一種可控的基于離子通道的大腸桿菌耐酸系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種可控的基于離子通道的大腸桿菌耐酸系統(tǒng)及其應(yīng)用，基于大腸桿菌原有的谷氨酰胺介導(dǎo)的耐酸性系統(tǒng)，通過(guò)敲除原系統(tǒng)中的谷氨酸脫羧酶GadA和GadB，使得大腸桿菌在有谷氨酰胺存在的極度酸性條件下，其存活率與銨離子通道蛋白的表達(dá)量及培養(yǎng)基中銨離子的濃度相關(guān)，這樣就可以通過(guò)調(diào)控胞外銨離子濃度和/或胞內(nèi)銨離子通道蛋白的表達(dá)量來(lái)控制大腸桿菌的耐酸性，從而控制大腸桿菌在酸性條件下的存活。該耐酸系統(tǒng)還可以作為一個(gè)模式系統(tǒng)用于測(cè)定離子通道蛋白的底物和功能。
【專利說(shuō)明】-種可控的基于離子通道的大腸桿菌耐酸系統(tǒng)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大腸桿菌的一種耐酸性系統(tǒng)，特別涉及通過(guò)一種可控的基于離子通道 的耐酸性系統(tǒng)控制大腸桿菌的耐酸性的方法，屬于微生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 耐酸性是大腸桿菌（E.coli)非常重要的性質(zhì)，因?yàn)槟c道細(xì)菌必須先通過(guò)胃里的極 度酸性環(huán)境并存活，才能進(jìn)入小腸。
[0003] 目前已知大腸桿菌有四個(gè)可誘導(dǎo)的耐酸性系統(tǒng)來(lái)抵抗強(qiáng)酸性環(huán)境。其中，第二個(gè) 耐酸性系統(tǒng)（acid resistance system2，AR2)需要使用培養(yǎng)基中的谷氨酸（Glu)或者谷氨 酰胺（Gln)，分別對(duì)應(yīng)依賴于谷氨酸的耐酸性系統(tǒng)（Glu-dAR)和依賴于谷氨酰氨的耐酸性 系統(tǒng)（Gln-dAR)。已知的AR2的主要功能蛋白包括逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC，谷氨酰胺酶YbaS，以 及兩個(gè)同工的谷氨酸脫羧酶GadA和GadB。其中，GadC可以逆向轉(zhuǎn)運(yùn)Gin和氨基丁酸 (Y -aminobutyric acid, GABA)，或者 Gin 和 Glu，或者 Glu 和 GABA ;YbaS 催化 Gin 水解生 成Glu和銨（主要以NH4+形式存在，但是有少量NH3，兩者之間存在一定的電離平衡）；GadA 和GadB催化Glu的脫羧反應(yīng)生成GABA和C0 2。在野生型菌株中，當(dāng)靜止期大腸桿菌細(xì)胞處 于PH2. 5的酸性條件下且細(xì)胞外的培養(yǎng)基中有Gin時(shí)，如圖1所示，細(xì)胞外pHext為2. 5,細(xì) 胞內(nèi)pHint為4. 2,細(xì)胞內(nèi)外的H+電化學(xué)梯度驅(qū)動(dòng)H+進(jìn)入細(xì)胞，需要通過(guò)Gln-dAR不斷排出 細(xì)胞內(nèi)的H+才能保持pHint不會(huì)降低到導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Gin被GadC轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，然后被 細(xì)胞內(nèi)的YbaS水解生成Glu和銨（NH 4+)，該過(guò)程可以消耗細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)H+，但是由于谷氨酸 的Y-C00H和NH4+的電離平衡，有可能重新釋放出H+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，所以該反應(yīng)是否提供了 耐酸性取決于產(chǎn)物的后續(xù)利用。GadA和GadB催化Glu脫羧反應(yīng)生成C0 2和GABA，該過(guò)程消 耗細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一個(gè)H+，C02擴(kuò)散出細(xì)胞。GABA和少部分Glu被GadC轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，同時(shí)每排 出一分子的GABA或者Glu，GadC也向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入一分子的谷氨酰胺。也就是說(shuō)，GadC 向細(xì)胞外排出脫羧產(chǎn)物GABA作為向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)新的氨基酸底物的交換，并且在該過(guò)程中 排出細(xì)胞內(nèi)的H+，C0 2作為氣體分子擴(kuò)散出細(xì)胞。如果培養(yǎng)基中沒(méi)有Gln，但是有Glu存在， 該系統(tǒng)同樣可以利用Glu耐酸，只是不需要如上所述YbaS催化的那一步。
[0004] 上述谷氨酰胺介導(dǎo)的耐酸性系統(tǒng)的耐酸能力很強(qiáng)，可以保護(hù)大腸桿菌細(xì)胞在有谷 氨酰胺存在的極度酸性（PH2. 0-2. 5)條件下存活2h (存活率?100%)。由于該系統(tǒng)能以足 夠快的速度排出細(xì)胞內(nèi)的H+，維持大腸桿菌細(xì)胞可以存活的胞內(nèi)pH值，使得其它離子通道 的功能不能表現(xiàn)出對(duì)耐酸存活率上的影響，所以不適用于人為調(diào)節(jié)控制大腸桿菌的耐酸能 力和測(cè)定離子通道蛋白的底物和功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種可控的基于離子通道的耐酸系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)人為調(diào)控 大腸桿菌的耐酸能力，并可用以測(cè)定一些離子通道蛋白的底物及其功能。
[0006] 本發(fā)明可控的基于離子通道的大腸桿菌耐酸系統(tǒng)，是通過(guò)下述方法構(gòu)建的：
[0007] 1)構(gòu)建大腸桿菌gadA和gadB基因雙缺陷菌株；
[0008] 2)構(gòu)建gadC表達(dá)載體和amtB表達(dá)載體；
[0009] 3)用步驟2)構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化步驟1)得到的雙缺陷菌株，由此獲得耐酸性可 控的大腸桿菌菌株。
[0010] 本發(fā)明的可控的基于離子通道的大腸桿菌耐酸系統(tǒng)，涉及大腸桿菌原有的谷氨酰 胺介導(dǎo)的耐酸性系統(tǒng)（glutamine-dependent acid resistance system, Gln-dAR)，通過(guò)敲 除原系統(tǒng)中的谷氨酸脫羧酶（GadA和GadB)，使得大腸桿菌在有谷氨酰胺存在的極度酸性 條件下，其存活率與銨離子通道蛋白的表達(dá)量及培養(yǎng)基中銨離子的濃度相關(guān)，這樣就可以 通過(guò)調(diào)控胞外銨離子濃度和/或胞內(nèi)銨離子通道蛋白（AmtB)的表達(dá)量來(lái)控制大腸桿菌的 耐酸性。
[0011] 該人造耐酸系統(tǒng)的工作機(jī)制如圖4所示，細(xì)胞外pHext為2. 5,細(xì)胞內(nèi)pHint為4. 2， 細(xì)胞內(nèi)外的H+電化學(xué)梯度驅(qū)動(dòng)H+進(jìn)入細(xì)胞，需要通過(guò)耐酸性系統(tǒng)不斷排出細(xì)胞內(nèi)的H+才 內(nèi)保持pHint不會(huì)降低導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)的YbaS催化谷氨酰胺水解產(chǎn)生谷氨酸和銨， 該過(guò)程消耗細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一個(gè)H+，但是由于谷氨酸的Y-C00H和銨的電離平衡，有可能重新釋 放出H+進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，所以該反應(yīng)是否提供了耐酸性取決于產(chǎn)物的后續(xù)利用。GadC每排出一 分子谷氨酸同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入一分子的谷氨酰胺，但是逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程不能把細(xì)胞內(nèi)的 H+排出胞外。如果細(xì)胞外NH 4+濃度很低，NH4+通過(guò)AmtB排出胞外，從而把細(xì)胞內(nèi)的H+排出 胞外。
[0012] 上述步驟1)可以通過(guò)P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)和位點(diǎn)特異性重組的方法刪除gadA基因和 gadB基因。
[0013] 上述步驟2)中所述的gadC表達(dá)載體和amtB表達(dá)載體可以是這兩個(gè)基因位于同 一個(gè)載體上，也可以是分別位于不同的兩個(gè)載體上。表達(dá)gadC基因的啟動(dòng)子可以選擇組成 型啟動(dòng)子IV sl_ ;表達(dá)amtB基因可以采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如受IPTG調(diào)控的啟動(dòng)子Ptrc。
[0014] 上述步驟3)獲得的耐酸性可控的大腸桿菌菌株表示為A gadA A gadB(p_gadC， p-amtB)菌株，由于刪除了谷氨酸脫羧酶GadA和GadB，這樣在極度酸性（pH2. 0-2. 5)條件 下，用質(zhì)粒表達(dá)的谷氨酰胺/谷氨酸：GABA逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC和細(xì)胞原有的谷氨酰胺酶 YbaS可以利用谷氨酰胺，生成谷氨酸和銨，為大腸桿菌細(xì)胞提供非常有限的耐酸性，同時(shí)， 用質(zhì)粒載體表達(dá)AmtB很大程度增加了大腸桿菌細(xì)胞的耐酸性，但外加一定濃度的銨會(huì)抑 制該增強(qiáng)作用。
[0015] 基于上述大腸桿菌的可控的基于離子通道的耐酸系統(tǒng)，可以：1)通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 中的銨離子濃度(而不改變培養(yǎng)基的低pH值)，和/或菌體內(nèi)部銨離子通道蛋白（AmtB)的 表達(dá)量，控制大腸桿菌的存活率；2)在一定條件下增加大腸桿菌的耐酸性；3)將耐酸系統(tǒng) 作為一個(gè)模式系統(tǒng)用于測(cè)定離子通道蛋白的底物和功能。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明提供了一種可調(diào)控的大腸桿菌耐酸性系統(tǒng)，便于控制大腸桿菌細(xì)胞在酸性 條件下的存活。在生產(chǎn)應(yīng)用中，大腸桿菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的酸，該系統(tǒng)可以在銨濃度很低的 條件下為細(xì)胞提供耐酸性，保證細(xì)胞存活；當(dāng)發(fā)酵完成，需要?dú)⑺兰?xì)胞的時(shí)候，可以通過(guò)添 加氯化銨或少量氨水(不改變pH值）破壞細(xì)胞的耐酸性，從而殺死細(xì)胞。
[0018] 另外，我們希望這個(gè)系統(tǒng)可以應(yīng)用于研究其它的離子通道，比如AmtB同源的Amt/ MEP/Rh家族的銨/氨通道蛋白，甚至別的參與調(diào)解pH的離子通道蛋白。Amt/MEP/Rh家族的 銨/氨通道蛋白的底物經(jīng)常存在爭(zhēng)議，因?yàn)殇@在水中的電離平衡使得同時(shí)存在NH4+和NH3， 只有當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)底物是NH 4+時(shí)，AmtB才能在我們構(gòu)建的系統(tǒng)中增強(qiáng)細(xì)胞的耐酸性。如果用其它 Amt/MEP/Rh家族蛋白替代AmtB，可以通過(guò)它們對(duì)耐酸性的影響推斷其轉(zhuǎn)運(yùn)底物。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是依賴于谷氨酰氨的耐酸性系統(tǒng)（Gln-dAR)的機(jī)制模型示意圖。細(xì)胞外pHext 為2. 5,細(xì)胞內(nèi)pHint為4. 2。其中，括號(hào)內(nèi)的_1，0，+1表示在所處的pH條件下，對(duì)應(yīng)分子主 要的電離形式所帶的電荷。
[0020] 圖2顯示了表達(dá)銨載體蛋白AmtB對(duì)A gadA A gadB (p-gadC)菌株依賴于谷 氨酰胺的耐酸性（Gln-dAR)功能的影響。其中，WT表示野生型菌株MG1655, BD9026是 A gadA A gadB (p-gadC)菌株，BD9047 是 A gadA A gadB (p-gadC, p-amtB)菌株(誘導(dǎo)表達(dá)野 生型AmtB)。
[0021] 圖3顯示了細(xì)胞外銨濃度對(duì)野生型菌株MG1655和A gadA A gadB (p-gadC, p-amtB) 菌株耐酸性的影響。
[0022] 圖4顯示了 A gadA A gadB (p-gadC, p-amtB)菌株的獨(dú)立于谷氨酸脫羧酶之外的 人造耐酸性系統(tǒng)的工作機(jī)制。其中，括號(hào)內(nèi)的_1，〇, +1表示在所處的pH條件下，對(duì)應(yīng)分子 主要的電離形式所帶的電荷。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖，通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但并不因此限制本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0024] 1.具有可控的基于離子通道耐酸系統(tǒng)的菌株構(gòu)建
[0025] 1) A gadA/B雙突變菌株BD9025的獲得
[0026] 從野生型大腸桿菌MG1655 (來(lái)自美國(guó)ATCC)的基因組中刪除了編碼谷氨酸脫羧酶 GadA和GadB的基因gadA和gadB。具體方法如下：
[0027] 通過(guò)P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)從已有的供體菌株JW3485-1 (由位于美國(guó)耶魯大學(xué)的大腸桿 菌遺傳庫(kù)存中心（Coli Genetic Stock Center，CGSC)提供）將 A gadA:: kan 導(dǎo)入 MG1655， 然后通過(guò)位點(diǎn)特異性重組去除其中的kan基因；然后從供體菌株JW1488-7 (來(lái)自CGSC)將 A gadB: :kan通過(guò)P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入該菌株，再次通過(guò)位點(diǎn)特異性重組去除其中的kan基 因，得到A gadA/B雙突變菌株BD9025。
[0028] 2)gadC和amtB表達(dá)載體的構(gòu)建
[0029] 2. 1構(gòu)建表達(dá)gadC的質(zhì)粒pKU9003
[0030] 以MG1655染色體DNA為模板，利用引物XP142和引物XP143通過(guò)PCR得到gadC基 因，用 KpnI/Xbal 酶切后替換質(zhì)粒 pZE12_luc (Lutz R, and Bujard H. (1997) Independent and tight regulation of transcriptional units in E.coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il_12regulatory elements. Nucleic Acids Res. 25:1203-1210.)的luc 序列，得到pZE12-gadC。所述引物序列如下：
[0031] 引物 XP142 :5,-CGGGGTACCATGGCTACATCAGTACAGAC-3，（SEQ ID No:l);
[0032] 引物 XP143 :5,-CTAGTCTAGATTAGTGTTTCTTGTCATTC-3，（SEQ ID No:2)。
[0033] 用于表達(dá)gadC基因的啟動(dòng)子是，其序列如序列表中SEQ ID N〇:3所示，是 通過(guò)如下引物退火得到：
[0034] 引物 XP127 :5，-CTAGCTCGAGACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGAC ATAAATACCACTGGC-3' （SEQ ID No:4);
[0035] 引物 XP 128 :5，-CGGGGTACCGGTITCCTTTGCATACCCTGCTGATGTGCTCATTATAACCGCCAGT GGTATTTATGTCAAC-3' （SEQ ID No:5)。
[0036] 上述引物XP127和XP128退火得到序列后，用Xhol/Kpnl酶切，替換 pZE12-gadC原有的啟動(dòng)子，得到質(zhì)粒pKU9003。序列通過(guò)測(cè)序鑒定。
[0037] 2. 2構(gòu)建表達(dá)amtB的質(zhì)粒pKU9007
[0038] 以MG1655染色體DNA為模板，用引物XP162和引物XP80通過(guò)PCR得到amtB基因， 然后用 XP162 和 XP81 再次 PCR 得到 amtB-linker-6H，用 Ncol/Hindlll 酶切后連入 pVTRA (Gene. 172:81-86, 1996)，得到質(zhì)粒 pKU9007。表達(dá) amtB 的啟動(dòng)子是 Ptrc，受 IPTG 調(diào)控。 [0039] 所用引物序列如下：
[0040] 引物 XP162 :5'-AGAGCCATGGGTAAGATAGCGACGATAAAAACTG-3，（SEQ ID No:6)
[0041] 引物 XP80 :5，-ATCCGCCTGCGCCGGCTGCTGCGCCTGATCCGCGTTATAGGCAITCTCGC-3，（ SEQ ID No:7)
[0042] 引物 XP81 :5，-CCCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGATCCGCCTGCGCCGGCTGCTG-3 '（ SEQ ID No:8)
[0043] 3)實(shí)驗(yàn)菌株和對(duì)照菌株的獲得
[0044] 將質(zhì)粒pKU9003和pVTRA轉(zhuǎn)入菌株BD9025,得到對(duì)照菌株BD9026 ;將質(zhì)粒pKU9003 和PKU9007轉(zhuǎn)入菌株BD9025,得到菌株BD9047。
[0045] 上述構(gòu)建的菌株和質(zhì)粒列于表1中。
[0046] 表1質(zhì)粒和菌株列表
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 一種構(gòu)建大腸桿菌的可控耐酸系統(tǒng)的方法，包括以下步驟： 1) 構(gòu)建大腸桿菌gadA和gadB基因雙缺陷菌株； 2) 構(gòu)建gadC表達(dá)載體和amtB表達(dá)載體； 3) 用步驟2)構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟1)得到的雙缺陷菌株，由此獲得具有可控耐酸 系統(tǒng)的大腸桿菌菌株。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)通過(guò)P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)和位點(diǎn)特異性重 組的方法刪除gadA基因和gadB基因。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)將gadC和amtB基因構(gòu)建在同一個(gè) 表達(dá)載體上，或者構(gòu)建在兩個(gè)不同的表達(dá)載體上。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)構(gòu)建的表達(dá)載體采用組成型啟動(dòng)子 表達(dá)gadC基因，而采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)amtB基因。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述組成型啟動(dòng)子是，所述誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子是Ptrc。
6. -種調(diào)控大腸桿菌耐酸性的方法，根據(jù)權(quán)利要求1?5任一所述的構(gòu)建大腸桿菌的 可控耐酸系統(tǒng)的方法獲得具有可控耐酸系統(tǒng)的大腸桿菌菌株，然后通過(guò)調(diào)節(jié)胞外銨離子濃 度和/或胞內(nèi)銨離子通道蛋白AmtB的表達(dá)量來(lái)調(diào)控該菌株的耐酸性。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104450593SQ201310450356
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】劉歆, 王吉龍, 楊建國(guó), 王憶平 申請(qǐng)人:北京大學(xué)