水稻轉(zhuǎn)錄因子Os06g47150基因CDS序列的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子Os06g47150基因CDS序列的應用，其是利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR與水稻轉(zhuǎn)錄因子Os06g47150融合構建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如增加水稻籽粒寬度。對于詳細闡明調(diào)控種子發(fā)育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實踐中也具有重要意義。
【專利說明】水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因 CDS序列的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因⑶S序 列的應用。

【背景技術】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個重要的功能基因研究的模式植物。與其相關的遺傳學和分子 生物學研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達調(diào)控的重要方式。當前水 稻增產(chǎn)的研究較依賴于有限的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢正在逐漸減弱，而水稻 轉(zhuǎn)基因技術有可能發(fā)掘水稻進一步增產(chǎn)的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚 珠。從分子生物學的角度來說，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個有次序的、選擇性的基因表達過 程。而轉(zhuǎn)錄因子在基因表達的精確調(diào)控中起到了關鍵性的作用。
[0004] 生長素是植物體重要的生長調(diào)節(jié)分子，參與植物根和莖的生長和發(fā)育、器官的衰 老、維管束組織的形成和分化發(fā)育，維持頂端優(yōu)勢，胚胎中軸的建立，植物的向地和向光反 應以及刺激花器官生長等生長和發(fā)育諸多過程，在植物整個生命周期過程中發(fā)揮重要的作 用。ARF做為生長素的響應因子，是一類調(diào)控生長素響應基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，在生長素的 信號傳導過程中處于中心位置，它可與生長素響應元件特異結合，促進或抑制基因的表達。 植物ARF由3個結構域組成：氨基端的DNA結合結構域（DBD)，中間結構域（MR)以及羥基末 端的二聚結構域（CTD)。中間結構域包括激活結構域（AD)和抑制結構域（RD)。在生長素信 號轉(zhuǎn)導過程中，ARF主要通過與生長素響應元件結合，早期基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)下游基因的 表達。不同ARF在不同的組織和器官中都有特異表達。植物激素、外界環(huán)境因子和非編碼 區(qū)小RNA對ARF功能的發(fā)揮具有重要的調(diào)控作用。
[0005] 通過擬南芥ARF家族基因 AtARFl/AtARF2功能研究表明，AtARF2可調(diào)控葉片衰 老，開花時間及種子體積的大小等（Ellis CEet al. (2005) AUXIN RESPONSE FACTORland AUXIN RESPONSE FACT0R2regulate senescence and floral or-gan abscission in Arabidopsis thaliana. ) (Schruff MC. et al. (2006)The AUXINRESPONSE FACT0R2gene of Arabidopsis links auxin signalling,cell division, and the size of seeds and other organs. )，arflarf2雙突變體與arf2單突變體表型相似，表現(xiàn)為晚花、葉 片衰老延遲、黃化苗頂端玩夠結構紊亂及種子體積增大（Okushima Y.et al. (2005) Functional genomic analysis of the AUXIN RESPONSE FACTOR gene family members in Arabidopsis thaliana:unique and overlapping functions of ARF7and ARF19.)〇
[0006] OsARFl是水稻中第一個克隆的ARF，受生長素快速誘導，且不依賴于蛋白質(zhì)的重 新合成，因此，OsARFl是生長素的原初響應因子（Waller F.et al. (2002) OsARFl，an auxin response factor from rice, is auxin-regulated and classifies as a primary auxin responsive gene.)。定量RT-PCR揭示OsARFl在胚組織中的轉(zhuǎn)錄豐度遠高于營養(yǎng)組織。通 過構建反義OsARFl并轉(zhuǎn)入水稻，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的生長速率和生活力極度下降，表現(xiàn)為葉 片卷曲、分蘗芽不育等性狀，因此，OsARFl對于水稻的營養(yǎng)生長和種子發(fā)育是必需的（Attia K. et al. , (2009)Antisense phenotypes reveal a functional expression of OsARFl, an auxin response factor, in transgenic rice. )〇 ARF 家方矣另一個基因 OsARFl2,是生長素 應答基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，參與調(diào)解水稻根的伸長并影響鐵的積累。水分或營養(yǎng)元素的缺 乏導致植物生長變緩，生長素通過維持最佳的根系結構（RSA)來減輕脅迫的影響。生長素 應答因子0sARF12是RSA的一個限制因子。敲除0sARF12導致水稻主根的長度變短。作 為一個轉(zhuǎn)錄激活子，〇sARF12促進了生長素應答原件DR5: :GFP的表達，在煙草或水稻愈傷 中瞬時表達〇sa-niRNA167d可以抑制0sARF12。在osarfl2和osarfl2/25突變體的根伸 長區(qū)，生長素濃度降低，長度也較野生型顯著降低，這可能是由于生長素合成基因 OsYUCCAs 和生長素流出載體OsPINs和OsPGPs的表達降低引起的。因此對轉(zhuǎn)錄因子的研究，在理論 上為進一步理解植物種子和器官發(fā)育調(diào)控的分子機理提供了新的線索，在實踐上也將為作 物高產(chǎn)育種提供理論基礎。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因⑶S序列的應用。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，即融合蛋白 EAR-Linker-〇s06g47150 〇
[0009] 其中，EAR為來自植物轉(zhuǎn)錄因子的一段具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序 列和核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 4所示。
[0010] 上述融合蛋白中涉及的Linker由1?40個柔性氨基酸串聯(lián)而成(例如，GGGGG、 GPPPG或Gatway載體重組位點編碼的氨基酸序列DPAFLYKVVPR等)。
[0011] 作為優(yōu)選，Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所 示，編碼該Linker的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0012] 上述融合蛋白中涉及的0s06g47150為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150,其氨基酸序列 如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因的⑶S序列為：SEQ ID No. 1所示的核苷酸 序列。
[0013] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因，以及在嚴格條件下，可與該 基因的核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供含有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因的載體、工程菌及細胞 系。
[0015] 所述載體的構建方法如下：
[0016] (1)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s06g47150基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物對，其為正向 引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACTTTCGTGGATTC-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGG TCCTAAAACTGGACTGACCT-3,。
[0017] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用上述引物F和R進行PCR， 獲得0s06g47150基因完整的CDS序列。
[0018] (3)將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。
[0019] (4)以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架 序列，通過體外重組，將ubi promoter-EAR-Gateway表達單兀、35S promoter-asRED表達 單元和35S promoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nEAR-hyg-asRED的全序列如 SEQ ID No. 5 所示。
[0020] (5)通過LR反應將0s06g47150基因的CDS序列構建到其目的基因的5'端連有 EAR編碼基因的植物表達載體nEAR-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄 因子 EAR-Linker-0s06g47150 基因的表達載體 ubi :EAR-0s06g47150,其全序列如 SEQ ID No. 6所示。
[0021] 上述表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿 孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞中（Weissbach，1998, Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 頁；Geiserson 和 Corey，1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0022] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構建方法，具體為：采用農(nóng)桿菌介導的方法， 將上述表達載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化 后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0023] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因在改良水稻籽粒性狀(例如增 加水稻粒寬及千粒重）中的應用。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于擴增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因⑶S序列的引物對，包括 正向引物 F : 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACTTTCGTGGATTC-3' 和反向引物 R : 5' -CAAGAAAGC TGGGTCCTAAAACTGGACTGACCT-3,。
[0025] 本發(fā)明進一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因⑶S序列在調(diào)控水稻籽粒性狀 中的應用。利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR (SEQ ID No. 10)與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150融合 構建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中， 從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。
[0026] 前述的應用，是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因的⑶S序列構建到轉(zhuǎn)錄因子抑制 基序EAR編碼基因 （SEQ ID No. 4)的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。優(yōu) 選將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR 編碼基因的下游。
[0027] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150融合構建得 到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改 良水稻籽粒性狀，例如水稻籽粒寬度增加。對于詳細闡明調(diào)控種子發(fā)育機理具有重要的理 論價值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實施例1中nEAR-hyg-asRED載體圖譜。
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例1中ubi :EAR-0s06g47150載體圖譜。
[0030] 圖3為本發(fā)明實施例3中PCR檢測EAR-0s06g47150轉(zhuǎn)基因陽性株系，其中WT為 野生型水稻 'kitaake'，E1934H-50、E1934H-65 為 EAR-0s06g47150 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0031] 圖4為本發(fā)明實施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的表型寬度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，E1934H-50、E1934H-65 為 EAR-0s06g47150 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0032] 圖5為本發(fā)明實施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果；其中WT為野 生型水稻 'kitaake'，E1934H-50、E1934H-65 為 EAR-0s06g47150 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0033] 圖6為本發(fā)明實施例1中pCambial301_UbiN載體圖譜。

【具體實施方式】
[0034] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0035] 實施例1
[0036] 0s06g47150基因⑶S序列的獲得及植物表達載體的構建
[0037] 10s06g47150基因 CDS序列的獲得
[0038] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s06g47150基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物，正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACTTTCGTGGATTC-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCCT AAAACTGGACTGACCT-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用引物F和R進 行PCR，獲得0s06g47150基因完整的CDS序列（如SEQ ID No. 1所示)。
[0039] 2植物表達載體的構建
[0040] 將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構建到4個轉(zhuǎn)錄 因子抑制基序EAR編碼基因（如SEQ ID No. 4所示）的下游。
[0041] 2. 1將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上
[0042] 按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。此過程中包含兩輪PCR，第 一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物（F和R)，而第二輪的模板用第一 輪的 PCR 產(chǎn)物，并且引物用完整的 adaptor attB 引物（attB5' adaptor :5' -GTGGGGACAAGTT TGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor : 5' -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'） 。將PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完 全相同的序列。
[0043] 2. 2植物表達載體的構建
[0044] 以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架序列， 通過體外重組，將ubi promoter-EAR-Gateway表達單兀、35S promoter-asRED表達單兀和 35S promoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nEAR-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示，載體圖譜見圖1。
[0045] 表達載體nEAR-hyg-asRED含有Gateway重組系統(tǒng)，pDONR帶有目的基因的質(zhì)粒作 為入門載體（Entery vector),通過LR反應可完成目的基因表達載體的構建。
[0046] 通過LR反應將0s06g47150基因的⑶S序列構建到其目的基因的5'端連有EAR 編碼基因的植物表達載體nEAR-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子 EAR-Linker-0s06g47150 基因的表達載體 ubi :EAR-0s06g47150,其全序列如 SEQ ID No. 6 所示，載體圖譜見圖2。
[0047] LR反應體系如下：
[0048]

【權利要求】
1. 一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于，其為融合蛋白EAR-Linker-0s06g47150 ; 其中，EAR為來自植物轉(zhuǎn)錄因子的一段具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的蛋白基序，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 10所示；Linker由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所 示；0s06g47150為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列 經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權利要求1所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因。
3. 含有權利要求2所述基因的載體。
4. 含有權利要求2所述基因的工程菌。
5. -種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導的方法，將權利要求 3所述的載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的 材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
6. 權利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應用。
7. 用于擴增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因⑶S序列的引物對，其特征在于，包括正向 引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGATAACTITCGTGGAITC-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGG TCCTAAAACTGGACTGACCT-3，； 其中，水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因的⑶S序列為： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因 CDS序列在調(diào)控水稻籽粒性狀中的應用。
9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，其是利用轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR與水稻轉(zhuǎn) 錄因子0s06g47150融合構建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因 轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s06g47150基因的 CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構建到轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR編碼基因的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而 改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子抑制基序EAR編碼基因的核苷酸序列如SEQID No. 4所示。
【文檔編號】C12R1/19GK104418955SQ201310370089
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權日:2013年8月22日
【發(fā)明者】劉軍, 劉斌, 趙濤, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所