雞生長(zhǎng)相關(guān)基因foxo3作為分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家禽分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體提供與雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)的FOXO3基因G66716193A位點(diǎn)作為分子標(biāo)記在雞生產(chǎn)性能研究上的應(yīng)用。所述基因片段的核苷酸序列如序列表SEQNO:1所示，其中在序列表SEQNO:1的第102bp處有一個(gè)G→A突變，該位點(diǎn)與雞的多個(gè)生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)（P＜0.05）或極顯著相關(guān)（P＜0.01）,AG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，充分體現(xiàn)了雜種優(yōu)勢(shì)。等位基因A為優(yōu)勢(shì)等位基因。同時(shí)公開(kāi)了擴(kuò)增所述基因和檢測(cè)序列表SEQNO:1的第102處G/A堿基突變確實(shí)的上下游引物序列。本發(fā)明為雞分子標(biāo)記輔助選擇提供了一種新標(biāo)記。
【專利說(shuō)明】雞生長(zhǎng)相關(guān)基因F0X03作為分子標(biāo)記的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及家禽分子標(biāo)記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及雞生長(zhǎng)相關(guān)基因F0X03作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)地方品種肉雞資源非常的豐富，但與國(guó)外商業(yè)品種相比生產(chǎn)性能不佳，良種問(wèn)題已成為限制高效養(yǎng)雞生產(chǎn)的瓶頸，而生長(zhǎng)性狀對(duì)于雞的生產(chǎn)和育種具有重要意義。由于生長(zhǎng)性狀為數(shù)量性狀，受微效多基因系統(tǒng)控制，在生長(zhǎng)發(fā)育中呈動(dòng)態(tài)變化，其遺傳進(jìn)展緩慢。因此標(biāo)記輔助選擇是提高雞生長(zhǎng)性狀遺傳進(jìn)展的有效途徑，但前提是要找到與該性狀緊密連鎖的標(biāo)記。將DNA分析做為主要的研究手段應(yīng)用于肉雞的育種中，主要目的是通過(guò)在DNA分子水平上尋找與肉雞生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，用于早期的選育，從而加快育種進(jìn)程。
[0003]雞的生長(zhǎng)性狀是一個(gè)復(fù)雜的性狀，極易受環(huán)境的影響。隨著對(duì)雞生長(zhǎng)研究的不斷深入，已經(jīng)鑒定出大量與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因，生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)、生長(zhǎng)抑素(SS)、生長(zhǎng)激素(GH)、生長(zhǎng)激素受體(GHR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體(IGFR)、IGF結(jié)合蛋白(IGFBPs)，肌肉調(diào)節(jié)因子(MyoD)等。同時(shí)，這些與生長(zhǎng)相關(guān)的基因的變異可能導(dǎo)致生長(zhǎng)的差異。
[0004]胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子(INS/IGF-1)通路即(INS/IGF-1-PI3K-Akt-Fox0)通路是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)重要通路，而F0X03基因是此通路上的一個(gè)關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞系 中，通過(guò)RNAi抑制F0X03的表達(dá)可增加肌漿球蛋白的表達(dá)，且F0X03可通過(guò)調(diào)控MyoD控制肌細(xì)胞分化(Hu et al.，2008 ;王明輝，2011)。IGF-1是miRNA-1的靶基因，miRNA-1可以調(diào)控IGF-1的表達(dá)，而在Leonardo Elia等(2009)的研究中，IGF-1又可以通過(guò)通路中的F0X03a來(lái)調(diào)節(jié)miRNA-1的表達(dá)，從而形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)回路。王明輝(2011)在博士論文中利用SNaPshot技術(shù)分型，對(duì)豬基因多態(tài)性及多態(tài)位點(diǎn)與生長(zhǎng)發(fā)育性狀間的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)F0X03基因?qū)_(dá)60kg體重天數(shù)、達(dá)IOOkg體重天數(shù)、增重、日采食量與日增重密切相關(guān)。這些報(bào)道都有力地證明了 F0X03基因在動(dòng)物的肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)發(fā)育中扮演者重要角色。
[0005]然而，F(xiàn)0X03基因在雞上的研究還鮮有報(bào)道，迄今為止，尚無(wú)有關(guān)雞F0X03基因作為雞生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因F0X03作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ NO:1所示，其中在序列表SEQ NO:1的第102bp處有I個(gè)G/A突變。
[0007]所述的分子標(biāo)記為與肉雞生長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記。
[0008]所述的應(yīng)用為肉雞的早期的選育。[0009]再提供一種作為分子標(biāo)記應(yīng)用的與雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)的F0X03基因片段，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQ NO:1所示，其中檢測(cè)序列表SEQ NO:1的第102bp處G/A突變的正反向引物對(duì)的DNA序列如下所示:
正向引物5’到3’為SEQ NO:2，
反向引物5’到3’為SEQ NO:3。
[0010]根據(jù)需求再提供一種肉雞的選育方法，包括以下步驟:
51.待檢測(cè)雞的DNA提取，
52.目的片段的獲得及測(cè)序:利用SEQN0:2和SEQN0:3，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增待測(cè)雞的DNA,將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分型。
[0011]S3.根據(jù)測(cè)序分型的結(jié)果，選擇判定為雜合子的待檢測(cè)雞為本發(fā)明所需要的肉雞。
[0012]為了更好地理解本發(fā)明，以下對(duì)本發(fā)明方案結(jié)合反應(yīng)式作進(jìn)一步的闡釋，其不能作為本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0013]本發(fā)明通過(guò)制備獲得了一個(gè)肉雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因F0X03作為分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQN0:1所示，其中在序列表SEQN0:1的第102處有1個(gè)G/A突變。
[0014]用于擴(kuò)增F0X03基因和檢測(cè)序列表SEQN0:1的第102處G/A突變的正反向引物的DNA序列如下所示:正向引物:5’ ccagccttcccatttccatca3’ ；反向引物:5' cgggagttctgggcggacac3'。
[0015]本發(fā)明的具體步驟如下:
1)從被檢測(cè)雞群血液樣本中提取雞基因組DNA；；
2)根據(jù)UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)雞 F0X03 基因組序列(http: //genome, ucsc.edu/cg1-bin/hgBlat),該位點(diǎn)位于基因組66716193處，所以該位點(diǎn)的G/A突變記為G66716193A，利用生物學(xué)引物設(shè)計(jì)軟件GeneTool設(shè)計(jì)包含該位點(diǎn)的正反向引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。所述引物的核苷酸序列如下:
正向弓丨物:5’ccccagaagtgaaagga3’
反向弓丨物:5’gaaacagaggtgccaaa3’ ；
3)PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?94℃變性3min，32次循環(huán)(94°C: 30s, 58°C 30s, 72°C lmin)72°C延伸10min，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
該位點(diǎn)的變異不能被合適的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割來(lái)區(qū)分基因型，故采用測(cè)序分型的方法在被檢測(cè)雞群中分型。
[0016]通過(guò)本發(fā)明的分子標(biāo)記所選育出來(lái)的肉雞，生長(zhǎng)性狀得到了提高，可以作為種雞使用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0018]圖2為分型結(jié)果展示。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1 (制備實(shí)施例)
1、雞血樣的采集和DNA的提取:被測(cè)雞群的系譜情況及生長(zhǎng)性狀測(cè)定完成后，采用一次性注射器從雞翅下靜脈中抽取約ImL血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約200 μ L2%無(wú)菌EDTA(Ethylenediaminetetraaceticacid, EDTA)抗凝劑的1.5mL離心管中，輕輕搖勻，記錄翅號(hào)，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]基因組DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奧斯泊F等，1998):
(1)取全血30μ L置于1.5mL離心管，分別加入470 μ LI X SET緩沖液、12.5 μ L20%SDS和6 μ L10mg/mL蛋白酶K，混合均勻后放于55°C水浴過(guò)夜；
(2)取出樣本于1.5mL離心管，加入500 μ L飽和苯酌.，輕搖20min, 10, OOOrpm離心IOmin ；
(3)取上清,再次加入500μ L飽和苯酹,輕搖20min, 10, OOOrpm離心IOmin ；
(4)取上清,加入500μ L氯仿-異戍醇(23:1)輕搖20min, 10, OOOrpm離心IOmin ；
(5)取上清，加入ImL冰無(wú)水乙醇(_20°C)，來(lái)回?fù)u擺以沉淀DNA，10,OOOrpm離心IOmin后倒出乙醇；
(6)用lmL75%乙醇清洗DNA—次，倒掉乙醇，置于50°C干燥箱內(nèi)烘干；(7)待DNA完全干燥后加入300 μ L滅菌后的雙蒸水溶解，50°C水浴鍋中過(guò)夜以溶解DNA ； (8)存放于_20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0021]2、目的片段的獲得及測(cè)序分型
(I)擴(kuò)增含待測(cè)位點(diǎn)的核苷酸片段
根據(jù)雞F0X03基因組序列，設(shè)計(jì)包含待測(cè)位點(diǎn)序列的引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增被測(cè)雞群的DNA，獲得的產(chǎn)物，委托上海美吉生物公司測(cè)序。
[0022]3、基因型判定及關(guān)聯(lián)分析
根據(jù)測(cè)序的結(jié)果判定該位點(diǎn)在檢測(cè)群體中的基因型。結(jié)果如圖2所示，如果該樣本是純合子的話，就只有一個(gè)產(chǎn)物峰:G峰或A峰。如果是雜合，那么就會(huì)出現(xiàn)2個(gè)峰:G峰和A峰。
[0023]實(shí)施例2 (應(yīng)用實(shí)施例)
對(duì)F0X03基因多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與雞生長(zhǎng)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析的檢測(cè)應(yīng)用。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表I所示。由表中可以得出G66716193A位點(diǎn)與雞7，14，21，35，42，49，56，70，77，84日齡體重，70日齡徑長(zhǎng)，70日齡徑寬和4-8周齡平均周增重量呈顯著相關(guān)(P〈0.05)或極顯著相關(guān)(P〈0.01)。其中雜合子基因型AG在各日齡階段的體重明顯比純合子基因型AA和GG重，4-8周齡時(shí)平均每周的增重量也比較多，徑長(zhǎng)和徑寬也比純合子基因型要長(zhǎng)要寬，所以AG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。比較AA基因型和GG基因型，性狀差異不是很顯著，但總體來(lái)說(shuō)，AA基因型比GG基因型略顯優(yōu)勢(shì)，所以等位基因A為優(yōu)勢(shì)等位基因。
[0024]表1F0X03基因G66716193A位點(diǎn)與雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)性分析
【權(quán)利要求】
1.雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因F0X03作為分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于,所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，其中在SEQ NO:1的第102bp處有I個(gè)G/A的雜合子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的分子標(biāo)記為與肉雞生長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為肉雞的早期的選育。
4.一種作為分子標(biāo)記應(yīng)用的與雞生長(zhǎng)性狀相關(guān)的F0X03基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ NO:1所示，其中檢測(cè)序列表SEQ NO:1的第102bp處G/A突變的正反向引物對(duì)的DNA序列如下所示: 正向引物5’到3’為SEQ NO:2， 反向引物5’到3’為SEQ NO:3。
5.一種肉雞的選育方法，其特征在于，包括以下步驟: ` 51.待檢測(cè)雞的DNA提取， ` 52.目的片段的獲得及測(cè)序:利用SEQN0:2和SEQN0:3，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增待測(cè)雞的DNA，將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分型； ` 53.根據(jù)測(cè)序分型的結(jié)果，選擇判`定為雜合子的待檢測(cè)雞為本發(fā)明所需要的肉雞。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103436534SQ201310336161
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月5日
【發(fā)明者】聶慶華, 何小梅, 蘇澤婷, 張細(xì)權(quán) 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)