一種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從大腸桿菌細胞中制備可溶性蛋白質(zhì)及不溶性蛋白質(zhì)的方法，步驟如下：大腸桿菌細胞懸浮于重懸緩沖液中，并且用0.5%～5%TritonX-100于4℃處理過夜，離心收集菌體沉淀，再利用滲透壓法重復(fù)處理三次，可以使大腸桿菌細胞總體破碎率達到98.9%以上，本工藝中所得上清液為大腸桿菌細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)，所得沉淀為大腸桿菌細胞內(nèi)不溶性蛋白質(zhì)。本發(fā)明所述工藝操作簡便易行，無特殊設(shè)備要求，易于放大規(guī)模，破碎率高。
【專利說明】—種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物、醫(yī)藥及食品工業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種從大腸桿菌細胞中制備可溶性蛋白質(zhì)及不溶性蛋白質(zhì)的方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]大腸桿菌是當前基因工程中最常用的宿主菌之一，可以表達生產(chǎn)重組胰島素、生長激素、干擾素、表皮生長因子等多種極具醫(yī)藥價值的活性蛋白質(zhì)產(chǎn)品。這些重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物在大腸桿菌細胞內(nèi)既可能以可溶性方式存在，也可能以不溶性方式存在。因此，在大規(guī)模制備重組蛋白質(zhì)之前首先必須對大腸桿菌細胞進行破碎處理。
[0005]大腸桿菌細胞壁的最外層為厚約8-lOnm的脂多糖層，內(nèi)層為肽聚糖層，這一結(jié)構(gòu)使大腸桿菌具備較強的抗拉伸和抗剪切能力。因此，采用較溫和的酶法、化學滲透法、凍融法等方法，對大腸桿菌細胞的破碎效率均不高，導致細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放不完全。借助珠磨破碎機和高壓勻漿機等專用設(shè)備處理大腸桿菌細胞，可以得到較好的破碎效率，但是設(shè)備價格較高，能耗較高，破碎過程中還伴有高溫、高噪音、高剪切力。因此，能否開發(fā)出簡便高效溫和的破碎大腸桿菌細胞的工藝，進而區(qū)分出可溶性及不溶性蛋白質(zhì)，成為提取重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的關(guān)鍵性步驟。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法。該方法所述工藝操作簡便，無特殊設(shè)備要求，易于放大規(guī)模，可以使大腸桿菌細胞的破碎率達到98.9%以上，收集上清與沉淀可以分別得到大腸桿菌中的可溶性蛋白與不溶性蛋白質(zhì)。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
(1)室溫下將大腸桿菌菌液離心，收取大腸桿菌菌體，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液(50mM Tris*Cl, IOOmM NaCl, pH 8.0)的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；
(2)向所得重懸菌液中加入TritonX-100，至Triton X-100的最終體積濃度達到
0.5%~5%，混勻后于4°C靜置過夜，8000rpm離心lOmin，分別收集上清液與菌體沉淀；
(3)向所得菌體沉淀中按照每克濕重用IOOml高滲緩沖液(20mMTris-Cl, 2.5mM EDTA,200g/L蔗糖，pH 8.0)的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心,棄去高滲緩沖液,保留所得菌體沉淀；
(4)向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克濕重用IOOml低滲緩沖液(20mMTris*Cl,2.5mM EDTA, pH 8.0)的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，收集低滲緩沖液處理后所得上清液，同時收集菌體沉淀；
(5)向步驟4所得菌體沉淀繼續(xù)按照步驟3、步驟4所述實驗流程用高滲緩沖液與低滲緩沖液重復(fù)處理2次，可以使大腸桿菌細胞總體破碎率達到98.9%以上，合并Triton X-100處理后及低滲緩沖液處理后所得上清液即得大腸桿菌細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)，收集最后一次低滲緩沖液處理后所得沉淀即得大腸桿菌細胞內(nèi)不溶性蛋白質(zhì)。[0009]
本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
I本發(fā)明所用工藝操作簡單易行，無需使用任何昂貴破菌儀器和設(shè)備，成本低廉，易于放大生產(chǎn)規(guī)模，有較好的應(yīng)用潛力和實際應(yīng)用價值；
2本發(fā)明所用分離步驟中無相變發(fā)生，有利于保護所需分離蛋白質(zhì)產(chǎn)物的生物學活性。
[0010]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為一種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法的方框示意圖。
[0012]
【具體實施方式】
[0013]以下通過實施例對本發(fā)明做進一步的描述:
實施例1
配制足量重懸緩沖液(50mM Tris*Cl, IOOmM NaCl，pH 8.0)、高滲緩沖液(20mMTris*Cl,2.5mM EDTA，200g/L 蔗糖，pH 8.0)及低滲緩沖液(20mM Tris*Cl,2.5mM EDTA, pH
8.0)；
室溫下離心大腸桿菌菌液，收取大腸桿菌菌體60毫克，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；向所得重懸菌液中加入Triton X-100，至Triton X-100最終濃度達到0.5%，混勻后于4°C靜置過夜，再以8000rpm離心IOmin,分別收集上清液與菌體沉淀；
隨后對所得菌體沉淀進行滲透壓法處理，方案如下:向所得菌體沉淀中按照每克菌體用IOOml高滲緩沖液的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心,收集高滲緩沖液處理后所得菌體沉淀；向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克沉淀用IOOml低滲緩沖液的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，分別收集低滲緩沖液處理后所得上清液與菌體沉淀。按前述滲透壓法方案用再重復(fù)處理菌體2次，每次保存低滲緩沖液處理后所得上清液。
[0014]取第3次滲透壓法處理后樣品，目測樣品已經(jīng)澄清，取樣于SOOOrpm離心IOmin后，離心管底部未見菌體細胞沉淀。分別用120微升Triton X-100處理前及三次滲透壓法處理后樣品渦旋均勻后進行菌落形成實驗檢測，結(jié)果表明，破碎前樣品形成菌落2670個，破碎后樣品形成菌落29個，細胞破碎率達到98.9%。同時合并Triton X-100處理后及低滲緩沖液處理后所得上清液即得大腸桿菌細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)，收集最后一次低滲緩沖液處理后所得沉淀即得大腸桿菌細胞內(nèi)不溶性蛋白質(zhì)。
[0015]
實施例2
配制足量重懸緩沖液(50mM Tris*Cl, IOOmM NaCl，pH 8.0)、高滲緩沖液(20mMTris*Cl,2.5mM EDTA，200g/L 蔗糖，pH 8.0)及低滲緩沖液(20mM Tris*Cl,2.5mM EDTA, pH
8.0)；
室溫下離心大腸桿菌菌液，收取大腸桿菌菌體60毫克，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻；向所得重懸菌液中加入Triton X-100，至Triton X-100最終濃度達到5%，混勻后于4°C靜置過夜，再以8000rpm離心IOmin,分別收集上清液與菌體沉淀；
隨后對所得菌體沉淀進行滲透壓法處理，方案如下:向所得菌體沉淀中按照每克菌體用IOOml高滲緩沖液的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心,收集高滲緩沖液處理后所得菌體沉淀；向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克沉淀用IOOml低滲緩沖液的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，分別收集低滲緩沖液處理后所得上清液與菌體沉淀。按前述滲透壓法方案用再重復(fù)處理菌體2次，每次保存低滲緩沖液處理后所得上清液。
[0016]取第3次滲透壓法處理后樣品，目測樣品已經(jīng)澄清，取樣于SOOOrpm離心IOmin后，離心管底部未見菌體細胞沉淀。分別用120微升Triton X-100處理前及三次滲透壓法處理后樣品渦旋均勻后進行菌落形成實驗檢測，結(jié)果表明，破碎前樣品形成菌落2860個，破碎后樣品形成菌落25個，細胞破 碎率達到99.1%。同時合并Triton X-100處理后及低滲緩沖液處理后所得上清液即得大腸桿菌細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)，收集最后一次低滲緩沖液處理后所得沉淀即得大腸桿菌細胞內(nèi)不溶性蛋白質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.一種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法，按照下述步驟進行: (1)室溫下將大腸桿菌菌液離心，收取大腸桿菌菌體，按照每克濕重的大腸桿菌菌體用125ml重懸緩沖液的比例加入重懸緩沖液，并且使菌體懸浮均勻； (2)向所得重懸菌液中加入TritonX-100，至Triton X-100的最終體積濃度達到0.5%~5%，混勻后于4°C靜置過夜，8000rpm離心lOmin，分別收集上清液與菌體沉淀； (3)向所得菌體沉淀中按照每克濕重用IOOml高滲緩沖液的比例加入高滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，棄去高滲緩沖液，保留所得菌體沉淀； (4)向高滲緩沖液處理所得菌體沉淀中按照每克濕重用IOOml低滲緩沖液的比例加入低滲緩沖液，并使菌體懸浮均勻；放置20分鐘，混勻后于6000rpm離心，收集低滲緩沖液處理后所得上清液，同時收集菌體沉淀； (5)向步驟4所得菌體沉淀繼續(xù)按照步驟3、步驟4所述實驗流程用高滲緩沖液與低滲緩沖液重復(fù)處理2次，可以使大腸桿菌細胞總體破碎率達到98.9%以上，合并Triton X-100處理后及低滲緩沖液處理后所得上清液即得大腸桿菌細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)，收集最后一次低滲緩沖液處理后所得沉淀即得大腸桿菌細胞內(nèi)不溶性蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于其中步驟(I)中所述的重懸緩沖液為50mM Tris*Cl, IOOmM NaCl，pH 8.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于其中步驟(3)中所述的高滲緩沖液為20mM Tris-Cl, 2.5mM EDTA，200g/L蔗糖，pH 8.00
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從大腸桿菌細胞中區(qū)分可溶性及不溶性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于其中步驟(4)中所述的低滲緩沖液為20mM Tris*Cl,2.5mM EDTA, pH 8.0。
【文檔編號】C12N1/06GK103467564SQ201310431724
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月22日
【發(fā)明者】聞崇煒, 王亞麗 申請人:江蘇大學