一種發(fā)酵酶解制備幾丁聚糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵酶解制備幾丁聚糖的方法，包括如下步驟：將蟹殼或蝦殼干燥、粉碎；發(fā)酵；酶解脫鈣和脫蛋白；酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。本發(fā)明的酶解工藝與現(xiàn)有技術(shù)制相比，脫鈣與脫蛋白在同一步驟中實(shí)現(xiàn)，大大提高生產(chǎn)效率，無須使用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，耗能低，無污染，更加環(huán)保。酶解后的游離鈣溶液經(jīng)回收后可以制備成有機(jī)鈣制劑，這樣所有的產(chǎn)物都能夠被合理利用產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)價值。
【專利說明】一種發(fā)酵酶解制備幾丁聚糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及幾丁聚糖制備方法，屬于制造領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]甲殼素是一種天然含氮多糖物質(zhì)，廣泛存在與無脊椎動物的外殼或角質(zhì)層中，尤其是蝦蟹類的外殼中。甲殼素很容易獲得，可再生，是僅次于纖維素的天然均聚物，但是因分子內(nèi)部有很強(qiáng)的氫鍵作用，溶解性低，應(yīng)用范圍受到限制。
[0003]甲殼素脫乙酰后生成殼聚糖。目前殼聚糖的制備多采用化學(xué)法和酶解法脫乙酰?；瘜W(xué)法脫乙酰反應(yīng)中，影響脫乙酰的因素很多，但是主要影響因素包括:堿液濃度、反應(yīng)溫度和時間。一般來說，提高反應(yīng)溫度和延長反應(yīng)時間均可提高脫乙酰度，但是會導(dǎo)致甲殼素主鏈降解增加，從而影響產(chǎn)品的粘度和分子量。通入氮?dú)饪梢栽谝欢ǔ潭壬蠝p緩主鏈的降解。由于化學(xué)法使用的堿液濃度高，反應(yīng)時間長，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，環(huán)境污染嚴(yán)重。
[0004]酶解法不會降解主鏈，并且無污染，具有重要的研究開發(fā)價值。影響酶解的因素很多，主要包括PH值和溫度。文獻(xiàn)記載最適宜PH值4-8，最適宜溫度30-70°C (《甲殼酶特性與應(yīng)用研究》萬云洋等《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2003 vol 15 N0.6)。迄今為止發(fā)現(xiàn)的真菌甲殼質(zhì)脫乙酰酶(CDA)都是糖蛋白，且有良好的熱穩(wěn)定性。但是不同來源CDA的存在位置、最適宜PH值(PH4.5-12)、碳水化合物含量、相對分子質(zhì)量及離子影響等有較大的差異。
[0005]迄今報道的CDA基本都來源于真菌。真菌來源的CDA主要作用是自身細(xì)胞壁的合成，最適底物一般為甲殼寡糖，對甲殼質(zhì)的活性較低，不適合用酶法脫乙酰生產(chǎn)殼聚糖。真菌來源的CDA來源廣泛，獲取容易，成本相對較低。因此如何能夠?qū)⒄婢鷣碓吹腃DA用于制備殼聚糖成為本領(lǐng)域技術(shù)人員急需解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種新的幾丁聚糖制備方法，所述的方法能夠較現(xiàn)有技術(shù)更節(jié)能環(huán)保。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供一種用真菌來源的CDA制備幾丁聚糖的方法，所述的方法能夠解決現(xiàn)有技術(shù)CDA不適于生產(chǎn)幾丁聚糖的技術(shù)難題。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種安全的幾丁聚糖制備方法，所述的方法制得的幾丁聚糖無強(qiáng)酸或強(qiáng)堿殘留，產(chǎn)品更安全。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供一種具有市場競爭力的幾丁聚糖，所述的產(chǎn)品不因工藝的改進(jìn)而增加生產(chǎn)成本。
[0010]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
干燥、超微粉碎、發(fā)酵；酶解脫鈣和蛋白、過濾；酶解脫乙酰、水洗干燥即得。
[0011]本發(fā)明采用制備方法對脫鈣前的蟹殼或蝦殼進(jìn)行預(yù)處理，然后再進(jìn)行酶解脫鈣和脫蛋白。
[0012]為增強(qiáng)脫鈣和脫蛋白效果，本發(fā)明優(yōu)選的將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5~1.0mm顆粒，顆粒過小則增加生產(chǎn)成本，顆粒過大效果較差。發(fā)明人經(jīng)過多次試驗(yàn)及經(jīng)驗(yàn)，最終確定0.5~1.0mm顆粒范圍達(dá)到脫鈣和成本的最佳性價比。
[0013]發(fā)明人提供大量實(shí)驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)多種乳酸菌按照一定的配比組合進(jìn)行發(fā)酵后脫鈣效果更好，而采用乳雙歧桿菌(B.lactis)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)和瑞士乳桿菌(L.helviticus)三種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵效果較好；采用此三種乳酸菌配比后發(fā)酵效果最好，當(dāng)三種乳酸菌以重量比2:6:5進(jìn)行組合時，游離鈣含量較單一乳酸菌發(fā)酵后提高10%~20%。優(yōu)選的，乳酸菌占蟹殼或蝦殼原料重量比為0.02~0.06%。
[0014]本發(fā)明采用高溫滅菌的方法達(dá)到殺菌消毒的目的，同時也去除酶解液中的乳酸菌。
[0015]本發(fā)明的酶解采用復(fù)合酶解方法，經(jīng)過篩選后，最終發(fā)現(xiàn)用木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶進(jìn)行酶解較其他蛋白酶具有更好的效果。當(dāng)然，選用其他蛋白酶進(jìn)行酶解也能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明工藝中最佳酶解方案是將蟹殼或蝦殼粉碎后的原料中加入4-8倍重量體積比的水制成料液，加入乳酸菌發(fā)酵36h，然后70~100°C，20min ;發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2~5的復(fù)合蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5~6.5，40~60°C攪拌I~2h ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取。
[0016]酶解殼料所用的復(fù)合蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.05~0.2%為佳。
[0017]酶解除具有脫蛋白的效果外，還具有脫鈣的作用。酶解可以將發(fā)酵后的產(chǎn)品中鈣元素游離出來，達(dá)到脫鈣效果。
[0018]酶解脫蛋白后，過濾，濾液回收干燥得有機(jī)鈣。殘渣中加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比(g/1) I~3:1~6，30~32°C，48~72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0019]所述的可以從公開市場上購得，也可以通過構(gòu)巢曲霉菌發(fā)酵后制得。
[0020]所述的甲殼質(zhì)脫乙酰酶制備方法如下:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
[0021]經(jīng)過酶解脫鈣和脫蛋白后，去除了原料中的鈣離子、蛋白質(zhì)其它有機(jī)物質(zhì)。
[0022]本發(fā)明所述的幾丁聚糖脫乙酰度高達(dá)95%以上。
[0023]本發(fā)明的產(chǎn)物與任何一種或一種以上藥劑學(xué)上輔料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、甘氨酸、甘露醇、甘氨酸等混合制成的各種劑型，例如，可制成片齊?、緩釋片、滴丸、顆粒齊?、膠囊齊?、微粒劑。優(yōu)選劑型為膠囊劑或顆粒劑。
[0024]本發(fā)明的酶解工藝與現(xiàn)有技術(shù)制相比，脫鈣與脫蛋白在同一步驟中實(shí)現(xiàn)，大大提高生產(chǎn)效率，無須使用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，耗能低，無污染，更加環(huán)保。酶解后的游離鈣溶液經(jīng)回收后可以制備成有機(jī)鈣制劑，這樣所有的產(chǎn)物都能夠被合理利用產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)價值。

【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/1) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，35°C，PH6.0,發(fā)酵72h。
[0026]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.5_顆粒，加入4倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.02%,發(fā)酵36h，然后70~100°C，20min ;發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的復(fù)合蛋白酶，蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.05%，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5，40°C攪拌Ih ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:1，30°C，48h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0027]實(shí)施例2
制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，30°C，PH7.0，72h。
[0028]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至1.0mm顆粒，加入8倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.06%,發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的復(fù)合蛋白酶，蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.2%，加檸檬酸調(diào)PH值至6.5，60°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1: 6，320C，72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0029]實(shí)施例3 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，33°C，PH6.5，96h。
[0030]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.5mm顆粒，加入8倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.04%,發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1: 5的復(fù)合蛋白酶，蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.1%，加檸檬酸調(diào)PH值至6.5，60°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比3: 6，31°C，72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0031]實(shí)施例4 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，32°C，PH6.6，72h。
[0032]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至1.0mm顆粒，加入4倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.05%,發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2的復(fù)合蛋白酶，蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.15%，加檸檬酸調(diào)PH值至6，40°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:3，320C ,48~72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0033]實(shí)施例5 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，34°C，PH6.l，72h。
[0034]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.8mm顆粒，加入6倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.03%,發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:3的復(fù)合蛋白酶，蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.12%，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5，50°C攪拌2h ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:5，31.5°C，64h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0035]實(shí)施例6 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，32°C，PH6.0，80h。
[0036]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.9mm顆粒，加入5倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.06%,發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2.5的復(fù)合蛋白酶，蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.18%，加檸檬酸調(diào)PH值至6.5，55°C攪拌Ih ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比3:5，320C，56h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
[0037]實(shí)施例7 制備甲殼質(zhì)脫乙酰酶:
(1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 二氯化鈷(0.01mol/l) 10ml，水 1000ml ；
(2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，35°C，PH6.0，96h。
[0038]將蟹殼或蝦殼干燥粉碎至0.6_顆粒，加入7倍重量體積比的水制成料液，加入乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5的乳酸菌，乳酸菌占原料重量比為0.05%,發(fā)酵液加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:4的復(fù)合蛋白酶，蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?br> 0.08%， 加檸檬酸調(diào)PH值至5.5，45°C攪拌1.5h ;分離液體，殘渣再次重復(fù)提取，過濾，棄濾液，留取殘渣，加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比1:3,30°C，72h，0.2MPa，然后120°C滅菌20min，干燥即得幾丁聚糖。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵酶解制備幾丁聚糖的方法，包括如下步驟: (1)將蟹殼或蝦殼干燥、粉碎； (2)發(fā)酵 (3)蛋白酶酶解脫鈣和脫蛋白； (4)酶解脫乙酰、水洗干燥粉碎即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將蟹殼或蝦殼粉碎至0.5~1.0mm大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵采用乳酸菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的乳酸菌是乳雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌復(fù)合菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的乳酸菌重量比是乳雙歧桿菌:保加利亞乳桿菌:瑞士乳桿菌=2:6:5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的制備方法，其特征在于，乳酸菌占蟹殼或蝦殼原料重量比為 0.02 ~0.06%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的酶解是發(fā)酵液中加入菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶重量比1:2~5的復(fù)合蛋白酶，加檸檬酸調(diào)PH值至5.5~6.5，40~60 V攪拌I~2h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述的蛋白酶占?xì)ち现亓勘葹?.05 ~0.2%ο
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的脫乙酰是殘渣中加入含有甲殼質(zhì)脫乙酰酶的發(fā)酵液脫乙酰，甲殼質(zhì)與發(fā)酵液的重量體積比I~3:1~6，30~320C，48 ~72h，0.2MPa，然后 120°C滅菌 20min，干燥即得。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述的甲殼質(zhì)脫乙酰酶制備方法是: (1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉Sg，殼聚糖15g，葡萄糖30g，磷酸二氫鉀2g，無水硫酸鎂Ig, 0.01mol/l 的二氯化鈷 10ml，水 100ml ； (2)發(fā)酵條件:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，接種構(gòu)巢曲霉菌，30~35°C，PH6.0~7.0，72~96h。
【文檔編號】C12P19/26GK104046666SQ201310450576
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】李瑩, 楊國元, 田志同, 白潔, 李雨田, 李卉婷, 苗勝昆 申請人:天津天獅生物發(fā)展有限公司