一組人類心肌細胞的新型分子標記物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組人類心肌細胞的新型分子標記物及其應用。該組標記物由如下29種基因組成：POPDC2、ALPK2、TRIM55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX、NRK、ABLIM1、SYNPO2L、ANKRD1、TNNI1、MYH6、ABRA、TPM1、C15orf52、MYOM1、MASP1、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2。本發(fā)明的標記物在心肌細胞的篩選和鑒定上具有重要作用，并且在人類心臟早期發(fā)育研究、心臟疾病模型構建、心臟疾病的治療以及心臟疾病藥物靶點的開發(fā)或藥物研發(fā)中都具有潛在的作用與極大的意義。
【專利說明】—組人類心肌細胞的新型分子標記物及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一組人類心肌細胞的新型分子標記物及其應用。
【背景技術】
[0002]心臟病是威脅人類健康的殺手，毎年都有上千萬人因罹患各類心臟疾病失去生命，給家庭和公共衛(wèi)生事業(yè)帶來了極大的壓カ和負擔。無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，心臟病的發(fā)病率和病死率都居高不下，然而面對如此嚴峻的考驗，目前心臟疾病的治療卻不容樂觀，藥物治療停留在緩解癥狀的階段，手術治療如搭橋手術等開支較大且存在一定的風險和可能的副作用，介入治療也仍處于探索階段，鮮有標本兼治的治療方法問世。究其原因，很大一方面是人類對心臟以及心臟疾病認識的不足。心臟疾病的病因追根溯源是心肌細胞的缺失或功能的紊亂。因而未來根治心臟疾病的ー個思路便是研究心臟病的分子致病機理，尋找影響心臟纖維化或者心肌細胞增殖的決定性因子，實現(xiàn)對紊亂的心肌細胞進行人為調控使其恢復正常功能的目的(I)。
[0003]近年來，隨著誘導型多能干細胞(inducedPluripotency Stem Cells, iPSCs)技術的產(chǎn)生，人們能夠在體外獲得iPSCs并分化為病人特異的心肌細胞，通過基因矯正或其他手段得到“健康”的病人來源的心肌細胞(I);利用轉分化(transdifferentiation)技術可以不經(jīng)過iPSCs過程由其他便于獲得的細胞類型直接獲得心肌細胞(2)，這些技術的發(fā)展為將來實現(xiàn)在病人體內(nèi)的細胞移植治療提供了可能。
[0004]1.Mordwinkin NMj Burridge PWj Wu JC.2013.A review of humanpluripotent stem celI`—derived cardiomyocytes for high-throughput drugdiscovery, cardiotoxicity screening,and publication standards.Journal ofcardiovascular translational research6:22-30.[0005]2.Wada R, Muraoka N, Inagawa K, Yamakawa H, Miyamoto K, Sadahiro T, UmeiT，Kaneda R, Suzuki T, Kamiya K, Tohyama S，Yuasa S，Kokaji K，Aeba R，Yozu R，YamagishiH，Kitamura T，F(xiàn)ukuda K，Ieda M.2013.1nduction of human cardiomyocyte-like cellsfrom fibroblasts by defined factors.Proceedings of the National Academy ofSciencesllO:12667-12672.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一組人類心肌細胞的新型分子標記物及其應用。
[0007]本發(fā)明提供的一組用于鑒定或輔助鑒定人類心肌細胞的標記物，由如下29種基因組成:P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPl、HSPB7、NPPA、KBTBD10、MYL4、CRYAB, LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX, NRK、ABLIMU SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MY0M1、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0008]所述29種基因滿足如下條件:與人類胚胎多能干細胞和/或人類神經(jīng)干細胞相比，在人類心肌細胞中該29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低、且在人類心肌細胞中該29種基因的mRNA表達量均顯著提高。
[0009]上述標記物中，所述該29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低是指在人類心肌細胞中每種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化的量均比人類胚胎多能干細胞和/或人類神經(jīng)干細胞中相同基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化的量降低5%以上。
[0010]所述該29種基因的mRNA表達量均顯著提高是指在人類心肌細胞中每種基因的mRNA表達量均是人類胚胎多能干細胞和/或人類神經(jīng)干細胞中相同基因mRNA表達量的2倍以上。
[0011]上述任一所述標記物在鑒定人心肌細胞中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012]上述應用中，所述應用為非疾病治療或診斷方法。
[0013]上述任一所述標記物在制備、開發(fā)或設計鑒定人心肌細胞的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014]上述任一所述標記物在從人心肌細胞、人胚胎多能干細胞和人神經(jīng)干細胞中鑒定出人心肌細胞中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0015]上述任一所述標記物在從人心肌細胞和人胚胎多能干細胞中鑒定出人心肌細胞中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0016]上述任一所述標記物在制備、開發(fā)或設計具有如下功能的產(chǎn)品中的應用也屬 于本發(fā)明的保護范圍:從人心肌細胞、人胚胎多能干細胞和人神經(jīng)干細胞中鑒定出人心肌細胞。
[0017]上述任一所述標記物在制備、開發(fā)或設計具有如下功能的產(chǎn)品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:從人心肌細胞和人胚胎多能干細胞中鑒定出人心肌細胞。
[0018]上述任一所述的應用中，所述人心肌細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的；所述人神經(jīng)干細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的。
[0019]檢測29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的物質和檢測29種基因的mRNA表達量的物質在制備鑒定人類心肌細胞的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0020]所述29 種基因為 P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPU HSPB7、NPPA, KBTBD10,MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0021]檢測29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的物質和檢測29種基因的mRNA表達量的物質在制備具有如下功能的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:從人心肌細胞、人胚胎多能干細胞和人神經(jīng)干細胞中鑒定出人心肌細胞。
[0022]所述29 種基因為 P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPU HSPB7、NPPA, KBTBD10,MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0023]檢測29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的物質和檢測29種基因的mRNA表達量的物質在制備具有如下功能的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍:從人心肌細胞和人胚胎多能干細胞中鑒定出人心肌細胞。
[0024]所述29 種基因為 P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPU HSPB7、NPPA, KBTBD10,MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC, F2RL2。
[0025]上述任一所述應用中，所述人心肌細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的；所述人神經(jīng)干細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的。
[0026]上述任一所述應用中，所述由人胚胎多能干細胞分化而來的人心肌細胞中和所述由人胚胎多能干細胞分化而來的人神經(jīng)干細胞中，所述人胚胎多能干細胞為同一株系的人胚胎多能干細胞。
[0027]由于H9-ESC，H9-NSC及H9-CM具有完全相同的基因型與遺傳背景，將H9-ESC或H9-NSC作為對照，進行轉錄組及全基因組DNA甲基化分析具有嚴格的無偏見性。通過大規(guī)模比較H9-ESC，H9-NSC及H9-CM的基因表達譜和全基因組DNA甲基化譜，篩選出29種新型分子標記物。本發(fā)明涉及的新型分子標記物在心肌細胞的篩選和鑒定上具有重要作用，并且在心臟疾病模型構建、心臟疾病的治療以及心臟疾病藥物靶點開發(fā)或藥物研發(fā)中都具有潛在的作用與極大的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為人類心肌細胞的鑒定。
[0029]圖2為人類胚胎多能干細胞、人類神經(jīng)干細胞和人類心肌細胞基因表達熱圖以及qPCR驗證。
[0030]圖3為人類胚胎多能干細胞、人類神經(jīng)干細胞和人類心肌細胞中全基因組啟動子區(qū)CpG島甲基化水平熱圖。
[0031]圖4為編碼心肌結構蛋白與心臟轉錄因子的基因的DNA去甲基化與基因表達水平正相關性分析。
[0032]圖5為雙核心穩(wěn)定調控網(wǎng)絡。
[0033]圖6為功能相關性 網(wǎng)絡分析。
[0034]圖7為基因-疾病網(wǎng)絡分析。
【具體實施方式】
[0035]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037]人類胚胎多能干細胞系H9購自美國WiCell Research Institute,貨號為WA09(H9)-DL-7 ；
[0038]絲裂霉素購自美國Sigma公司，貨號為M0503 ；
[0039]小鼠胚胎成纖維細胞購自美國Millipore公司，貨號為PMEF-CFL ；
[0040]細胞外基質(qualified-Matrigel)購自美國BD Biosciences,貨號為 354277 ；
[0041]DMEM/F12 培養(yǎng)基購自 Invitrogen 公司，貨號為 11320-033 ；
[0042]⑶F12培養(yǎng)基配方如下:
[0043]DMEM/F12(購自 Invitrogen，貨號為 11320-033)、0.1mM 非必需氨基酸(購自 Invitrogen,貨號為 11140-050) >ImM GlutaMAXTM ニ妝(購自 Invitrogen,貨號為35050-061)、20%Knockout 血清替代物(購自 Invitrogen，貨號為 N10828-028)、1% 青霉素/鏈霉素(購自Invitrogen,貨號為15070-063)、55 y M 0 -巰基こ酉享(購自Invitrogen,貨號為 21985-023)和 10ng/ml Human FGF2 (購自 Joint Protein Central)；
[0044]RPMI1640 培養(yǎng)基購自 Invitrogen 公司，貨號為 11875119 ；[0045]B27添加劑購自Invitrogen公司，貨號為0080085SA ；
[0046]B27 (不含 Insulin)添加劑購自 Invitrogen 公司，貨號為 0050129SA ；
[0047]mTeSR 培養(yǎng)基購自美國 StemCell Technologies ；
[0048]ROCK 抑制劑 Y-27632 購自 Sigma-Aldrich，貨號為 Y0503 ；
[0049]CHIR99021 購自 Selleck ；
[0050]Wnt 抑制劑 IWP4 購自 Stemgent ；
[0051]Triton X-100 購自 Sigma，貨號 T-8787 ；
[0052]鼠抗cTnT 購自 Lab Vision ；
[0053]鼠抗 MF2O 購自 Developmental Studies Hybridoma Bank ；
[0054]兔抗MLC2v 購自 ProteinTech Group ；
[0055]鼠抗 a-Actinin 購自 Sigma-Aldrich ;
[0056]ニ抗 Alex Fluor488goat ant1-mouse IgG 購自 Life Technologies ；
[0057]ニ抗 Alex Fluor568goat ant1-rabbit IgG 購自 Life Technologies ；
[0058]人類胚胎多能干細胞系H9來源的神經(jīng)干細胞(hNSCs)及分化方案在文獻“LiuGH, Qu J, Suzuki K，Nivet E, Li M, Montserrat N，Yi F，Xu X，Ruiz S，Zhang W, WagnerU, Kim A, Ren B, Li Y,Goebl` A, Kim J, Soligalla RD, Dubova I, Thompson J,YatesJ, 3rd, Esteban CR, Sancho-Martinez I, Izpisua Belmonte JC.2012.Progressivedegeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2.Nature491:603-607.”中公開過，公眾可從中國科學院生物物理研究所獲得人類胚胎多能干細胞來源的神經(jīng)干細胞(hNSCs)；
[0059]RNeasy Mini Kit 購自 QIAGEN ；
[0060]AffymetrixGeneCnipPrimeView Human Gene Expression Arrays 購自Affymetrix,貨號為 901837。
[0061]實施例1、人類胚胎多能干細胞的培養(yǎng)
[0062]將人類胚胎多能干細胞系H9利用如下方法進行培養(yǎng):
[0063]一、將H9細胞接種至預先培養(yǎng)了經(jīng)過絲裂霉素滅活的小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)板中，使用人類多能干細胞培養(yǎng)基(CDF12培養(yǎng)基)與小鼠胚胎成纖維細胞共同培養(yǎng)。
[0064]ニ、用DMEM/F12培養(yǎng)基將細胞外基質稀釋至體積分數(shù)為1%的濃度，并用稀釋后的細胞外基質包被培養(yǎng)板。
[0065]三、將步驟一培養(yǎng)的H9細胞接種至預先用體積分數(shù)為1%的細胞外基質包被的培養(yǎng)板中，使用mTeSR培養(yǎng)基培養(yǎng)。
[0066]實施例2、人類胚胎多能干細胞向人類心肌細胞分化
[0067]人類胚胎多能干細胞系H9向人類心肌細胞分化方案基于Palecek方案(Lian X,Hsiao C, WiIson G,Zhu K，Hazeltine LB, Azarin SM, Raval KK, ZhangJ，Kamp TJ,PaleceK SP.2012.Robust cardiomyocyte differentiation from humanpluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerical09:E1848-1857.)進行改進，改進后的方案進ー步提高了人類心肌細胞的純度，該方案的具體步驟如下:[0068]一、用DMEM/F12培養(yǎng)基將細胞外基質稀釋至體積分數(shù)為1%的濃度，用稀釋后的細胞外基質包被培養(yǎng)板。
[0069]ニ、將人類胚胎多能干細胞系H9消化為單細胞懸液，以IO5個細胞/cm2的密度接種到經(jīng)體積分數(shù)為1%的細胞外基質包被的培養(yǎng)板中，添加含有10 ii M ROCK抑制劑Y-27632的mTeSR培養(yǎng)基。37°C、5% ニ氧化碳條件下培養(yǎng)24小時，然后改用mTeSR培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0070]三、起始心肌細胞的分化。
[0071](一)在第I天換用含有12ii M CHIR99021的RPMI/B27_insulin培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，24小時后更換為RPMI/B27-1nsulin培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0072](ニ)第3天換用含有5 ii M Wnt抑制劑IWP4的RPMI/B27_insulin培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，期間不換液。
[0073](三)從第5天起每隔2-3天更換RPMI/B27培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0074](四)第15天，將肉眼可見的可自主收縮的人類心肌細胞薄片或團塊通過機器分選或人工挑取進行收集。
[0075](五)將收集的細胞重新接種到經(jīng)體積分數(shù)為1%的細胞外基質包被的培養(yǎng)板中，用RPMI/B27培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0076]實施例3、人類心肌細胞的鑒定
[0077]人類胚胎多能干細胞來源的人類心肌細胞不僅在形態(tài)上表現(xiàn)出心肌細胞特有的收縮功能，并且可以進ー步通過免疫熒光及流式細胞術對心肌細胞特異性的生物學標記進行鑒定。
[0078]一、免疫熒光鑒定
[0079](一)將實施例2得到的人類心肌細胞分為四組，各組分別經(jīng)4%多聚甲醛固定，
0.3%Triton X-100/PBS通透。然后四組分別與四種ー抗(鼠抗cTnT,鼠抗MF20，兔抗MLC2v,鼠抗a-Actinin) 4°C孵育過夜。將ー抗清洗后于室溫進行ニ抗孵育I小時，其中第一組使用的ニ抗為Alex Fluor488goat ant1-mouse IgG,第二組使用的ニ抗為AlexFluor488goat ant1-mouse IgG,第三組同時使用ニ抗Alex Fluor488goat ant1-mouse IgG和ニ抗 Alex Fluor568goat ant1-rabbit IgG 進行孵育。
[0080](ニ)細胞核用DAPI進行負染。激光共聚焦顯微鏡采集圖像進行分析。
[0081]cTnT 為心肌肌I丐蛋白 T (cardiac troponin T)；
[0082]MF20為肌球蛋白重鏈；
[0083]MLC2V 為肌球蛋白輕鏈 2V(myosin light chain2V)；
[0084]a-Actinin 為肌動蛋白。
[0085]結果如圖1A所示。
[0086]圖1A中，I (a-c)表示cTnT在不同放大倍率下的染色結果，2 (a_c)表示MF20在不同放大倍率下的染色結果，3a表示a -Actinin的染色結果，3b表示MCL2v的染色結果，3c為3a和3b重疊的結果。
[0087]結果表明，人類胚胎多能干細胞來源的人類心肌細胞能夠表達心肌特異的標記物心肌肌I丐蛋白T (cardiac troponin T)和肌球蛋白，通過對肌球蛋白和肌動蛋白的免疫突光染色可觀察到心肌纖維結構。[0088]ニ、流式細胞術鑒定
[0089]結果如圖1B所示。
[0090]圖1B表明，分化得到的人類心肌細胞群中大約96%是cTnT陽性細胞，大約91%是MF20陽性的細胞。
[0091]實施例4、轉錄組分析
[0092]一、設置三組樣品:人類胚胎多能干細胞(hESCs)H9 (以下簡稱為H9-ESC)，人類胚胎多能干細胞系H9來源的神經(jīng)干細胞(hNSCs)(以下簡稱為H9-NSC)以及實施例3鑒定出的人類胚胎多能干細胞系H9來源的人類心肌細胞(hCMs)(以下簡稱為H9-CM)，每組細胞樣品共設三個平行。
[0093]ニ、使用Trizol法提取各組細胞各樣品的總RNA,并使用RNeasy Mini Kit進ー步純化。
[0094]三、將三組細胞的樣品用“AffymetrixGeneChipPrimeViewHuman GeneExpression Arrays”基因芯片處理。
[0095]四、表達差異比較
[0096]分析比較各組細胞中不同基因在H9-ESC、H9-NSC及H9-CM中的表達情況。由AffymetrixGeneChip Scanner30007G 米集基因芯片的表達信號。利用 R/Bioconductor 處理表達信號，根據(jù)RMA算法歸ー化后轉換為對應的基因表達值，并繪制H9-ESC、H9-NSC和H9-CM三種細胞各3份樣品的表達熱圖(heatmap)，結果如圖2A所示。
[0097]圖2A 中，`
[0098]hESC # UhESC # 2和hESC # 3分別為H9-ESC的三個平行樣品；
[0099]hNSC # UhNSC # 2和hNSC # 3分別為H9-NSC的三個平行樣品；
[0100]hCM # 1、hCM # 2和hCM # 3分別為H9-CM的三個平行樣品；
[0101]l/4x表示基因的表達水平下調到4倍；
[0102]l/2x表示基因的表達水平下調到2倍；
[0103]Ix表示基因的表達水平無顯著變化；
[0104]2x表示基因的表達水平上調到2倍；
[0105]4x表示基因的表達水平上調到4倍。
[0106]圖中是以人胚胎干細胞H9-ESC作為基因上調和下調的標準。
[0107]經(jīng)過分析，與基因在H9-ESC和H9-NSC中的表達量相比，共有695個基因在H9-CM中的表達量同時是H9-ESC和H9-NSC中的表達量的2倍以上，共有401個基因在H9-CM中的表達量均不足H9-ESC和H9-NSC中的表達量的一半。
[0108]五、實時熒光定量PCR驗證關鍵基因的表達結果，表I為各關鍵基因的引物。其中部分結果如圖2B所示，驗證結果與芯片分析得到的結果一致。
[0109]表I驗證引物
[0110]
【權利要求】
1.一組用于鑒定或輔助鑒定人類心肌細胞的標記物，由如下29種基因組成:P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIPl、HSPB7、NPPA, KBTBD10, MYL4、CRYAB, LRRN4、MYOZ2、OBSCN、SMPX, NRK、ABLIMU SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA, TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNS1、FLNC、F2RL2 ； 所述29種基因滿足如下條件:與人類胚胎多能干細胞和/或人類神經(jīng)干細胞相比，在人類心肌細胞中該29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低、且在人類心肌細胞中該29種基因的mRNA表達量均顯著提高。
2.根據(jù)權利要求1所述的標記物，其特征在于:所述該29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平均顯著降低是指在人類心肌細胞中每種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化的量均比人類胚胎多能干細胞和/或人類神經(jīng)干細胞中相同基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化的量降低5%以上； 所述該29種基因的mRNA表達量均顯著提高是指在人類心肌細胞中每種基因的mRNA表達量均是人類胚胎多能干細胞和/或人類神經(jīng)干細胞中相同基因mRNA表達量的2倍以上。
3.權利要求1或2所述標記物在鑒定人心肌細胞中的應用，所述應用為非疾病治療或診斷方法； 或，權利要求1或2所述標記物在制備、開發(fā)或設計鑒定人心肌細胞的產(chǎn)品中的應用。
4.權利要求1或2所述標記物在從人心肌細胞、人胚胎多能干細胞和人神經(jīng)干細胞中鑒定出人心肌細胞中的應用； 或，權利要求1或2所述標記物在從人心肌細胞和人胚胎多能干細胞中鑒定出人心肌細胞中的應用。
5.權利要求1或2所述標記物在制備、開發(fā)或設計具有如下功能的產(chǎn)品中的應用:從人心肌細胞、人胚胎多能干細胞和人神經(jīng)干細胞中鑒定出人心肌細胞； 或，權利要求1或2所述標記物在制備、開發(fā)或設計具有如下功能的產(chǎn)品中的應用:從人心肌細胞和人胚胎多能干細胞中鑒定出人心肌細胞。
6.根據(jù)權利要求3-5任一所述的應用，其特征在于:所述人心肌細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的；所述人神經(jīng)干細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的。
7.檢測29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的物質和檢測29種基因的mRNA表達量的物質在制備鑒定人類心肌細胞的試劑盒中的應用； 所述 29 種基因為 P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA, KBTBD10、MYL4、CRYAB,LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC、F2RL2。
8.檢測29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的物質和檢測29種基因的mRNA表達量的物質在制備具有如下功能的試劑盒中的應用:從人心肌細胞、人胚胎多能干細胞和人神經(jīng)干細胞中鑒定出人心肌細胞； 所述 29 種基因為 P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA, KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK、ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC、F2RL2。
9.檢測29種基因的啟動子區(qū)CpG島甲基化水平的物質和檢測29種基因的mRNA表達量的物質在制備具有如下功能的試劑盒中的應用:從人心肌細胞和人胚胎多能干細胞中鑒定出人心肌細胞； 所述 29 種基因為 P0PDC2、ALPK2、TR頂55、ASPH、FILIP1、HSPB7、NPPA, KBTBD10、MYL4、CRYAB、LRRN4、MY0Z2、OBSCN、SMPX,NRK,ABLIMl、SYNP02L、ANKRDl、TNNI1、MYH6、ABRA、TPMl、C15orf52、MYOMl、MASPl、MYBPC3、TNSl、FLNC、F2RL2。
10.根據(jù)權利要求7-9任一所述的應用，其特征 在于:所述人心肌細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的；所述人神經(jīng)干細胞是由所述人胚胎多能干細胞分化而來的。
【文檔編號】C12Q1/04GK103451284SQ201310370253
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權日:2013年8月22日
【發(fā)明者】劉光慧, 顧穎, 胡安·卡洛斯·伊斯畢華·貝爾蒙特, 曲靜, 楊濟平, 張維琦, 任若通 申請人:中國科學院生物物理研究所