacmid在轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，獲得重組病毒多角體； (4)所述重組病毒多角體定量后以經(jīng)口接種五齡家蠶幼蟲的方式，在家蠶幼蟲中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過N1-NTA親和層析的方法純化，獲得具有酶活性的脫氧胞苷激酶DCK。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法,其特征在于,所述步驟(1)雙啟動(dòng)子表達(dá)載體為pFastBacDual。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的 方法，其特征在于，所述dck基因及polh基因分別插入雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pFastBacDual的PplO和Pph的MCS的下游處構(gòu)建重組雙啟動(dòng)子表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述步驟(2)中重組穿梭載體Bacmid是通過將min1-Tn7轉(zhuǎn)座子從雙啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)位到穿梭載體Bacmid上mini_attTn7靶位點(diǎn)，得到Gen抗性，再通過通過涂布于含有Kan，Gen, Tet，IPTG，X-gal的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑過夜振蕩培養(yǎng)，堿裂解法提取獲得的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述在步驟(3)中轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體介導(dǎo)是指重組Bacmid及脂質(zhì)體，分別加入無血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，將兩種溶液混勻，室溫靜置，另取生長良好的Bm細(xì)胞，加入無血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基及重組Bacmid/脂質(zhì)體復(fù)合物，培養(yǎng)一段時(shí)間，吸掉上清，加入含有10%血清的Bm細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述步驟(3)中定量的重組病毒多角體的濃度為2X107NPB/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述步驟(3)中重組病毒多角體的添食量為每頭蠶8 μ 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用雙啟動(dòng)子表達(dá)載體在家蠶幼蟲中表達(dá)純化抗腫瘤藥物脫氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，所述N1-NTA親和層析純化是指收集受感染的家蠶血液，超聲破碎，離心取上清，與鎳離子親和層析柱結(jié)合，用不同濃度的咪唑緩沖液進(jìn)行洗滌，用IOmM的咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，用250mM的咪唑緩沖液洗脫重組蛋白。
【文檔編號(hào)】C12N9/12GK103525779SQ201310451398
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】徐家萍, 高娟, 王文兵, 鮑先巡, 劉明輝 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)