一株脈孢菌ny-2菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本項(xiàng)發(fā)明微生物農(nóng)藥，具體講是一株四孢脈孢菌NY-2菌株及其應(yīng)用。四孢脈孢菌NY-2（Neurospora?tetrasperma，中文名稱四孢脈孢菌）保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2013年7月16日，保藏號(hào)：CCTCC?M2013346。所述脈孢菌的發(fā)酵產(chǎn)物用于生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑的制備。本項(xiàng)發(fā)明涉及菌株分離自山東安丘采集的牛蒡，通過(guò)PCR擴(kuò)增18S-28SrDNA的ITS區(qū)段，測(cè)序結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，與菌株Neurospora?tetrasperma（Accession?number:FJ176470.1）的相似度為100%。該菌株發(fā)酵產(chǎn)物可用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、來(lái)源充足、周期短、成本低、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)前景較好。
【專利說(shuō)明】一株脈孢菌NY-2菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本項(xiàng)發(fā)明微生物農(nóng)藥，具體講是一株四孢脈孢菌NY-2菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展與人類(lèi)健康、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展緊密聯(lián)系，而高效生物農(nóng)藥的研究則成為新型農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)。通過(guò)高效微生物菌株的發(fā)酵產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物，并將其用于病蟲(chóng)草害的控制是目前創(chuàng)制新型生物農(nóng)藥的重要途徑，具有研發(fā)空間廣、毒性低、特異性強(qiáng)、高效低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)境相容性好、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]脈孢菌(Neurospora)是一類(lèi)多細(xì)胞絲狀真菌,也是一類(lèi)重要的真核模式生物。它的遺傳規(guī)律奇特，代謝途徑多樣，活性機(jī)制獨(dú)特，不僅是遺傳學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究對(duì)象，也日漸成為生產(chǎn)中的工程菌。同時(shí)該菌宿主廣泛，生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性較豐富，開(kāi)發(fā)利用該菌株制備新型生物農(nóng)藥具有高效、無(wú)公害的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本項(xiàng)發(fā)明目的在于提供一株四孢脈孢菌NY-2菌株及其應(yīng)用。
[0005]為充分達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一株脈孢菌NY-2菌株，四孢脈孢菌NY-2 (Neurospora tetrasperma)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏日期:2013年7月16日，保藏號(hào):CCTCC M2013346。將所述脈孢菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-30天，發(fā)酵產(chǎn)物待用。所述發(fā)酵培養(yǎng)基比例為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏3g，蛋白胨5g，蒸餾水1000mL。所述脈孢菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)的產(chǎn)物用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。
[0006]將所述脈孢菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-30天，發(fā)酵產(chǎn)物待用。將發(fā)酵產(chǎn)物用有機(jī)溶劑提取，提取物經(jīng)柱色譜分離后，其產(chǎn)物用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。所述有機(jī)溶劑為:石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇或水中的一種或幾種。所述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離，以石油醚:乙酸乙酯體系梯度洗脫。收集石油醚:乙酸乙酯體積比10:1和5:1的組分I和II可用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。所述層析柱可以采用硅膠柱、反相柱、凝膠柱或大孔樹(shù)脂中的一種或幾種。所述石油醚:乙酸乙酯體系洗脫梯度為100:1至1:1。
[0007]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0008]本發(fā)明所述的脈孢菌NY-2菌株分離自山東安丘采集的牛蒡，通過(guò)PCR擴(kuò)增18S-28SrDNA的ITS區(qū)段，測(cè)序結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，與菌株 Neurospora tetrasperma (Accession number:FJ176470.1)的相似度為 100%。該菌株發(fā)酵產(chǎn)物可用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、來(lái)源充足、周期短、成本低、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)前景較好?！揪唧w實(shí)施方式】
[0009]為闡明對(duì)本項(xiàng)發(fā)明特征的理解，下面結(jié)合一些非限定性的實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。本項(xiàng)發(fā)明所述的四孢脈孢菌NY_2(Neurospora tetrasperma),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期:2013年7月16日，保藏號(hào):CCTCC M2013346，保藏單位地址:武漢市武昌珞珈山。
[0010]實(shí)施例1:鹽堿植物來(lái)源脈孢菌(Neurospora tetrasperma) NY-2菌株分類(lèi)。
[0011]I)菌種培養(yǎng)
[0012]按照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)方法，挑取少量保存于葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基的脈孢菌(Neurospora tetrasperma)NY-2,接種于PDA平板表面，25°C培養(yǎng)7天,初期菌落呈稀疏的網(wǎng)狀，后期形成橙色分生孢子。
[0013]2)菌種初步鑒定
[0014]按照文獻(xiàn)方法(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38，(I): 101-106)，通過(guò)PCR擴(kuò)增18S-28SrDNA的ITS區(qū)段，測(cè)序結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，與菌株 Neurospora tetrasperma (Accession number:FJ176470.1)的相似度為 100%。序列信息如下:
[0015]GTCACCTTAGAAATGGGGGGTTTTACGGCAAGAACCCGCCGCACGACCATAGCGATGTAGAGTTACTACGCTCGGTGTGACTAGCGAGCCCGCCACTGATTTTGAGGGACCGCGGGCAGCCGCGGATCCCCAACGCAAGCAGAGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCTCGCCAGAATACTGGCGAGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTTATTTAAAAGTTTACTCAGAGAGACATAAAATATCAAGAGTTTAGTTTCGGCACTCCGGCGGGCAGCCTCCCGCGAGCGGGAGACCCGAGGATCCGGGAGGACCCGAGGGCCTTTCCGGACCGCCAGCGCCGAGGCAACCGTACGGGTAAGATTCGCGATGGTTTGTGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCA。
[0016]實(shí)施例2:脈抱菌(Neurospora tetrasperma) NY-2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。
[0017]I)發(fā)酵培養(yǎng)
[0018]菌種培養(yǎng):按照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)方法，挑取少量保存于葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基的脈抱菌(Neurosporatetrasperma) NY-2,接種于PDA平板表面，25°C培養(yǎng)7天,作為規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)的菌種，待用。
[0019]切取種子板上的脈孢菌(Neurospora tetrasperma) NY-2菌種適量,投入已滅菌、盛有液體培養(yǎng)基的IOOOmL錐形瓶中，室溫靜置培養(yǎng)22天，隨即以乙酸乙酯滅菌，待用。
[0020]所述液體培養(yǎng)基為馬鈴薯40g/瓶，葡萄糖4g/瓶，酵母浸膏0.6g/瓶，蛋白胨Ig/瓶，蒸餾水200mL/瓶。
[0021]2)發(fā)酵產(chǎn)物分離與純化
[0022]將上述脈孢菌液體培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物以乙酸乙酯提取3次，合并提取液，減壓蒸餾除去溶劑，得到浸膏。將所述發(fā)酵產(chǎn)物的浸提取物膏進(jìn)行柱層析分離，以石油醚:乙酸乙酯體系梯度洗脫。收集石油醚:乙酸乙酯體積比10:1和5:1的組分I和II可用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。
[0023]實(shí)施例3:殺蟲(chóng)活性試驗(yàn)。
[0024]鹵蟲(chóng)(brine shrimp)又名鹽水豐年蟲(chóng)，分類(lèi)學(xué)上屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、無(wú)甲目、鹽水豐年蟲(chóng)科、鹵蟲(chóng)屬。在目前評(píng)價(jià)毒物毒性的生物，如單細(xì)胞藻類(lèi)、輪蟲(chóng)、水蚤中，鹵蟲(chóng)有許多明顯的優(yōu)勢(shì):1適應(yīng)能力強(qiáng)，分布廣；2保藏方便，孵出無(wú)節(jié)幼體方便(水產(chǎn)養(yǎng)殖，2008，4:38-40)。目前鹵蟲(chóng)已廣泛作為毒物急性毒性評(píng)價(jià)的一種指示生物。肖永堂等(廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005, 44 (6): 847-850 )采集自浙江和福建省紅樹(shù)林的共188株海洋真菌代謝產(chǎn)物的鹵蟲(chóng)(brine shrimp)活性進(jìn)行初步研究；胡志IE等(海洋通報(bào)，2000，19(4):36-40.)對(duì)從海域潮間帶分離的1240株放線菌進(jìn)行殺鹵蟲(chóng)活性菌株的篩選，快速篩選出了具有抗齒蟲(chóng)活性的菌株；劉永等(生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2011, 6 (5): 557-560)把鹵蟲(chóng)作為模式生物，測(cè)定了 7種除蟲(chóng)菊酯對(duì)非靶性生物的安全性和生態(tài)毒理評(píng)價(jià)。因此鹵蟲(chóng)作為毒物急性毒性的實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、操作方便、快捷、可行性強(qiáng)。(PlantMedica, 1991，45:31-34 ;農(nóng)藥，2011，50(4):261-262, 275)。
[0025]I)鹵蟲(chóng)的孵化
[0026]實(shí)驗(yàn)前48h將200mg鹵蟲(chóng)卵置于500ml陳化海水中通氣孵化，溫度維持在260C -28°C,自然光照射。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程不對(duì)鹵蟲(chóng)進(jìn)行飼喂。24h后除去卵殼和未孵化的卵，繼續(xù)孵化24h，待用。
[0027]2)待測(cè)樣品制備
[0028]將上述實(shí)施例分離純化的脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)物組分I和II分別加入少量DMSO溶解，配制成 12、10、9、8、7.5、7、5、4、3、2、1、0.5mg/ml 的濃度梯度，待用。
[0029]3)實(shí)驗(yàn)方法
[0030]參照Solis 方法(Bioorg.Med.Chem.Lett.2010, 20:5677-5680)，取鹵蟲(chóng)幼蟲(chóng)懸浮液200yL，加入到96孔板中，每孔含有鹵蟲(chóng)14-16條?？瞻讓?duì)照組和各濃度梯度組分別設(shè)三個(gè)平行?？瞻捉M包括海水對(duì) 照和助溶劑對(duì)照。24°C恒溫培養(yǎng)24h后，在雙目解剖鏡下統(tǒng)計(jì)鹵蟲(chóng)死亡個(gè)數(shù)。
[0031]鹵蟲(chóng)致死活性以校正死亡率表示，公式表示如下:
[0032]校正死亡率(％)=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/ ( 100-對(duì)照死亡率)X 100，并計(jì)算出半致死率LD5tlt5
[0033]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示組分I和II的LD5tl分別為0.145mg/ml0.067mg/ml，具有較好的殺蟲(chóng)活性。
[0034]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā)明所涉及的四孢脈孢菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的殺蟲(chóng)活性，可以用于生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑的制備。
【權(quán)利要求】
1.一株脈孢菌菌株，其特征在于:其為四孢脈孢菌(Neurospora tetrasperma)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)=CCTCC M2013346。
2.如權(quán)利要求1所述的脈孢菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于:將所述脈孢菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-30天。
3.如權(quán)利要求2所述的脈孢菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，其特征在于培養(yǎng)基包括:馬鈴薯200g，葡萄糖20g,酵母浸膏3g,蛋白胨5g,和蒸懼水1000g。
4.一種權(quán)利要求1所述的脈孢菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的脈孢菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述脈孢菌置于發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置或搖床發(fā)酵培養(yǎng)15-30天，得到發(fā)酵產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5所述的脈孢菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，其特征在于:將發(fā)酵產(chǎn)物用有機(jī)溶劑提取，提取物經(jīng)柱色譜分離后，其產(chǎn)物用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。
7.如權(quán)利要求6所述的脈孢菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述溶劑為:石油醚、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇或水中的一種或幾種。
8.如權(quán)利 要求6所述的脈孢菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離，以石油醚:乙酸乙酯體系梯度洗脫。收集石油醚:乙酸乙酯體積比10:1和5:1的組分I和II用于制備生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑。
9.如權(quán)利要求8所述的脈孢菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述層析柱為硅膠、反相、凝膠或大孔樹(shù)脂中的一種或幾種。
10.如權(quán)利要求8所述的脈孢菌作為生物農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述石油醚:乙酸乙酯體系洗脫梯度為100:1至1:1。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK103468590SQ201310433380
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】李昉 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)