一種發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的高產(chǎn)菌株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株Lds.0108，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為：CCTCC?M2013361。該菌株是以德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus，GIM1.155）為出發(fā)菌株，采用低能離子注入法誘變處理細胞，并通過可逆抑制測定法篩選出的突變株，該菌株的生長溫度范圍為35-40℃，最佳生長溫度為37℃；最適pH值為7.0；使用的斜面培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，該菌株以葡萄糖等糖類物質(zhì)為底物，在厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸，提純過程中使用超濾膜過濾和納濾膜過濾去除雜質(zhì)，保證了產(chǎn)品質(zhì)量，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株及其制備方法，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]L-丙氨酸是組成蛋白質(zhì)的氨基酸之一，雖然為人體非必須氨基酸，但卻是人體血液中含量最高的氨基酸，在醫(yī)藥、高分子材料、食品等領(lǐng)域具有廣泛的用途。在醫(yī)藥領(lǐng)域:L-丙氨酸作為醫(yī)藥中間體，是生產(chǎn)維生素B6及L-氨基丙醇的主要原料；與糖代謝密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中是主要的氨基供體，具有重要的生理功能，在臨床上常添加到輸液中；另外，L-丙氨酸還是一種很好的利尿藥。在高分子材料領(lǐng)域:近年來發(fā)現(xiàn)聚乳酸中添加L-丙氨酸可有效提高聚乳酸的性能。在食品領(lǐng)域:L-丙氨酸具有獨特的改善風味的效果，與其他氨基酸配合能加強食品和飲料的風味；添加L-丙氨酸可以明顯提高食品和飲料中蛋白質(zhì)的利用率；還可以改善有機酸的酸味，越來越受到人們的歡迎和重視。
[0003]目前，L-丙氨酸的主要工業(yè)化生產(chǎn)方法就是酶法轉(zhuǎn)化，即通過富有L-天冬氨酸_β -脫羧酶活力的微生物細胞催化L-天冬氨酸而得到。酶法轉(zhuǎn)化工藝的特點是酶活力高，設(shè)備投資小，提取工藝簡單，但其主要原材料L-天冬氨酸價格較貴，造成其生產(chǎn)成本較高。Pascal Hols等報道了利用基因工程手段改造乳酸菌，以葡萄糖、蔗糖或乳糖等為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸(US 6 627 420 BI )，但是基因工程方法構(gòu)建菌種的過程復(fù)雜，技術(shù)要求高，而且得到的基因工程菌株很難穩(wěn)定遺傳和保藏。高理所等報道了利用紫外線和激光等復(fù)合誘變的方法篩選L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株(安徽工程科技學(xué)院學(xué)報，2008，23(I): 19-24)，但是由于紫外線對各種微生物的誘變效應(yīng)不同，加上微生物吸收射線的劑量大小很難把握，且突變后易發(fā)生光修復(fù)作用，所以紫外線誘變的效果不佳，正突變率較低，死亡率較高。
[0004]離子注入生物體誘變育種是人工誘變方法的一種新發(fā)明，是集化學(xué)誘變、物理誘變?yōu)橐惑w的綜合誘變方法。與傳統(tǒng)的誘變源如X射線、Y射線、紫外線以及各種化學(xué)誘變劑相比，離子注入不僅有能量沉積，還有動量傳遞、質(zhì)量沉積及電荷交換等效應(yīng)。低能離子束對微生物的誘變是直接作用和間接作用的共同結(jié)果，其直接作用主要是注入離子的動量傳遞于細胞的表面產(chǎn)生的濺射作用和沉積于細胞內(nèi)部產(chǎn)生的刻蝕損傷，而間接作用主要是注入離子的能量沉積于細胞內(nèi)部產(chǎn)生的自由基所導(dǎo)致的作用。它能夠引起染色體的畸變，導(dǎo)致DNA鏈堿基的損傷、斷裂，從而使遺傳物質(zhì)在基因水平或分子水平上發(fā)生改變或缺失，大幅提聞變異的頻率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株，并利用該菌株來生產(chǎn)L-丙氨酸，使其在生產(chǎn)當中能夠達到突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩(wěn)定的效果。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種高產(chǎn)L-丙氨酸的Zife.0108菌株，該菌株已于2013年8月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為:中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為:CCTCC NO:M 2013361。
[0007]本發(fā)明還提供一種高產(chǎn)L-丙氨酸的Zife.0108菌株制備方法，該方法包括:以乳酸產(chǎn)生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種delbrueckii subsp.bulgaricus、％出發(fā)菌株，活化出發(fā)菌一低能離子注入法誘變處理細胞一可逆抑制測定法篩選生產(chǎn)L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株。
[0008]具體來說該方法包括:
1、活化出發(fā)菌:將出發(fā)菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養(yǎng)基上42°c培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.85 %的生理鹽水制成菌懸液，ImL菌懸液含菌數(shù)約為107，鏡檢菌種健壯且無雜菌后，吸取0.1mL菌懸液均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿上，無菌風吹干制成菌膜，鏡檢無細胞重疊后，進行下一步；
2、低能離子注入誘變法誘變處理細胞:真空條件下注入的離子為N離子，劑量為1.5X1014-5X1016 ions/cm2，能量為15_20keV，脈沖注入，每次注入5s，間隔時間15_40s，注入后用0.5-lmL無菌生理鹽水洗下菌體細胞，采用的是定量誘變，經(jīng)試驗檢測成功率在5% ；
3、可逆抑制測定法篩選生產(chǎn)L-丙氨酸的突變株:挑選離子注入后的單菌落進行編號，并接種到對應(yīng)編號的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；將所得的發(fā)酵液除去菌體后高溫滅菌，加入1.5%瓊脂和0.01-0.05%抑制劑，滅菌后倒平板，并涂布指示菌，置于35-40 °C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；選取指示菌生長的平板所對應(yīng)的編號的突變菌株進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過穩(wěn)定性試驗，最終得到菌株；
本發(fā)明進一步提供一種制備L-丙氨酸的方法:利用上述的菌種來制備，
具體步驟包括:
1、擴增培養(yǎng)種子液:保藏號為=CCTCC M 2013361的高產(chǎn)菌株Zife.0108菌株來生產(chǎn)發(fā)酵通過斜面培養(yǎng)和種子罐擴培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37°C，斜面培養(yǎng)時間24h，種子罐培養(yǎng)時間18h ；
2、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸:將擴增后的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，底物葡萄糖濃度為6-12%，發(fā)酵溫度為35-40°C，培養(yǎng)基pH值為6.5-7.5，維持厭氧環(huán)境，待殘?zhí)菨舛刃∮?br> 0.1%則發(fā)酵完成，發(fā)酵時間30-52h ；
3、發(fā)酵液凈化處理:先采用陶瓷超濾膜或有機管式超濾膜過濾，然后通過納濾膜進一步過濾；
4、制得成品:納濾液經(jīng)過真空濃縮蒸發(fā)去水分，結(jié)晶析出L-丙氨酸，經(jīng)離心分離，干燥得成品。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:以德氏乳桿菌保加利亞亞種delbrueckiisubsp.bulgaricus)為出發(fā)菌株，采用低能離子注入法誘變處理細胞，并通過可逆抑制測定法篩選出生產(chǎn)L-丙氨酸的突變株，用該突變株以葡萄糖等糖類物質(zhì)為底物，在35-40°C，pH 6.5-7.5厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸。選擇乳酸產(chǎn)生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種{Lactobacillus delbrueckii subsp./wJgariciAs)作為出發(fā)菌株,因為該菌種在厭氧條件下具有較高的糖酵解能力，在實際應(yīng)用過程中會節(jié)約大量的動力成本，而且該菌種作為食品級菌種，其發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸與丙氨酸是結(jié)構(gòu)類似物，會大大提高正突變的效率；所用的原材料葡萄糖屬于可再生純天然資源，來源廣泛，價格低廉，且厭氧發(fā)酵減少了動力消耗，降低了生產(chǎn)成本；提純過程中使用超濾膜過濾和納濾膜過濾去除雜質(zhì)，保證了產(chǎn)品質(zhì)量，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；采用的低能離子注入誘變法具有突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩(wěn)定等優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0010]本發(fā)明的菌株是通過低能離子誘變法誘變出發(fā)菌株德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)得到的,該菌株已于2013年8月 5 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為:湖北省武漢市洪山區(qū)八一路，保藏號為=CCTCCM 2013361。Lds.0108菌株的生長溫度范圍為35-40°C，最佳生長溫度為37°C ;最適pH值為7.0 ;使用的斜面培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。
[0011]實施例1:
L-丙氨酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株的誘變。
[0012]1、培養(yǎng)基組分:
1.1斜面培養(yǎng)基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈣2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，檸檬酸二胺0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，七水硫酸錳0.005%,瓊脂2%，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min。
[0013]1.2發(fā)酵培養(yǎng)基的成分:葡萄糖6%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀1.2%，無水硫酸鎂0.02%，氨水調(diào)pH至7.0，115°C蒸汽滅菌20min。
[0014]在發(fā)酵培養(yǎng)基配制過程中，無任何含丙氨酸的有機物摻入，為避免對下步篩選L-丙氨酸產(chǎn)生菌造成干擾。
[0015]2、操作步驟:
將出發(fā)菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養(yǎng)基上42°C培養(yǎng)18h左右，至對數(shù)生長期，用0.85%的生理鹽水制成菌懸液，ImL菌懸液含菌數(shù)約為107，鏡檢菌種健壯且無雜菌。吸取0.1mL菌懸液均勻涂布于直徑為9cm的無菌空白培養(yǎng)皿上，無菌風吹干制成菌膜，鏡檢無細胞重疊后，在真空條件下進行離子注入處理。
[0016]離子注入機由中國科學(xué)院等離子體物理研究所提供。注入的離子為N離子，離子能量15keV，注入劑量1.5 X 1O14 ions/cm2，注入時間5s，間隔時間15s。
[0017]將經(jīng)過離子注入處理后的菌膜用1mL無菌生理鹽水進行洗脫，然后取0.1mL洗脫液涂布于固體平板上(成分同斜面培養(yǎng)基)，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
[0018]將長出的單菌落進行編號，用接種環(huán)將各個單菌落分別挑入到對應(yīng)編號的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 1:厭氧發(fā)酵48h。發(fā)酵過程中pH值下降，流加濃度25%的氨水，維持發(fā)酵液pH值在6.5至7.5。將發(fā)酵液過濾除去菌體，其濾液經(jīng)121°C蒸汽滅菌20min。
[0019]在滅菌后不含菌體的發(fā)酵液中添加1.5%的瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min后將
0.01%的抑制劑L-氨基乙基磺酸過濾除菌后加入其中，倒平板。將作為指示菌的普通變形桿菌涂布于該平板上，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
[0020]若指示菌在含有抑制劑的平板上生長，說明發(fā)酵液中含有L-丙氨酸，則對應(yīng)編號的菌株即為產(chǎn)L-丙氨酸的突變株,挑取該編號的菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h后暫存于4°C冰箱。
[0021]實施例2:
產(chǎn)L-丙氨酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株的誘變。[0022]1、培養(yǎng)基組分:斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的成分同實施例1。
[0023]2、操作步驟:按實施例1的方法將出發(fā)菌株制成菌膜，鏡檢無細胞重疊后，在真空條件下進行離子注入處理，注入離子為N離子，離子能量20keV，注入劑量6.0 X IO15 ions/cm2,注入時間5s,間隔時間30s。
[0024]將經(jīng)過離子注入處理后的菌膜用I mL無菌生理鹽水進行洗脫，然后取0.1mL洗脫液涂布于斜面培養(yǎng)基上，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0025]將長出的單菌落進行編號，用接種環(huán)將各個單菌落分別挑入到對應(yīng)編號的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 1:厭氧發(fā)酵48h。發(fā)酵過程中pH值下降，流加濃度25%的氨水，維持發(fā)酵液pH值在6.5至7.5。將發(fā)酵液過濾除去菌體，其濾液經(jīng)121°C蒸汽滅菌20min。
[0026]在滅菌后不含菌體的發(fā)酵液中添加1.5%的瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min后將0.03%的抑制劑L-氨基乙基磺酸過濾除菌后加入其中，倒平板。將作為指示菌的普通變形桿菌涂布于該平板上，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
若指示菌在含有抑制劑的平板上生長，說明發(fā)酵液中含有L-丙氨酸，則對應(yīng)編號的菌株即為產(chǎn)L-丙氨酸的突變株,挑取該編號的菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h后暫存于4°C冰箱。
[0027]實施例3:
產(chǎn)L-丙氨酸的德氏乳桿菌保加利亞亞種突變株的誘變。
[0028]1、培養(yǎng)基組分:斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的成分同實施例1。
[0029]2、操作步驟:按實施例1的方法將出發(fā)菌株制成菌膜，鏡檢無細胞重疊后，在真空條件下進行離子注入處理，注入離子為N離子，離子能量20keV，注入劑量5.0 X IO16 ions/cm2,注入時間5s,間隔時間40s。
[0030]將經(jīng)過離子注入處理后的菌膜用0.5 mL無菌生理鹽水進行洗脫，然后取0.1mL洗脫液涂布于斜面培養(yǎng)基上，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。
[0031]將長出的單菌落進行編號，用接種環(huán)將各個單菌落分別挑入到對應(yīng)編號的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 1:厭氧發(fā)酵48h。發(fā)酵過程中pH值下降，流加濃度25%的氨水，維持發(fā)酵液pH值在6.5至7.5。將發(fā)酵液過濾除去菌體，其濾液經(jīng)121°C蒸汽滅菌20min。
[0032]在滅菌后不含菌體的發(fā)酵液中添加1.5%的瓊脂，115°C蒸汽滅菌20min后將0.05%的抑制劑L-氨基乙基磺酸過濾除菌后加入其中，倒平板。將作為指示菌的普通變形桿菌涂布于該平板上，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。
[0033]若指示菌在含有抑制劑的平板上生長，說明發(fā)酵液中含有L-丙氨酸，則對應(yīng)編號的菌株即為產(chǎn)L-丙氨酸的突變株,挑取該編號的菌株在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)18h后暫存于4°C冰箱。
[0034]重復(fù)實施例1-3，將得到的突變株進行連續(xù)傳代培養(yǎng)、發(fā)酵試驗，最終獲得I株產(chǎn)L-丙氨酸濃度較高、遺傳穩(wěn)定性較好的的突變株，編號為Ζ?.0108，其保藏號為:CCTCC M2013361。
[0035]實施例4:
利用突變株0108在100L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸。
[0036]1、培養(yǎng)基組分:
1.1斜面培養(yǎng)基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈣2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，檸檬酸二胺0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，七水硫酸錳0.005%,瓊脂2%，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min。
[0037] 1.2種子培養(yǎng)基的成分:蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，甘油0.5%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀1.2%，無水硫酸鎂0.02%,氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min。
[0038]1.3發(fā)酵培養(yǎng)基的成分:葡萄糖6%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀1.2%，無水硫酸鎂0.02%,氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，115 °C蒸汽滅菌20min。
[0039]2、操作步驟:將突變株Zife.0108移種到斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)24h。將斜面上的菌株用無菌水制成菌懸液。
[0040]按0.5%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，1000mL三角燒瓶裝液量300mL，培養(yǎng)溫度37°C，在轉(zhuǎn)速120rpm的搖床上培養(yǎng)18h。
[0041]將培養(yǎng)好的種子液按0.5%的接種量接入100L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度培35°C，轉(zhuǎn)速200rpm,罐壓0.05Mpa,發(fā)酵過程中pH值下降，流加濃度25%的氨水，維持發(fā)酵液pH值在6.5至7.5。整個發(fā)酵過程不需要通入空氣，維持厭氧狀態(tài)。
[0042]發(fā)酵30h，發(fā)酵液PH值不再降低，氨水消耗速度為零，測殘?zhí)菨舛刃∮?.05%,停止發(fā)酵，高效液相檢測發(fā)酵液中L-丙氨酸濃度為5.63%。
[0043]上述發(fā)酵液通過孔徑20納米管式有機膜膜超濾，除去菌體細胞等大分子物質(zhì)，用20L純水透析洗滌過濾母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超濾清液中。
上述超濾清液通過600分子量納濾膜過濾，脫去色素，進一步除去較大分子量雜質(zhì)、磷酸鹽、二價金屬離子等。鈉濾母液充分透析洗滌，得納濾液總共約185L。
[0044]利用真空旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀器對上述納濾液蒸餾濃縮結(jié)晶，濃縮液冷卻到20°C以下充分結(jié)晶，抽濾得母液20L，干燥晶體，得L-丙氨酸3980.6g，經(jīng)檢驗產(chǎn)品含量達到99.2%，比旋光度14.7，質(zhì)量符合GB 25543-2010。
[0045]實施例5:
利用突變株0108在10立方米發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸。
[0046]1、培養(yǎng)基組分:
1.1斜面培養(yǎng)基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈣2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，檸檬酸二胺0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，七水硫酸錳0.005%,瓊脂2%，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min。
[0047]1.2種子培養(yǎng)基的成分:蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，甘油0.5%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀1.2%，無水硫酸鎂0.02%,氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min。
[0048]1.3發(fā)酵培養(yǎng)基的成分:葡萄糖9%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀1.2%，無水硫酸鎂0.02%，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，115 °C蒸汽滅菌20min。
[0049]2、操作步驟:將突變株Zife.0108分別移種到斜面培養(yǎng)基上，在37 °C下培養(yǎng)24h。將斜面上的菌株用無菌水制成菌懸液。
[0050]按0.5%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，1000mL三角燒瓶裝液量300mL，37°C，在轉(zhuǎn)速120rpm的搖床上培養(yǎng)18h。
[0051]將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按0.5%的接種量接入500L種子罐中，培養(yǎng)37°C，轉(zhuǎn)速200rpm，罐壓 0.05Mpa，厭氧培養(yǎng) 18h。
[0052]上述種子罐種子液，移種至有效容積為10立方米的發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度37°C，轉(zhuǎn)速IOOrpm,罐壓0.05Mpa發(fā)酵過程pH值下降，流加液氨，維持發(fā)酵液pH值在6.5至7.5。整個發(fā)酵過程不需要通入空氣，維持厭氧狀態(tài)。
[0053]發(fā)酵40h，發(fā)酵液PH值不再降低，液氨消耗速度為零，測殘?zhí)菨舛刃∮?.04%,停止發(fā)酵，高效液相檢測發(fā)酵液中L-丙氨酸濃度為7.52%。
[0054]上述發(fā)酵液通過孔徑50納米陶瓷膜超濾，除去菌體細胞等大分子物質(zhì)，純水透析洗滌過濾母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超濾清液中。
上述超濾清液通過800分子量納濾膜過濾，脫去色素，進一步除去較大分子量雜質(zhì)、磷酸鹽、二價金屬離子等。鈉濾母液充分透析洗滌，得納濾液總共約14.5立方。
[0055]利用單效真空蒸發(fā)器對上述納濾液蒸餾濃縮結(jié)晶，濃縮液冷卻到20°C以下充分結(jié)晶，抽濾離心母液3.2立方米。干燥晶體，得L-丙氨酸506kg，經(jīng)檢驗產(chǎn)品含量達到99.5%，比旋光度14.5，質(zhì)量符合GB 25543-2010。
[0056]實施例6:利用突變株Ζ?.0108在100立方米發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸。
[0057]1、培養(yǎng)基組分:
1.1斜面培養(yǎng)基的成分:蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，七水硫酸鎂0.02%,碳酸鈣2%，牛肉膏1%，葡萄糖1%，檸檬酸二胺0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，七水硫酸錳0.005%,瓊脂2%，氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min。
[0058]1.2種子培養(yǎng)基的成分:蛋白胨0.8%，酵母膏0.5%，甘油0.5%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀1.2%，無水硫酸鎂0.02%,氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，121°C蒸汽滅菌20min。
[0059]1.3發(fā)酵培養(yǎng)基的成分:葡萄糖12%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀1.2%，無水硫酸鎂0.02%,氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，115 °C蒸汽滅菌20min。
[0060]2、操作步驟:將突變株Zife.0108分別移種到斜面培養(yǎng)基上，在37 °C下培養(yǎng)24h。將斜面上的菌株用無菌水制成菌懸液。
[0061]按0.5%的接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，1000mL三角燒瓶裝液量300mL，37°C，在轉(zhuǎn)速120rpm的搖床上培養(yǎng)18h。
[0062]將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按0.5%的接種量接入500L種子罐中，培養(yǎng)37°C，轉(zhuǎn)速200rpm，罐壓 0.05Mpa，厭氧培養(yǎng) 18h。
[0063]將培養(yǎng)好的種子液移種至種至5000L種子罐中繼續(xù)擴增培養(yǎng)，培養(yǎng)37°C，轉(zhuǎn)速IOOrpm,罐壓 0.05Mpa,厭氧培養(yǎng) 18h。
[0064]上述擴增培養(yǎng)的種子液，移種至有效容積為100立方米的發(fā)酵罐，發(fā)酵溫度40°C，轉(zhuǎn)速56rpm,罐壓0.05Mpa,發(fā)酵過程pH值下降,流加液氨,維持發(fā)酵液pH值在6.5至7.5。整個發(fā)酵過程不需要通入空氣，維持厭氧狀態(tài)。
[0065]發(fā)酵52h，發(fā)酵液PH值不再降低，液氨消耗速度為零，測殘?zhí)菨舛刃∮?.05%，停止發(fā)酵，高效液相檢測發(fā)酵液中L-丙氨酸濃度為10.68%。
[0066]上述發(fā)酵液通過孔徑50納米陶瓷膜超濾，除去菌體細胞等大分子物質(zhì)，純水透析洗滌過濾母液，使其中的L-丙氨酸成分充分收集到超濾清液中。
上述超濾清液通過1000分子量納濾膜過濾，脫去色素，進一步除去較大分子量雜質(zhì)、磷酸鹽、二價金屬離子等。納濾母液充分透析洗滌，得納濾液總共約124.5立方。
[0067]利用三效真空蒸發(fā)器對上述納濾液蒸餾濃縮結(jié)晶，濃縮液冷卻到20°C以下充分結(jié)晶，抽濾離心母液12.2立方米。干燥晶體，得L-丙氨酸7476kg，經(jīng)檢驗產(chǎn)品含量達到99.5%,比旋光度14.5，質(zhì) 量符合GB 25543-2010。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株Ζ?.0108菌株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為:CCTCC NO: M 2013361。
2.一種如權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)菌株制備方法，其特征在于，所述的方法包括:以乳酸產(chǎn)生菌德氏乳桿菌保加利亞亞種delbrueckii subsp.bulgaricus)為貨發(fā)菌株，活化出發(fā)菌一低能離子注入法誘變處理細胞一可逆抑制測定法篩選生產(chǎn)L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)菌株對制備方法，其特征在于，所述的活化出發(fā)菌，包括:將出發(fā)菌德氏乳桿菌保加利亞亞種在斜面培養(yǎng)基上42°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.85 %的生理鹽水制成菌懸液，ImL菌懸液含菌數(shù)約為107，鏡檢菌種健壯且無雜菌后，吸取0.1mL菌懸液均勻涂布于無菌空白培養(yǎng)皿上，無菌風吹干制成菌膜，鏡檢無細胞重疊后，進行下一步。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)菌株對制備方法，其特征在于，所述的低能離子注入誘變法誘變處理細胞:真空條件下注入的離子為N離子，劑量為1.5X1014-5X1016 ions/cm2,能量為15-20keV，脈沖注入，每次注入5s，間隔時間15_40s，注入后用0.5_lmL無菌生理鹽水洗下菌體細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)菌株對制備方法，其特征在于，所述的可逆抑制測定法篩選生產(chǎn)L-丙氨酸的突變株:挑選離子注入后的單菌落進行編號，并接種到對應(yīng)編號的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；將所得的發(fā)酵液除去菌體后高溫滅菌，加入1.5%瓊脂和0.01-0.05%抑制劑，滅菌后倒平板，并涂布指示菌，置于35-40 °C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；選取指示菌生長的平板所對應(yīng)的編號的突變菌株進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過穩(wěn)定性試驗，最終得到I株編號為Lds.0108的L-丙氨酸高產(chǎn)菌株。
6.一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的保藏號為:CCTCC NO: M 2013361的德氏乳桿菌突變株Lds.0108來生產(chǎn)發(fā)酵。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸的制備方法，具體步驟包括: (1)、擴增培養(yǎng)種子液:保藏號為:CCTCCNO: M 2013361的德氏乳桿菌突變菌株Lds.0108來生產(chǎn)發(fā)酵通過斜面培養(yǎng)和種子罐擴培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，斜面培養(yǎng)時間24h，種子罐培養(yǎng)時間18h ； (2)、厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸:將擴增后的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，底物葡萄糖濃度為6-12%，發(fā)酵溫度為35-40°C，培養(yǎng)基pH值為6.5-7.5，維持厭氧環(huán)境，待殘?zhí)菨舛刃∮凇?.1%則發(fā)酵完成，發(fā)酵時間30-52h ； (3)、發(fā)酵液凈化處理:先采用陶瓷超濾膜或有機管式超濾膜過濾，然后通過納濾膜進一步過濾； (4)、制得成品:納濾液經(jīng)過真空濃縮蒸發(fā)去水分，結(jié)晶析出L-丙氨酸，經(jīng)離心分離，干燥得成品。
【文檔編號】C12N15/01GK103602609SQ201310399567
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】黃建坡, 苗位云, 孟凡會, 劉煥書, 朱傳厚, 韓秀麗, 郭志遠, 徐龍 申請人:淮北新旗氨基酸有限公司