一種高靈敏度檢測和鑒定人冠狀病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高靈敏度檢測和鑒定6種人冠狀病毒的方法，該方法是以排除PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染為前提、以多重PCR–質(zhì)譜聯(lián)用為平臺的高靈敏度檢測和/或鑒定人冠狀病毒的方法，本發(fā)明檢測的6種人類冠狀病毒包括：HCoV-229E,HCoV-OC43,HCoV-NL63,HCoV-HKU1,SARS-CoV和MERS-CoV，檢測部位為6種病毒基因組中的特異序列區(qū)，可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)中對6種人冠狀病毒進(jìn)行多基因檢測，提高檢出率，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡便，快速，高通量的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于科研、臨床和流行病學(xué)調(diào)查。
【專利說明】一種高靈敏度檢測和鑒定人冠狀病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種病原微生物的檢測方法，特別涉及一種高靈敏度檢測和鑒定人冠狀病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人冠狀病毒(human coronavirus, HCoV)屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus )，是單鏈正義RNA病毒。病毒粒子呈不規(guī)則形狀，外包脂肪膜，膜表面有三種糖蛋白:刺突糖蛋白(S, Spike Protein);小包膜糖蛋白(E, Envelope Protein);膜糖蛋白(M, Membrane Protein)。
[0003]HCoV是是成人普通感冒的主要病原之一，在兒童可以引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。目前已發(fā)現(xiàn)的HCoV有6種:HCoV-229E, HCoV_0C43，SARS-CoV, HC0V-NL63，HCoV-HKUl和MERS-CoV。其中，最早發(fā)現(xiàn)的HCoV_229E和HCoV_0C43主要引起上呼吸道感染，癥狀較輕。2002年11月底，在我國廣東地區(qū)發(fā)生了一種不明原因的以近距離空氣飛沫和密切接觸傳播為主的呼吸道急性傳染病，國內(nèi)稱之為傳染性非典型肺炎，即“非典”;世界衛(wèi)生組織將其命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)，后證實(shí)由SARS-CoV引起。SARS是本世紀(jì)新發(fā)現(xiàn)的一種嚴(yán)重傳染病，播及到30多個(gè)國家和地區(qū)，其中以東南亞為主要疫區(qū)。之后，HCoV-NL63，HCoV-HKUl相繼被發(fā)現(xiàn)，其中HCoV-NL63可引起上呼吸道感染，細(xì)支氣管炎和肺炎，感染小兒時(shí)可出現(xiàn)嚴(yán)重下呼吸道癥狀；而HCoV-HKUl感染多表現(xiàn)為細(xì)支氣管炎和肺炎。2012年9月，一種新的冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)被發(fā)現(xiàn)，它可引起人類嚴(yán)重急性呼吸道感染(severe acute respiratory infection, SARI),截止 2013 年 6 月 18 日，已發(fā)現(xiàn)64位患者，其中38人死亡。
[0004]由于HCoV可引起嚴(yán)重呼`吸系統(tǒng)疾病，因此對它的快速檢測顯得尤為重要。經(jīng)典的檢測方法包括病毒培養(yǎng)和血清學(xué)檢測，但是由于耗時(shí)長，靈敏度低，已不能滿足臨床需求。基于核酸檢測的RT-PCR及熒光定量PCR方法成為新的主要檢測手段，常用的方法是針對單個(gè)病毒的，由于通量低，造成檢測工作量加大，嚴(yán)重影響了 HCoV與人類疾病關(guān)系的深入研究。因此開發(fā)高通量多重檢測方法成為迫切需要。如中國專利申請CN102732638A采取5種熒光，對 HCoV-229E, HCoV-0C43, SARS-CoV, HCoV-NL63 和 HCoV-HKUl 進(jìn)行檢測，就是在這種背景下產(chǎn)生的。但是由于這種方法需要使用熒光染料，對實(shí)際操作要求較高。而且，這種方法針對每種HCoV只采用一條探針進(jìn)行檢測。由于HCoV基因組存在一定變異，這種方法會造成一定程度的漏檢。目前對6種HCoV在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行檢測的方法未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服上述技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種基于質(zhì)譜平臺的高靈敏度、高通量、采用多探針可同時(shí)檢測6種HCoV的方法。
[0006]本發(fā)明檢測的6 種 HCoV 包括:HCoV-229E, HCoV_0C43，HCoV-NL63, HCoV-HKUl, SARS-CoV和MERS-CoV，檢測部位為病毒基因組中特異序列。
[0007]本發(fā)明的檢測方法，包括以下步驟:
[0008]1、引物設(shè)計(jì):涵蓋2013年6月之前公開發(fā)表的6種HCoV，包括:HCoV_229E，HCoV-0C43, HCoV-NL63, HCoV-HKUl, SARS-CoV和MERS-CoV。根據(jù)待測人冠狀病毒全序列，選擇每種病毒的特異性保守序列，設(shè)計(jì)PCR引物，在引物的5 ’端帶有10個(gè)堿基(ACGTTGGATG)任意組合的標(biāo)簽序列，使總長度達(dá)到30個(gè)堿基以上，用以從分子量上將引物與探針區(qū)別開。在擴(kuò)增區(qū)中的保守序列區(qū)設(shè)計(jì)一條單堿基延伸探針，探針的長度為14-28個(gè)堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個(gè)經(jīng)設(shè)計(jì)確定的堿基，作為該基因型特異性序列標(biāo)記，單堿基延伸后總長度不超過29個(gè)堿基，每個(gè)探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少30Da。各種人冠狀病毒擴(kuò)增引物序列見表1，其對應(yīng)的喊基延伸探針見表2。
[0009]2、PCR反應(yīng):在PCR過程中引入尿嘧啶N糖基化酶(UNG酶)技術(shù)，在首次PCR反應(yīng)體系中，采用以dUTP替代常規(guī)PCR的dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG酶處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG酶在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR反應(yīng)及產(chǎn)物，徹底排除了 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染引起的假陽性問題。通過第一輪PCR擴(kuò)增，獲得待測樣本中靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0010]3、蝦堿性磷酸酶(SAP)處理:使未結(jié)合的剩余核酸(dNTPs)脫磷酸失活，預(yù)防干擾下一步堿基延伸反應(yīng)。
[0011]4、堿基延伸反應(yīng):在第二輪擴(kuò)增中進(jìn)行單堿基延伸探針的3’端，延伸一個(gè)序列特異性單核苷酸，作分子量標(biāo)記，得到的延伸產(chǎn)物與所述延伸探針及各型別延伸產(chǎn)物之間的分子量差異不小于16Da,
[0012]5、樹脂脫鹽:純`化延伸反應(yīng)產(chǎn)物。
[0013]6、質(zhì)譜檢測:將純化后產(chǎn)物采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF-MASS)系統(tǒng)進(jìn)行分子量檢測，根據(jù)分子量標(biāo)記確定待測HCoV類別，軟件自動處理報(bào)告每種病毒的檢測結(jié)果和可信程度。
[0014]本發(fā)明的檢測方法，優(yōu)選的包括以下步驟:
[0015](I)用一對PCR引物，在引物的5’端帶有ACGTTGGATG堿基的任意組合的標(biāo)簽序列，使總長度達(dá)到30個(gè)堿基以上，以區(qū)別于探針；在擴(kuò)增區(qū)中的保守序列設(shè)計(jì)一條單堿基延伸探針，探針的長度為14-28個(gè)堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個(gè)經(jīng)設(shè)計(jì)確定的堿基，作為該基因型特異性序列標(biāo)記，單堿基延伸后總長度不超過29個(gè)堿基；
[0016](2)第一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將dUTP/dNTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反應(yīng)體系中，先進(jìn)行dUTP的消化，降解PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后滅活UNG酶，隨后作45個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，獲得待測樣本中靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0017](3)用蝦堿性磷酸酶處理，使第一輪反應(yīng)中剩余dNTP脫磷酸失活；
[0018](4)第二次單堿基延伸擴(kuò)增，將ddNTPs加入反應(yīng)體系中，使之在單堿基延伸探針的3’端，延伸一個(gè)序列特異性單核苷酸，作分子量標(biāo)記，擴(kuò)增200個(gè)循環(huán)，每個(gè)探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少16Da ；
[0019](5)采用陽離子交換樹脂吸附鹽離子，純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物；
[0020](6)純化后產(chǎn)物采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分子量檢測，根據(jù)分子量標(biāo)記確定待測HCoV的類型。[0021]其中所述步驟(1)引物設(shè)計(jì)中每一種待測HCoV，采用特異序列區(qū)。引物序列為SEQID N0.1 至 SEQ ID N0.28，探針序列為 SEQ ID N0.31 至SEQ ID N0.44。
[0022]所述步驟(1)中，優(yōu)選的采用了樣品質(zhì)量控制參照，引物序列為SEQ ID N0.29和SEQ ID N0.30，探針序列為 SEQ ID N0.45。
[0023]優(yōu)選的在每次反應(yīng)中加入陰性對照，所述陰性對照為去離子雙蒸水。
[0024]本發(fā)明的方法，檢測濃度低至10拷貝/ul。
[0025]表1
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種可同時(shí)檢測6種人冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含SEQ IDN0.1-SEQ ID N0.45 的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述人冠狀病毒包括:humancoronavirus229E (HCoV-229E), human coronavirus 0C43 (HCoV-0C43), human coronavirusNL63(HCoV-NL63), human coronavirus HKUl(HCoV-HKUl), SARS coronavirus(SARS-CoV)和 MERS coronavirus(MERS-CoV)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中，SEQID N0.1-SEQ ID N0.28為6種人冠狀病毒的正向和反向引物序列；SEQ ID N0.31-SEQ ID N0.44為堿基延伸探針序列；SEQ ID N0.29和SEQ ID N0.30為質(zhì)控引物序列；SEQ ID N0.45為質(zhì)控堿基延伸探針序列。
4.權(quán)利要求1的試劑盒的使用方法，其特征在于，每種病毒采用針對特異基因區(qū)序列探針檢測，所述方法包括以下步驟: (1)用一對PCR引物，在引物的5’端帶有ACGTTGGATG堿基的任意組合的標(biāo)簽序列，使總長度達(dá)到30個(gè)堿基以上，以區(qū)別于探針；在擴(kuò)增區(qū)域中的保守序列區(qū)設(shè)計(jì)一條單堿基延伸探針，探針的長度為14-28個(gè)堿基，在探針的3’末端，允許延伸一個(gè)經(jīng)設(shè)計(jì)確定的堿基，作為該病毒特異性序列標(biāo)記，單堿基延伸后總長度不超過29個(gè)堿基； (2)第一次PCR擴(kuò)增反應(yīng)，將dUTP/dATP/dGTP/dCTP混合物、UNG酶、Taq酶和多重PCR引物一同加入PCR反應(yīng)體系中，先進(jìn)行dUTP的消化，降解PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后滅活UNG酶，隨后作45個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，獲得待測樣本中靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)用蝦堿性磷酸酶處理，使第一輪反應(yīng)中剩余dNTP脫磷酸失活； (4)第二次單堿基延伸擴(kuò)增，將ddNTPs或類似核酸末端終止劑加入反應(yīng)體系中，使之在單堿基延伸探針的3’端， 延伸一個(gè)序列特異性單核苷酸，作分子量標(biāo)記，擴(kuò)增200個(gè)循環(huán)，每個(gè)探針的延伸產(chǎn)物之間分子量相差至少30Da ； (5)采用陽離子交換樹脂吸附鹽離子，純化延伸反應(yīng)產(chǎn)物； (6)純化后產(chǎn)物采用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分子量檢測，根據(jù)分子量標(biāo)記確定待測人冠狀病毒的類型。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484564SQ201310309972
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月23日
【發(fā)明者】彭俊平, 郭軍華, 金奇 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所, 郭軍華