專利名稱：用于抗SARS冠狀病毒治療的RNAi物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于治療嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)的組合物和方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明描述了以呼吸道感染(包括SARS冠狀病毒)為目標(biāo)的核酸物質(zhì)(如siRNA分子)及其類似物和其使用方法，用于臨床治療SARS和呼吸道病毒感染、用于生物防御所需的預(yù)防和治療呼吸道感染、用于治療呼吸道疾病以及用于開(kāi)發(fā)呼吸道疾病和感染的治療靶點(diǎn)。本發(fā)明提供對(duì)人肺部疾病(包括遺傳疾病、感染性疾病、病理狀況和自身免疫疾病)的治療和方法。本發(fā)明還提供siRNA物質(zhì)和傳遞方法，以抑制基因在動(dòng)物疾病模型(例如小鼠和猴)中的表達(dá)，作為開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證藥物靶點(diǎn)功能的工具。
背景技術(shù)：
最近，在亞洲、北美和歐洲報(bào)道了一種叫做嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)的新疾病[1]。到2003年5月15日為止，在全世界已經(jīng)報(bào)道了約7628例SARS，587例死亡。一般而言，SARS始于超過(guò)100.4(＞38.0℃)的發(fā)燒。其它癥狀可包括頭痛、全身感覺(jué)不適及肌體疼痛。一些人還出現(xiàn)了輕微的呼吸道癥狀。2-7天后，SARS患者可發(fā)展為干咳和呼吸困難。大部分的SARS病例都涉及照料SARS患者或與SARS患者生活的人，或者直接接觸SARS患者的感染物(例如呼吸道分泌物)的人。SARS傳播的可能方式包括接觸其它人的皮膚或污染傳染性飛沫的物體，然后接觸你的眼睛、鼻子或嘴。因?yàn)檫@些疾病的病原學(xué)還沒(méi)有確定，所以當(dāng)時(shí)不能提出特別的治療建議。經(jīng)驗(yàn)療法應(yīng)包括對(duì)任何病原學(xué)不清楚的社區(qū)獲得性肺炎相關(guān)生物的覆蓋，包括具有抗典型和非典型呼吸道病原體活性的藥物。疾病嚴(yán)重程度可影響治療選擇。推薦傳染病會(huì)診。
與呼吸道感染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)相類似，許多肺部和呼吸道疾病沒(méi)有獲得足夠治療，包括哮喘和COPD。這些疾病和其它的呼吸道疾病需要更好的與該疾病相關(guān)的生化途徑抑制劑。本發(fā)明使用設(shè)計(jì)用于抑制疾病途徑中的選定基因并以本發(fā)明提供方式傳遞的siRNA，突破了當(dāng)前在呼吸道和肺部疾病治療方面的局限。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于抑制SARS-冠狀病毒(SARS-CoV)活性或其他病毒的新的RNA干擾(RNAi)物質(zhì)及傳遞方法。本發(fā)明提供對(duì)病毒關(guān)鍵蛋白生產(chǎn)的抑制，這些關(guān)鍵蛋白是復(fù)制、感染和病毒生命周期的其它關(guān)鍵功能所必需的。本發(fā)明還提供對(duì)病毒基因組RNA的直接破壞。本發(fā)明提供RNAi物質(zhì)小干擾RNA(siRNA)的序列，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物中具有有效抗病毒活性，可為化學(xué)合成或載體表達(dá)的、體外轉(zhuǎn)錄和載體表達(dá)的shRNA、siRNA、miRNA和其它類型的siRNA分子；用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物氣道和肺組織中進(jìn)行siRNA-介導(dǎo)的基因抑制的物質(zhì)；用于將siRNA有效傳遞入動(dòng)物模型氣道的物質(zhì)；SARS-CoV特異性siRNA雙鏈體在哺乳動(dòng)物中抑制病毒感染和復(fù)制的作用機(jī)制；編碼冠狀病毒復(fù)制和感染所需的關(guān)鍵蛋白的靶序列；編碼和非編碼區(qū)中用于si-RNA介導(dǎo)的冠狀病毒病毒RNA基因組破壞的靶序列；傳遞核酸物質(zhì)及類似物給哺乳動(dòng)物的途徑和方法；檢測(cè)病毒RNA基因組任一部分的基于RNA模板特異性RNA的RT-PCR方法和試劑，用于診斷和預(yù)后；以及使用核酸物質(zhì)及類似物治療肺部疾病和感染的方法。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種分離的雙鏈RNA分子，其含有的第一鏈具有對(duì)應(yīng)于SARS病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有的第二鏈具有與SARS病毒核苷酸序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中該雙鏈分子抑制SARS病毒核苷酸序列的表達(dá)。
第一鏈和第二鏈可為單獨(dú)的互補(bǔ)鏈，或者可包含在單個(gè)分子中，其中該單個(gè)分子含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。SARS病毒的核苷酸序列可為例如nsp1序列、nsp9序列或刺突蛋白序列。
第一鏈可含有選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
本發(fā)明還提供檢測(cè)樣品中SARS病毒的方法(a)使得自樣品的RNA與基因特異性引物接觸，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA分子，其中所述基因特異性引物含有與SARS序列互補(bǔ)的3′區(qū)和與SARS序列不互補(bǔ)的5′序列，接著(b)使用一對(duì)引物以PCR擴(kuò)增第一鏈cDNA，其中第一個(gè)引物與基因特異性引物的5′區(qū)互補(bǔ)，其中第二個(gè)引物含有SARS基因組中基因特異性引物3′區(qū)識(shí)別區(qū)域上游的序列，以及(c)檢測(cè)PCR產(chǎn)物?；蛱禺愋砸锟膳c例如SARS nsp1、nsp9或刺突蛋白序列互補(bǔ)?；蛱禺愋砸锟珊羞x自以下的序列GAACAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gac aac ctg ctc ataaa、GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gag gat gggcat cag ca和GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gtgtta aaa cca gaa gg。第一個(gè)引物可含有序列GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。第二個(gè)引物可含有選自以下的序列GGG AAG TTC AAG GTT ACA AGA ATG TGAGAA、CGG TGT AAG TGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG和CCTTGA CCG GTG CAC CAC TTT TGA TGA TGT。
本發(fā)明還提供治療或預(yù)防患者冠狀病毒感染(例如SARS病毒感染)的方法給予患者有效量的含分離雙鏈RNA分子的組合物，其中所述RNA分子含有的第一鏈包含對(duì)應(yīng)于冠狀病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有的第二鏈包含與冠狀病毒核苷酸序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中該雙鏈分子抑制冠狀病毒核苷酸序列的表達(dá)。第一鏈和第二鏈可為單獨(dú)的互補(bǔ)鏈，或者可包含在單個(gè)分子中，其中該單個(gè)分子含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。SARS病毒的核苷酸序列可為例如nsp1序列、nsp9序列或刺突蛋白序列。第一鏈可含有選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。雙鏈RNA分子可含有選自以下的序列SC2、SC5、SC14和SC15。
在以上的治療或預(yù)防方法中，可通過(guò)例如鼻內(nèi)傳遞或傳遞入氣管，將雙鏈RNA分子傳遞入患者氣道。組合物可在載體中含有雙鏈RNA分子，該載體含無(wú)RNA酶的葡萄糖水溶液，例如5％葡萄糖溶液。雙鏈RNA分子的劑量可為1-100mg/kg患者體重。組合物還可以作為無(wú)RNA的水溶液在氣溶膠或粉末中傳遞。
本發(fā)明還提供治療患者呼吸道疾病的方法給予患者氣道雙鏈RNA分子，該RNA分子含有的第一鏈包含對(duì)應(yīng)于疾病相關(guān)基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列，其含有第二鏈包含與該基因核苷酸序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中疾病相關(guān)基因在疾病中表現(xiàn)出不需要的高水平基因表達(dá)，其中雙鏈分子抑制疾病相關(guān)基因核苷酸序列的表達(dá)。疾病相關(guān)基因可為病原生物如細(xì)菌、病毒或真菌的基因。疾病還可為例如自身免疫炎癥或肺癌。
由以下的詳述可清楚看出本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢(shì)。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，給出的詳述和具體實(shí)施例盡管顯示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是說(shuō)明性的，因?yàn)楦鶕?jù)此詳述，屬于本發(fā)明精神和范圍的各種改變和修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示SARS冠狀病毒CUHK-WIUrbani的基因組結(jié)構(gòu)。SARS冠狀病毒CUHK-WI毒株(AY278554.1)的基因組序列長(zhǎng)29206bp?；虻拇笮“幢壤L出。結(jié)構(gòu)蛋白以實(shí)心方框表示。L是前導(dǎo)序列；“p65？”表示推定的MHVp65樣蛋白；數(shù)字1-13表示非結(jié)構(gòu)(nsp)蛋白，其中nsp8在公開(kāi)的序列數(shù)據(jù)中遺漏了。S是刺突蛋白；M是膜糖蛋白；U是未知蛋白。箭頭表示非結(jié)構(gòu)多蛋白。黑條顯示siRNA-靶向序列的位置。
圖2顯示29727bp長(zhǎng)的SARS冠狀病毒Urbani毒株(AY278741.1)的基因組結(jié)構(gòu)?；虻拇笮“幢壤L出。結(jié)構(gòu)蛋白以實(shí)心方框表示。S是刺突蛋白；E是包膜蛋白；M是膜糖蛋白；N是核殼磷蛋白。箭頭表示非結(jié)構(gòu)多蛋白。編號(hào)的黑條顯示siRNA-靶向序列的位置。
圖3顯示不同SARS冠狀病毒分離株上siRNA靶的位置。使用基于SARS冠狀病毒CUHK-WI設(shè)計(jì)的靶序列查明其對(duì)不同SARS冠狀病毒分離株的特異性。第5個(gè)和第6個(gè)靶序列(刺突蛋白-1和-2)與GZ-01分離株的“錯(cuò)配”只不過(guò)是因?yàn)樘峤坏腉Z01分離株的序列數(shù)據(jù)不完整；HKU39849上的第3個(gè)靶序列(nsp9-A)的錯(cuò)配是因?yàn)樵贖KU39849序列中的13496nt位置有一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配，其它分離株的基因組序列不存在此情況。
圖4顯示向肺系統(tǒng)的核酸傳遞。經(jīng)多個(gè)途徑進(jìn)行氣道傳遞非常有效。氣溶膠、鼻內(nèi)裝置和口-氣管傳遞是傳遞RNAi分子的非侵入性途徑。
圖5顯示siRNA在肺中對(duì)熒光素酶表達(dá)的抑制。使用5％葡萄糖或Infasurf，將熒光素酶質(zhì)粒連同GFP或熒光素酶特異性siRNA經(jīng)口-氣管傳遞給小鼠。16小時(shí)后檢測(cè)肺勻漿中的熒光素酶活性。
圖6顯示使用鼻孔傳遞途徑時(shí)，熒光標(biāo)記的siRNA在小鼠呼吸道中的分布。將30μg熒光標(biāo)記的siRNA雙鏈體的50μl鼻孔傳遞溶液(5％葡萄糖和12μg/μl Infasurf)經(jīng)鼻孔傳遞途徑傳遞入呼吸道。傳遞后4小時(shí)，處死小鼠，分離呼吸道氣管和肺。組織的熒光顯微鏡檢測(cè)揭示，siRNA在呼吸道和肺中廣泛分布，甚至在用PBS清洗組織以去除非特異性粘附至細(xì)胞表面的siRNA之后也是如此。
圖7顯示使用口-氣管傳遞途徑時(shí)，熒光標(biāo)記的siRNA在小鼠呼吸道中的分布。將30μg熒光標(biāo)記的siRNA雙鏈體的50μl口-氣管傳遞溶液(5％葡萄糖和12μg/μl Infasurf)經(jīng)鼻孔傳遞途徑傳遞入呼吸道。傳遞后4小時(shí)，處死小鼠，分離呼吸氣管和肺。組織的熒光顯微鏡檢測(cè)揭示，siRNA在呼吸道和肺中廣泛分布，甚至在用PBS清洗組織以去除非特異性粘附至細(xì)胞表面的siRNA之后也是如此。
圖8顯示SARS-CoV基因組中48個(gè)siRNA靶向序列的位置。整個(gè)基因組約29.7kb，由14個(gè)ORF組成，這些ORF在5′端編碼復(fù)制酶和轉(zhuǎn)錄酶，在3′端編碼結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白。16個(gè)雙鏈體靶向ORF1a和ORF1b區(qū)，而32個(gè)雙鏈體靶向ORF2至ORF9區(qū)域。編碼刺突蛋白、膜糖蛋白、包膜蛋白和ORF3的區(qū)域各有6或7個(gè)雙鏈體大規(guī)模靶向。粗條表示各個(gè)siRNA靶向序列的位置。箭頭指向產(chǎn)生強(qiáng)抗-SARS-CoV活性的序列。
圖9顯示用于細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)染以測(cè)試其抗-SARS-CoV活性的48個(gè)siRNA分子。
圖10顯示siRNA在FRhK-4細(xì)胞中的抗病毒效力。A、B和C顯示了細(xì)胞在SARS-CoV感染作用下的CPE。當(dāng)健康細(xì)胞(A)受到病毒感染時(shí)，觀察到顯著的CPE(B)，相反，細(xì)胞先用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染接著再用病毒感染時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的CPE(C)。
圖11顯示SARS-CoV的電鏡照片，箭頭表示感染細(xì)胞中的SARS-CoV(D)，相反，在先用siRNA轉(zhuǎn)染保護(hù)接著用病毒感染的細(xì)胞中，沒(méi)有可見(jiàn)的病毒(E)。
圖12顯示相對(duì)病毒基因組拷貝檢測(cè)的選定siRNA雙鏈體的預(yù)防效力。對(duì)全部48種雙鏈體進(jìn)行CPE篩選，選擇4種siRNASC2、SC5、SC14和SC15，測(cè)試其在FRhK-4細(xì)胞中作為預(yù)防劑的效力。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)揭示，這些siRNA雙鏈體能夠顯著(p＜0.01)減少病毒復(fù)制。
圖13顯示培養(yǎng)基中相對(duì)病毒量(TCID50)檢測(cè)的選定siRNA雙鏈體的預(yù)防效力。相比于沒(méi)有預(yù)處理的對(duì)照組，siRNA預(yù)處理組顯著(p＜0.01)下降。
圖14顯示siRNA-介導(dǎo)的預(yù)防效力的時(shí)程。在SC5 siRNA轉(zhuǎn)染后4、8、16、24、48、60和72小時(shí)感染FRhK-4細(xì)胞。36小時(shí)后，檢測(cè)病毒滴度，以評(píng)價(jià)siRNA在不同時(shí)間點(diǎn)抗SARS-CoV感染的預(yù)防效力。黑條表示未用siRNA預(yù)處理的樣品的相對(duì)病毒基因組拷貝，相反，白條表示預(yù)處理的樣品。每種樣品進(jìn)行三次平行測(cè)試，并圖示了標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖15顯示細(xì)胞培養(yǎng)物中用病毒基因組拷貝檢測(cè)的選定siRNA雙鏈體的治療效力。用SARS-CoV感染FRhK-4細(xì)胞，接著用SC2、SC5、SC14和SC15 siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)進(jìn)行治療效力檢測(cè)。每種樣品進(jìn)行三次平行測(cè)試，并圖示了標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖16顯示用病毒滴度(TCID50)檢測(cè)的選定siRNA雙鏈體的治療效力。每種樣品進(jìn)行三次平行測(cè)試，并圖示了標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖17顯示組合siRNA雙鏈體的治療效力。用SARS-CoV感染FRhK-4細(xì)胞，接著用各種組合的活性siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染，之后檢測(cè)相對(duì)病毒基因組拷貝。在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基進(jìn)行Q-RT-PCR和病毒滴度檢測(cè)。在用組合siRNA雙鏈體處理的感染細(xì)胞中觀察到顯著的抗病毒治療效力。每種樣品進(jìn)行三次平行測(cè)試，并圖示了標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖18用相對(duì)病毒基因組拷貝數(shù)顯示各種siRNA組合的預(yù)防效力。將4種選定siRNA雙鏈體的7種組合轉(zhuǎn)染入FRhK-4細(xì)胞，8小時(shí)后用SARS-CoV感染。感染后24小時(shí)收集樣品進(jìn)行Q-RT-PCR。
圖19顯示SC2和SC5 siRNA組合的保護(hù)效力的時(shí)程。黑條表示未用siRNA預(yù)處理樣品的相對(duì)病毒基因組拷貝，相反，白條表示預(yù)處理樣品。每種樣品進(jìn)行三次平行測(cè)試，并圖示了標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖20顯示以CMV驅(qū)動(dòng)熒光素酶和SARS-CoV序列(包括SC2和SC5)融合構(gòu)建的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCI-Luc-SC。當(dāng)SC2和SC5siRNA雙鏈體與該載體共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞時(shí)，熒光素酶表達(dá)水平顯著下調(diào)。
圖21顯示pCI-Luc-SC質(zhì)粒與SC2和SC5 siRNA雙鏈體通過(guò)氣管內(nèi)給予共傳遞入小鼠肺部后24小時(shí)的作用。肺中熒光素酶表達(dá)受抑制表示siRNA-介導(dǎo)的序列特異性抑制(knockdown)。
圖22顯示使用組合siRNA雙鏈體抑制肺中SARS-CoV感染的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究的病理組織學(xué)數(shù)據(jù)。用單獨(dú)的SARS-CoV感染或在不同的時(shí)間點(diǎn)通過(guò)鼻內(nèi)傳遞0.5ml鹽水溶液共傳遞SARS-CoV和siRNA雙鏈體，處理5組測(cè)試動(dòng)物，每組4只猴子。組I用SC2和SC5 siRNA(30mg/劑)組合處理，然后進(jìn)行SARS-CoV感染。組II用SC2-SC5 siRNA和SARS-CoV共給予(30mg/劑)，接著再給予兩劑。組III先用SARS-CoV病毒處理，然后重復(fù)傳遞3次SC2-SC5 siRNA組合。組IV用相同量的對(duì)照siRNA處理，接著進(jìn)行SARS-CoV感染。組V僅用SARS-CoV感染。處死猴子，收集肺組織進(jìn)行病理組織學(xué)分析。組I和組II顯示出病理改變比組IV和組V少得多。
圖23顯示代表病理改變的猴肺病理組織學(xué)染色。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過(guò)使用體內(nèi)傳遞的siRNA分子抑制冠狀病毒基因表達(dá)，提供在哺乳動(dòng)物中，特別是在靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人中，治療冠狀病毒感染的組合物和方法。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供在肺組織中對(duì)基因或基因組物質(zhì)的抑制。通過(guò)抑制病毒的基因或基因組，提供對(duì)感染性疾病的治療或預(yù)防療法。本發(fā)明提供短雙鏈RNA寡核苷酸或siRNA，其抑制具有錯(cuò)配序列的基因表達(dá)或抑制RNA病毒基因組。本發(fā)明還提供核酸(包括RNA或DNA)治療劑。本發(fā)明還提供傳遞入肺組織的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供冠狀病毒病毒特別是SARS冠狀病毒的抑制劑。這些呼吸道感染(包括呼吸道病毒感染)的抑制劑可用作治療性治療，并可用作預(yù)防性治療。
通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物基因提供對(duì)疾病的治療。已經(jīng)鑒別出許多基因具有引發(fā)、保持和惡化肺部疾病的作用。例如，COPD特征為肺部組織炎癥和退化，已鑒別出許多基因具有COPD的這些破壞性作用，包括眾多的細(xì)胞因子和眾多的蛋白酶。同樣，哮喘特征為氣道有害縮窄，已鑒別出許多基因具有該作用，包括離子通道。因此，本發(fā)明提供對(duì)引發(fā)這些作用、維持這些作用和惡化這些作用的哺乳動(dòng)物基因的抑制。本發(fā)明提供的抑制劑提供對(duì)肺部疾病的治療性治療。
本發(fā)明提供由感染物天然或工程改變而產(chǎn)生的呼吸道感染的抑制劑。這種感染物中的天然或工程改變產(chǎn)生新的感染物，引起新的呼吸道感染。這些新的感染需要新的治療。本發(fā)明僅通過(guò)獲得新感染物的基因組，并鑒定siRNA靶向的獨(dú)特序列，就提供了抑制這種新感染物的治療方法。
SARS在亞洲、歐洲和北美的許多實(shí)驗(yàn)室中，科學(xué)家晝夜不停地研究SARS病因。已經(jīng)由SARS患者中分離出一種先前不認(rèn)識(shí)的冠狀病毒，已對(duì)其測(cè)序并在猴子模型中進(jìn)行了測(cè)試[2-4]。這種新冠狀病毒是引起SARS的第一候選，WHO將其命名為SARS冠狀病毒。但是，其它的感染物作為SARS的潛在病因仍在研究中。目前有美國(guó)、加拿大、香港、荷蘭等地的小組報(bào)道的多個(gè)SARS-CoV基因組序列[5]。序列信息為設(shè)計(jì)用于RT-PCR或ELISA的診斷劑提供了關(guān)鍵的知識(shí)基礎(chǔ)。更重要地是，基于這些序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了siRNA雙鏈體，以抑制幾種重要的病毒蛋白，理論上它們?nèi)磕軌蚱茐恼湶《净蚪M，因此抑制SARS-CoV的復(fù)制過(guò)程。產(chǎn)生這種siRNA雙鏈體的成功使得可以開(kāi)發(fā)出傳遞入患者氣道的基于siRNA的療法，同時(shí)用于預(yù)防和治療SARS。SARS-CoV是有義單鏈RNA，可在人中引發(fā)一種流行性最強(qiáng)的感染。SARS-CoV的毒力源自i)其易于通過(guò)懸浮顆粒和其它的人-人接觸傳播，ii)其能夠通過(guò)經(jīng)常改變病毒抗原(幾乎所有RNA病毒的特征)而逃避保護(hù)性免疫，和iii)病毒的新毒株急速涌現(xiàn)?？赡艽嬖诘腟ARS-CoV新毒株的威脅是很嚴(yán)重的，因?yàn)楸M管作了很大的努力，但還沒(méi)有獲得預(yù)防和治療SARS-CoV感染的有效療法或疫苗，關(guān)于該疾病的流行病學(xué)、病原學(xué)的詳情還有很多不清楚。
RNA干擾(RNAi)抑制SARS-CoV感染和復(fù)制RNAi是一種作用，通過(guò)該作用，雙鏈RNA引導(dǎo)動(dòng)物和植物細(xì)胞中的mRNA序列特異性降解[6-8]。已經(jīng)證明，一種RNAi小干擾RNA(siRNA，21nt長(zhǎng))雙鏈體有效阻斷病毒的體外和體內(nèi)感染和復(fù)制[9-12]。該方法對(duì)RNA病毒組、HIV、HCV和流感病毒等特別有用，對(duì)各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)和動(dòng)物模型系統(tǒng)中的病毒感染產(chǎn)生顯著抑制[13-23]。
RNAi對(duì)干擾SARS CoV感染似乎很理想。首先，SARS CoV是單鏈RNA病毒，在其生命周期中沒(méi)有任何DNA中間體。除了mRNA之外，vRNA和cRNA是siRNA-介導(dǎo)降解的潛在標(biāo)靶。其次，SARS CoV基因組RNA編碼多個(gè)蛋白。每種蛋白或者是病毒結(jié)構(gòu)的組成部分，或者在病毒生命周期中起關(guān)鍵作用。干擾任一蛋白的產(chǎn)生似乎對(duì)病毒復(fù)制和生產(chǎn)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，病毒存在多個(gè)siRNA靶，針對(duì)不同病毒靶的siRNA組合可同時(shí)使用。同時(shí)使用兩個(gè)或更多個(gè)siRNA可能是防止抗性病毒出現(xiàn)所必須的，類似于HIV治療中“雞尾酒”藥物的用法。第三，SARS CoV在人中感染上呼吸道和肺的上皮細(xì)胞。因此，siRNA可經(jīng)鼻內(nèi)或肺部途徑便利地給予，這又可產(chǎn)生比全身注射所獲得的siRNA濃度高得多的局部siRNA濃度?？紤]到在自然感染之初病毒體的數(shù)量可能較少，故上氣道和肺的上皮細(xì)胞可吸收足量的siRNA，以抑制病毒復(fù)制或產(chǎn)生，因此潛在地可達(dá)到預(yù)防或治療效果。
本文描述了多個(gè)在人中靶向SARS CoV感染和復(fù)制所必須的關(guān)鍵蛋白編碼序列的siRNA雙鏈體。由于SARS CoV的單鏈RNA基因組結(jié)構(gòu)，所以SARS CoV可直接被siRNA介導(dǎo)的RNA降解致死。為使用這些siRNA雙鏈體在人中預(yù)防和治療SARS CoV感染，必須將siRNA傳遞入通常出現(xiàn)病毒感染的上氣道和肺上皮細(xì)胞中。
基于siRNA的治療抗SARS CoV效力的臨床前研究的成功取決于1.siRNA雙鏈體的抗病毒活性；2.siRNA雙鏈體進(jìn)入動(dòng)物氣道的傳遞效率和3.臨床相關(guān)動(dòng)物模型的可耐受毒性。
設(shè)計(jì)在培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物模型中有效抑制SARS冠狀病毒產(chǎn)生的siRNA雙鏈體。為應(yīng)用這些RNAi雙鏈體在人中預(yù)防和治療SARS CoV感染，必須將siRNA傳遞入通常出現(xiàn)病毒感染的上氣道和肺上皮細(xì)胞中。
體外鑒別有效的siRNA分子方法和材料SARS冠狀病毒毒株選擇使用先前描述的方法[1]，通過(guò)用2003年3月在香港感染SARS的患者的鼻咽抽取液(NPA)感染恒河猴胎腎(FRhK-4)細(xì)胞，分離SARSCoV毒株HKU-66078分離株(AY304494)。HKU-66078毒株在FRhK-4細(xì)胞中的連續(xù)傳代物始終產(chǎn)生致細(xì)胞病變作用(CPE)，滴度為107TCID50/ml。局部長(zhǎng)度測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析顯示該毒株與報(bào)道的毒株TOR2(AY274119)、FRA(AY291315和AY310120)以及CUHK-WI(AY278554)非常相似。選擇該毒株的原因是其高感染性和毒力特性，產(chǎn)生CPE比其他毒株快(數(shù)據(jù)未公開(kāi))。
細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和病毒感染用96孔板在含10％FCS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)FRhK-4細(xì)胞。為進(jìn)行病毒感染，用PBS清洗細(xì)胞兩次，以3PFU/細(xì)胞接種病毒，在無(wú)FCS的MEM中溫育1小時(shí)。然后用MEM清洗細(xì)胞兩次，在含10％FCS的MEM培養(yǎng)基中于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。感染后約20小時(shí)出現(xiàn)CPE，并再在28小時(shí)內(nèi)快速擴(kuò)散至整個(gè)細(xì)胞單層。為進(jìn)行預(yù)防研究，在96孔板中用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染90-95％匯合的FRhK-4細(xì)胞，其中siRNA雙鏈體按照生產(chǎn)商的方法以0.3μg/孔與0.5μl Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)混合。轉(zhuǎn)染后8小時(shí)，用SARS CoV以3PFU/細(xì)胞感染細(xì)胞。為進(jìn)行治療研究，在96孔板中用SARS CoV以3PFU/細(xì)胞感染80％匯合的FRhK-4細(xì)胞。在感染后1小時(shí)，用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中siRNA雙鏈體按照生產(chǎn)商的方法以0.3μg/孔與0.5μlLipofectamine 2000混合。轉(zhuǎn)染后4小時(shí)，清洗細(xì)胞，并在含10％FCS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
siRNA的設(shè)計(jì)與合成使用基于TOR2(AY274119)、CUHK-WI(AY278554)和HKU-66078(AY304494)的SARS CoV基因組序列作為模板，設(shè)計(jì)siRNA靶序列。所有的siRNA雙鏈體都是21個(gè)核苷酸(nt)的雙鏈RNA，在兩個(gè)3′端都含有dTdT突出端，符合Elbashir et al.提出的規(guī)則[25]。對(duì)照GenBank對(duì)靶序列進(jìn)行BLAST檢索，以確保其僅是SARS-CoV基因組獨(dú)有的。還設(shè)計(jì)了另外的40個(gè)siRNA雙鏈體(圖9)，并通過(guò)Qiagen(Germantown，MD)合成。
電鏡檢查收獲有或沒(méi)有SARS-CoV感染的FRhK-4細(xì)胞，并在2.5％戊二醛(Electron Microscopy Sciences，Washington，USA)中固定4小時(shí)，在1％四氧化鋨中后固定1小時(shí)。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml試管中，以1,000rpm離心10分鐘。一去除上清液，就向細(xì)胞沉淀中加入55-60℃的液化2％瓊脂(Sigma，St.Louis，USA)溶液。凝膠固化后，制備含細(xì)胞沉淀的約1mm3立方體，并在分級(jí)乙醇中脫水。將立方體包埋在環(huán)氧樹(shù)脂(Polysciences，Warrington，USA)中。制備70nm厚度的超薄切片，用乙酸雙氧鈾(Electron Microscopy Sciences，Washington，USA)和檸檬酸鉛(Leica Microsystem，Vienna，Austria)染色。在PhilipsEM208S電鏡下以80kV檢測(cè)切片。影像以200nm長(zhǎng)度標(biāo)記。
病毒滴定和實(shí)時(shí)定量RT-PCR使用基于CPE的TCID50實(shí)驗(yàn)，通過(guò)滴定培養(yǎng)物上清液中的病毒量測(cè)定培養(yǎng)基中的釋放病毒。用MEM以10倍連續(xù)稀釋培養(yǎng)物上清液，并接種96孔板中的FRhK-4細(xì)胞。培養(yǎng)3天后評(píng)價(jià)結(jié)果。使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(Q-RT-PCR)定量毒基因組RNA的胞內(nèi)拷貝數(shù)。用PBS清洗細(xì)胞兩次，使用QIAamp RNA分離試劑盒(RocheMolecular Biochemicals)提取細(xì)胞中的總RNA。使用RNA H+逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和隨機(jī)引物合成第一鏈的cDNA。使用2μl各反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR。將正向引物(5′-GCATGAAATTGCCTGGTTCAC-3′，終濃度900nM)、反向引物(5′-GCATTCCCCTTTGAAAGTGTC-3′，終濃度900nM)和熒光探針(FAMAGCTACGAGCACCAGACACCCTTCGAAA-TRMA，終濃度250nM)與Master Mix混合，并使用ABl7900 Sequence DetectionSystem(ABI，F(xiàn)oster City，CA，USA)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。PCR運(yùn)行條件是50℃，5分鐘；95℃，10分鐘以及40個(gè)循環(huán)的95℃，15秒和61℃，1分鐘。所有的檢測(cè)都進(jìn)行3次，以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果選擇最有效的siRNA雙鏈體盡管siRNA雙鏈體一般來(lái)說(shuō)能夠抑制互補(bǔ)RNA序列，但已知靶向同一基因不同區(qū)域的siRNA的沉默效果有顯著不同。盡管控制有效siRNA導(dǎo)向基因沉默的規(guī)則仍不明確，但siRNA序列的堿基組成可能不是決定抑制靶基因效力的唯一因素。本研究采取的策略是集中在SARS CoV感染和復(fù)制的某些關(guān)鍵蛋白的編碼區(qū)域，同時(shí)覆蓋整個(gè)病毒基因組RNA中的區(qū)域，以確保可鑒別出有效抑制SARSCoV的siRNA雙鏈體。選擇各21nt的48個(gè)序列作為標(biāo)靶，用于siRNA介導(dǎo)的SARS CoV感染和復(fù)制的抑制。根據(jù)最近描述的SARS CoV基因組結(jié)構(gòu)[27-29]，在圖8顯示了各個(gè)siRNA靶向的序列在基因組RNA中的位置，各個(gè)siRNA靶向序列的詳細(xì)信息列于圖9。
序列分析揭示了SARS CoV基因組的29,740個(gè)堿基(FRA分離株，AY310120)的結(jié)構(gòu)[27-29]。核苷酸1-72含有預(yù)測(cè)的RNA前導(dǎo)序列，之后是跨越192個(gè)核苷酸的非翻譯區(qū)(UTR)[26]。SARS CoV基因組表達(dá)始于兩個(gè)大復(fù)制酶可讀框ORF1a和ORF1b的翻譯，這兩個(gè)可讀框都編碼多蛋白，這些多蛋白被加工成一組很少鑒定的復(fù)制酶。推測(cè)這些復(fù)制酶亞單位形成病毒復(fù)制復(fù)合物，負(fù)責(zé)在宿主細(xì)胞中合成和復(fù)制病毒RNA[29]。在它們之中，由nsp-3區(qū)編碼的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PLpro)對(duì)病毒蛋白的成熟很重要，而由nsp-12區(qū)編碼的RNA依賴性RNA聚合酶在催化病毒RNA合成中起關(guān)鍵作用。由ORF2編碼的刺突蛋白位于病毒體表面，負(fù)責(zé)趨向、受體識(shí)別、細(xì)胞粘附以及誘導(dǎo)中和抗體。最初，對(duì)病毒序列功能作用的理解引致合理設(shè)計(jì)出8個(gè)靶向前導(dǎo)序列、nsp-3、nsp-12和刺突蛋白編碼區(qū)的siRNA雙鏈體(SC1-SC8)。將siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染入之前剛用SARSCoV感染的FRhk-4細(xì)胞。感染后36小時(shí)，評(píng)價(jià)處理細(xì)胞的致細(xì)胞病變作用(CPE)，以此代表siRNA介導(dǎo)的對(duì)病毒感染的保護(hù)作用。一個(gè)nsp-12特異性siRNA SC5和一個(gè)刺突蛋白特異性siRNA SC2顯示顯著降低CPE(＞80％)，而其它6個(gè)雙鏈體僅顯示出中等(50％-70％)或最小的CPE下降(＜30％)。
此初始成功促使使用相同的基于CPE的方法，在基因組范圍內(nèi)篩選靶向整個(gè)SARS-CoV基因組RNA中不同區(qū)域的另外40個(gè)siRNA(圖8)。令人驚奇的是，僅有兩個(gè)另外的siRNA雙鏈體，即靶向nsp-13區(qū)的SC14和靶向nsp-16區(qū)的SC15，顯示出類似于用SC2和SC5觀測(cè)到的降低CPE的效力。在SARS-CoV感染前用SC14 siRNA轉(zhuǎn)染的FRhK-4細(xì)胞表現(xiàn)出極深的對(duì)CPE的預(yù)防性保護(hù)作用(
圖10)。已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)細(xì)胞在HIV病毒感染前用siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，合成的siRNA雙鏈體能夠降解病毒基因組RNA[30]。因?yàn)閟iRNA在胞質(zhì)中有效，所以在感染過(guò)程中進(jìn)入細(xì)胞的基因組病毒RNA不得不遭遇此初始防御機(jī)制。
siRNA靶向引入的基因組病毒RNA的能力暗示siRNA在SARS-CoV感染治療中具有治療性用途。電鏡圖進(jìn)一步說(shuō)明了保護(hù)FRhK-4細(xì)胞抗SARS-CoV感染的作用(
圖11)。不過(guò)，在48個(gè)siRNA雙鏈體中僅有4個(gè)顯示出顯著降低SARS-CoV感染導(dǎo)致的CPE。這4個(gè)siRNA雙鏈體的GC含量在38％-48％的范圍內(nèi)。似乎siRNA靶向序列在病毒基因組中的位置直接影響對(duì)病毒RNA破壞的效力。更令人感興趣的是，這4個(gè)最有效的抑制劑SC2、SC5、SC14和SC15全部都靶向病毒基因組序列的中段(nt 13500-21600)。它們中的3個(gè)直接靶向ORF1b區(qū)，這一事實(shí)強(qiáng)有力地支持了此編碼區(qū)對(duì)病毒基因組穩(wěn)定性可能起關(guān)鍵作用的觀點(diǎn)。而且，在7個(gè)靶向ORF1b區(qū)的siRNA雙鏈體中只有3個(gè)具有強(qiáng)抑制作用，這表明在編碼區(qū)中存在序列偏好。
在這3個(gè)待認(rèn)識(shí)的雙鏈體中，RNAi易感性更好的序列模式和基序特征還不明了。在本研究中觀察到的病毒基因組水平上的位置作用確切機(jī)制需要進(jìn)一步研究來(lái)徹底理解。7個(gè)靶向刺突蛋白的siRNA雙鏈體中的一個(gè)SC2 siRNA能夠顯著降低SARS-CoV誘發(fā)的CPE。這進(jìn)一步證實(shí)了各個(gè)ORF中siRNA靶向序列的位置作用可顯著不同[25]。
選定siRNA雙鏈體的預(yù)防效力HIV-1研究[13-14]和呼吸道合胞體病毒(RSV)研究[30]表明，病毒基因組RNA和mRNA都對(duì)預(yù)先存在于宿主細(xì)胞中的siRNA敏感。為研究靶向SARS CoV的選定活性siRNA的預(yù)防效力，在病毒感染前用siRNA雙鏈體轉(zhuǎn)染FRhK-4細(xì)胞。通過(guò)使用Q-RT-PCR檢測(cè)胞質(zhì)病毒基因組拷貝數(shù)，并滴定培養(yǎng)基中的病毒量(TCID50)，評(píng)價(jià)抗病毒效力。
圖12顯示了在病毒感染前8小時(shí)將siRNA雙鏈體SC2、SC5、SC14和SC15轉(zhuǎn)染入FRhK-4細(xì)胞時(shí)SARS-CoV基因組拷貝數(shù)的下降。感染后72小時(shí)收集樣品，使用Q-RT-PCR檢測(cè)相對(duì)病毒基因組拷貝數(shù)。
圖13顯示了siRNA雙鏈體對(duì)培養(yǎng)基中的SARS CoV量的抑制作用。兩個(gè)檢測(cè)都證明SC5、SC14和SC15 siRNA雙鏈體能夠大量抑制病毒復(fù)制，而SC14表現(xiàn)出最強(qiáng)的效力。所觀測(cè)的預(yù)防性抑制作用提供了直接的證據(jù)，表明宿主細(xì)胞中預(yù)先存在的siRNA能夠預(yù)防SARS CoV感染，并抑制病毒復(fù)制。
一個(gè)要研究的問(wèn)題是該siRNA介導(dǎo)的預(yù)防性作用在抗SARS CoVsiRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染后可維持多久。為解決此問(wèn)題，進(jìn)行時(shí)程研究，以明確siRNA介導(dǎo)的預(yù)防活性的持續(xù)時(shí)間。在相同劑量的SC5 siRNA轉(zhuǎn)染后4、8、16、24、48、60和72小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，用相同劑量的SARSCoV感染FRhK-4細(xì)胞。siRNA介導(dǎo)的抗SARS CoV預(yù)防性作用維持達(dá)72小時(shí)，是研究中的最長(zhǎng)時(shí)間周期(
圖14)，盡管已經(jīng)報(bào)道了相對(duì)穩(wěn)定和持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的siRNA介導(dǎo)的沉默作用[25，31]。在此時(shí)程中，預(yù)處理組的病毒基因組拷貝數(shù)在所有時(shí)間點(diǎn)都保持在低水平，相比之下，在沒(méi)有siRNA的情況下，在感染后8小時(shí)病毒基因組拷貝數(shù)快速增加。該結(jié)果表明，至少在72小時(shí)內(nèi)，siRNA雙鏈體在FRhK-4細(xì)胞中保持穩(wěn)定和活性。這種延長(zhǎng)的預(yù)防性作用提示，siRNA用作抗SARS CoV感染的預(yù)防手段的潛在用途，例如在衛(wèi)生保健專業(yè)人員接觸SARS患者前給予其siRNA，因?yàn)轭A(yù)防性的siRNA能夠在數(shù)小時(shí)內(nèi)迅速起作用并維持?jǐn)?shù)天。預(yù)防性的抗病毒作用還可以激發(fā)起有價(jià)值的研究即研究預(yù)先存在的siRNA物質(zhì)可預(yù)防病毒感染宿主細(xì)胞的機(jī)制。
選定的siRNA雙鏈體的治療效力在病毒復(fù)制早期，RNAi方法僅處理基因組RNA。但是，在病毒進(jìn)入細(xì)胞后，復(fù)制激活，在感染細(xì)胞中新生出成千上萬(wàn)的病毒轉(zhuǎn)錄物，病毒基因組RNA和mRNA的降解對(duì)RNAi機(jī)制來(lái)說(shuō)成為了更艱巨的任務(wù)。為評(píng)價(jià)選定的siRNA雙鏈體的治療作用，在SARS CoV感染后1小時(shí)，使用在預(yù)防性研究中使用的相同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染FRhK-4細(xì)胞。
24小時(shí)后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，通過(guò)Q-RT-PCR檢測(cè)胞質(zhì)病毒基因組拷貝，通過(guò)TCID50檢測(cè)病毒滴度。相對(duì)病毒基因組拷貝數(shù)(
圖15)表明，僅有一個(gè)siRNA雙鏈體SC15能夠?qū)崿F(xiàn)顯著下降。另一方面，SC5和SC14能夠使病毒滴度明顯降低(
圖16)。顯然，對(duì)已經(jīng)感染SARS CoV的細(xì)胞siRNA介導(dǎo)的治療效力遠(yuǎn)弱于預(yù)防效力。
這些數(shù)據(jù)暗示，siRNA作為治療劑的效力弱可能是源于降解預(yù)先存在的病毒基因組RNA和sg mRNA的任務(wù)，以及由病毒感染引起的對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染的潛在阻礙。為提升靶向SARS CoV的siRNA雙鏈體的治療效力，合理的方案是增加轉(zhuǎn)染的siRNA的劑量或組合多個(gè)靶向病毒基因組RNA多個(gè)區(qū)域的siRNA雙鏈體。在以下的實(shí)驗(yàn)中，增強(qiáng)靶向SARS CoV的siRNA的治療效力以及預(yù)防效力的努力很大程度上集中于這兩種方法。
多個(gè)siRNA雙鏈體的組合效力盡管有多個(gè)關(guān)于靶向單個(gè)基因或單個(gè)序列區(qū)域的siRNA介導(dǎo)的抗病毒活性的報(bào)道，但有限證據(jù)表明多個(gè)靶向不同基因或區(qū)域的siRNA組合的用途。在增強(qiáng)抗SARS-CoV治療效力的嘗試中，評(píng)價(jià)組合多個(gè)靶向不同病毒基因的siRNA雙鏈體的策略。在4個(gè)選定的活性siRNA雙鏈體中選擇siRNA組合。用于轉(zhuǎn)染的劑量相同，與siRNA種類的數(shù)目和組成無(wú)關(guān)。
為驗(yàn)證組合多個(gè)活性siRNA雙鏈體將提升治療效力的假說(shuō)，將7種相同劑量的活性siRNA組合轉(zhuǎn)染入已感染SARS-CoV的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，收集樣品，檢測(cè)病毒基因組拷貝數(shù)和病毒滴度。所有組合都顯示治療作用的效力大幅提升根據(jù)病毒基因組拷貝數(shù)的檢測(cè)(
圖17)，抑制病毒復(fù)制達(dá)80％，但是，將SC5的劑量增加至2-4倍沒(méi)有提升對(duì)SARS-CoV的抑制效力。
這些數(shù)據(jù)清楚表明，靶向病毒基因組RNA不同區(qū)域的多個(gè)siRNA雙鏈體的組合顯著增強(qiáng)抗SARS的治療效力，而增加活性siRNA雙鏈體的劑量可沒(méi)有任何顯著的影響，另外，該結(jié)果還提示SARS-CoV感染不影響siRNA轉(zhuǎn)染和功能。在預(yù)防效力的研究過(guò)程中，如所述方法所描述的一樣，在SARS-CoV感染后轉(zhuǎn)染各種組合的活性siRNA雙鏈體。24小時(shí)后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基進(jìn)行Q-RT-PCR和TCID50。和對(duì)照樣品相比，當(dāng)細(xì)胞用各種組合的活性siRNA雙鏈體預(yù)處理時(shí)，觀測(cè)到病毒基因組拷貝數(shù)顯著下降(
圖18)。令人感興趣的是，增加研究中使用的SC2的劑量(3×SC3)對(duì)預(yù)防效力沒(méi)有顯著提升。在使用組合的siRNA雙鏈體SC2和SC5時(shí)，還觀測(cè)到預(yù)防效力延長(zhǎng)至72小時(shí)(
圖19)。
在該研究中觀測(cè)到的siRNA介導(dǎo)對(duì)SARS-CoV復(fù)制的抑制可能是源于siRNA能夠破壞病毒基因組RNA、失活病毒復(fù)制機(jī)制和降低感染毒性。盡管已廣泛認(rèn)可了可讀框中siRNA的位置作用[13，16]，但還沒(méi)有完全認(rèn)識(shí)到siRNA對(duì)病毒基因組RNA的位置作用。研究結(jié)果表明，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中siRNA介導(dǎo)的抗SARS-CoV活性既是基因組位置依賴性的，也是基因序列依賴性的。例如，三個(gè)最有效的siRNA雙鏈體靶向病毒基因組的中間區(qū)域，而SC2和SC5siRNA靶向可讀框的前50-200nt。刺突蛋白特異性siRNA SC2同時(shí)降低了病毒滴度和病毒基因組拷貝數(shù)，盡管刺突蛋白的生物學(xué)作用主要在病毒感染方面。
似乎病毒基因組拷貝數(shù)的降低主要是SC2 siRNA的作用，而不是刺突蛋白表達(dá)受抑制。以下的事實(shí)也支持該結(jié)論在32個(gè)同時(shí)靶向病毒基因組RNA右側(cè)1/3區(qū)域和各種sg mRNA的siRNA雙鏈體中，僅有SC2產(chǎn)生顯著的抑制作用。顯然，大多數(shù)靶向sg mRNA的siRNA雙鏈體對(duì)病毒復(fù)制抑制幾乎沒(méi)有作用。因此，基因組RNA破壞可能是這些抗SARS-CoV siRNA的主要功能。
其它因素I.復(fù)制和感染所需的關(guān)鍵蛋白因?yàn)樵谀壳皩?duì)新SARS冠狀病毒基因的功能和基因組組成幾乎沒(méi)有了解，所以使用先前已明確的病毒登革熱病毒(DEN)的基因組結(jié)構(gòu)信息鑒別新鑒定的冠狀病毒基因組序列的關(guān)鍵蛋白的可讀框。
選擇DEN病毒是因?yàn)镈EN病毒類似于冠狀病毒，因?yàn)樗鼈兌际钦龁捂淩NA病毒，已經(jīng)報(bào)道了DEN病毒復(fù)制受到靶向DEN病毒prM基因的siRNA的抑制。根據(jù)先前已知的關(guān)于DEN病毒基因組結(jié)構(gòu)和公開(kāi)的SARS冠狀病毒基因組序列的信息，鑒別出3個(gè)推定的關(guān)鍵蛋白可讀框作為siRNA介導(dǎo)抑制的標(biāo)靶nsp1，用于蛋白成熟的加工酶；nsp9，RNA依賴性RNA聚合酶，對(duì)RNA基因組復(fù)制和亞基因組mRNA的生產(chǎn)很重要；以及S蛋白(刺突蛋白)，用于受體結(jié)合、細(xì)胞融合、誘導(dǎo)中和抗體和細(xì)胞免疫的表面糖蛋白。
II.設(shè)計(jì)siRNA雙鏈體使用模板病毒基因組序列SARS-CUHM-WI(AY278554，GI30023518)選擇靶向?qū)?yīng)基因(可讀框)的特異性siRNA雙鏈體。靶基因如下所列靶向的基因nsp1編碼蛋白酶，nsp9編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，SARS-CUHM-WI和SARS-Tor2的序列相同。
S編碼刺突蛋白，該刺突蛋白結(jié)合細(xì)胞受體、誘導(dǎo)融合、誘導(dǎo)中和抗體和T細(xì)胞免疫。其有3bp與SARS-To2不同源，這在設(shè)計(jì)siRNA雙鏈體時(shí)加以避免。
基于Tuschl指導(dǎo)為每種靶基因設(shè)計(jì)兩個(gè)siRNA雙鏈體。這些siRNA寡聚物的序列和位置列于下表。圖2還顯示了帶有靶向序列位置的SARS冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)圖。
表.siRNA靶向的冠狀病毒序列所有的靶序列都進(jìn)行BLAST檢索，以檢出可能存在的非相關(guān)序列的干擾。示于以下的序列都是僅與公開(kāi)的SARS冠狀病毒序列(包括SARS-Urbani和SARS-Tor2毒株)同源的獨(dú)有序列。
選定的靶在病毒基因組中的位置選擇兩個(gè)siRNA雙鏈體，以靶向每個(gè)推定的可讀框。
其它的SARS冠狀病毒序列保持出現(xiàn)在公開(kāi)結(jié)構(gòu)域中。選定的靶序列與這些毒株中的大多數(shù)在對(duì)應(yīng)區(qū)域100％同源，只有HKU39849例外(圖3)。
除了以上實(shí)施例之外，有效根除冠狀病毒感染和復(fù)制的特異性RNAi物質(zhì)還可以靶向SARS冠狀病毒中的其它可讀框和非編碼區(qū)。
III.RS-PCR檢測(cè)SARS冠狀病毒設(shè)計(jì)一種獨(dú)特的RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SARS冠狀病毒RNA，該RT-PCR實(shí)驗(yàn)叫做RNA模板特異性PCR(RS-PCR)。
a.基于RS-PCR的SARS診斷實(shí)驗(yàn)使用引物檢測(cè)SARS冠狀病毒序列。簡(jiǎn)而言之，該實(shí)驗(yàn)使用SARS冠狀病毒基因特異性引物(SRT引物)，其含有與SARS冠狀病毒序列互補(bǔ)的17nt序列以及附著于其5′的30nt特殊序列，用于由SARS冠狀病毒基因的RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)合成cDNA的第一鏈。然后使用一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物(Forw-引物)識(shí)別SARS冠狀病毒基因組中SRT引物識(shí)別的17nt區(qū)域上游的序列。反向引物(Rev-引物)識(shí)別附著于SRT引物的特殊序列。在高退火溫度(72℃)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在該溫度只有RT的cDNA可以擴(kuò)增，但不能擴(kuò)增任何潛在的DNA污染物。RS-PCR實(shí)驗(yàn)可容易地放大至大規(guī)模的診斷和預(yù)后應(yīng)用。
b.RS-PCR引物設(shè)計(jì)引物1正向-nsp1Up(30聚體，推定的nsp1基因編碼序列的41-70nt，或冠狀病毒序列AY278554的2734-2763nt)，5′---GGG AAG TTCAAG GTT ACA AGA ATG TGA GAA---3′引物2SRT-nsp1Dn(47聚體，在3′的17聚體與推定的nsp1基因編碼序列的1041-1025nt或冠狀病毒序列AY278554的3734-3718nt互補(bǔ))。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gacaac ctg ctc ata aa---3′引物3正向-nsp9Up(30聚體，推定的nsp9基因編碼序列的35-64nt，或冠狀病毒序列AY278554的13381-13410nt)。5′---CGG TGT AAGTGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG---3′引物4SRT-nsp9Dn(47聚體，在3′的17聚體與推定的nsp9基因編碼序列的734-718nt或冠狀病毒序列AY278554的14080-14064nt互補(bǔ))。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gaggat ggg cat cag ca---3′引物5正向-SpikeUp(30聚體，推定的刺突蛋白基因編碼序列的45-74nt，或冠狀病毒序列AY278554的21511-21540nt)。5′---CCTTGA CCG GTG CAC CAC TTT TGA TGA TGT---3′引物6SRT-SpikeDn(47聚體，在3′的17聚體與推定的刺突蛋白基因編碼序列的644-628nt或冠狀病毒序列AY278554的22110-22094nt互補(bǔ))。5′---GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCGATA gtg tta aaa cca gaa gg---3′引物7(反向-引物)5′-AACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA-3′c.RS-PCR。
以下的方法用于RS-PCR，以檢測(cè)生物樣品中的SARS冠狀病毒，所述生物樣品例如為細(xì)胞裂解物、動(dòng)物組織和人類患者組織。還可以使用其它的組織。
1).使用RNAwizTM試劑(Ambion)由人樣品中分離總RNA。MuLv逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑得自Applied Biosystems，RS-PCR中使用得所有其它試劑都得自PE Biosystems。
2).SRT反應(yīng)將1μg總RNA樣品與2μl 10×PCRII緩沖液、4μl 25mM MgSO4、0.5μl 10mM dNTP、1μl RNA酶抑制劑(20U/μl)、1μl 20μm SRT引物、1μl MuLv逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/μl)和無(wú)RNA酶水混合至總體積為20μl。樣品于37℃溫育30分鐘，接著于42℃溫育15分鐘，然后于94℃加熱5分鐘。
3).PCR將10μl SRT產(chǎn)物與4μl 10×PCRII緩沖液、3μl 25mMMgSO4、1μl 10mM dNTP、1μl 20μM正向引物、1μl 20μM反向引物、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)和蒸餾水混合至總體積為50μl。樣品于94℃加熱2分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)周期的2步PCR94℃退火1分鐘以及72℃延長(zhǎng)2分鐘。在PCR結(jié)束時(shí)于72℃再溫育10分鐘，接著于4℃溫育，之后通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠上對(duì)10μl RS-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析PCR產(chǎn)物。
表.RS-PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度
IV.肺部siRNA傳遞有多個(gè)途徑可將核酸有效傳遞入哺乳動(dòng)物氣道(圖4)。我們開(kāi)發(fā)了口-氣管傳遞siRNA雙鏈體和其它有效基因表達(dá)操作的核酸(圖5)。與此類傳遞相關(guān)的獨(dú)特制劑包括表面活性劑、脂質(zhì)體和肽聚合物。也可應(yīng)用鼻傳遞和其它類型的氣道傳遞方法，以實(shí)現(xiàn)最有效的核酸傳遞。當(dāng)將熒光標(biāo)記的siRNA雙鏈體給予上氣道(通過(guò)鼻傳遞)和下氣道(通過(guò)口-氣管傳遞)時(shí)，氣管和肺都被點(diǎn)亮，甚至在透徹清洗后也是如此(圖6和圖7)。
體內(nèi)驗(yàn)證活性siRNA分子根據(jù)在2003年進(jìn)行的48個(gè)SARS特異性siRNA的體外研究[32]可得到以下結(jié)果1)選擇的幾個(gè)有效的siRNA在感染細(xì)胞中抑制SARS-CoV復(fù)制達(dá)90％。2)這些有效的siRNA當(dāng)在病毒感染前48-72小時(shí)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞時(shí)，抑制SARS-CoV病毒復(fù)制達(dá)90％，提示siRNA具有預(yù)防效力。3)同時(shí)傳遞幾種靶向病毒基因組不同位置的siRNA表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用。證明所選擇的siRNA的用藥程式安全性及其抗SARS-CoV效力的關(guān)鍵性步驟是在已建立的SARS動(dòng)物模型中進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
在將siRNA介導(dǎo)的SARS-CoV抑制研究直接轉(zhuǎn)移到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物之前，我們首先通過(guò)融合含SC2和SC5靶序列的SARS-CoV序列片段和熒光素酶cDNA，構(gòu)建替代質(zhì)粒pCI-Luc-SC(圖20)。當(dāng)我們將pCI-Luc-SC連同SC2和SC5 siRNA共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞時(shí)，與對(duì)照siRNA雙鏈體相比，pCI-Luc-SC的熒光素酶表達(dá)受到顯著抑制(未列出數(shù)據(jù))。我們證實(shí)此替代方案在體外運(yùn)行良好之后，接著我們通過(guò)氣管內(nèi)給予將質(zhì)粒和SC2-SC5 siRNA雙鏈體共傳遞入小鼠肺中。當(dāng)收集肺組織并將檢測(cè)的熒光素酶活性與對(duì)照siRNA比較時(shí)，熒光素酶表達(dá)受到顯著抑制(圖21)。此結(jié)果為以下事實(shí)提供了強(qiáng)有力的支持siRNA在動(dòng)物氣道中有活性，能夠抑制靶基因表達(dá)。
盡管正在探索某些替代的動(dòng)物模型，但非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型仍是廣為接受的標(biāo)準(zhǔn)，原因僅僅是其與人在遺傳學(xué)和生理學(xué)方面類似。SARS的病程由三個(gè)階段組成病毒復(fù)制、免疫功能亢進(jìn)和肺部破壞；siRNA用藥程式控制SARS疾病發(fā)展的最佳階段是第一個(gè)階段。因此，在所提出的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了siRNA用藥程式在實(shí)驗(yàn)性SARS疾病早期的效力。為避免由大量接觸siRNA而可能引起的無(wú)法耐受的毒性，在使用多劑量時(shí)，我們?cè)诟腥竞?天內(nèi)施用siRNA(p.i.)。該研究的主要目標(biāo)是測(cè)試siRNA抗SARS的效力，并研究測(cè)試劑量的siRNA試劑在猴子模型中的毒性模式。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及隨后的測(cè)定在Institute of Laboratory Animal Science，CAMS(ILAS)的設(shè)備上進(jìn)行。所有的實(shí)驗(yàn)方案都滿足中國(guó)衛(wèi)生部制定的相關(guān)法規(guī)。
測(cè)試系統(tǒng)動(dòng)物、病毒株和動(dòng)物分組恒河猴SARS模型體系由ILAS建立。該模型顯示猴子感染分離自中國(guó)SARS患者的SARS-CoV毒株。感染的猴子出現(xiàn)SARS樣癥狀、病理學(xué)和血液學(xué)模式。我們使用和ILAS相同的SARS-CoV毒株攻擊猴子，并將siRNA傳遞入呼吸道。在首個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用5組動(dòng)物(共20只猴子)(表1)。分組原則是組1(G1)指定用于觀察預(yù)防效力，G2和G3用于觀察治療效力，不同之處在于首劑siRNA是否與病毒感染同時(shí)施用。G4周作治療性siRNA的對(duì)照，使用不相關(guān)的siRNA；而G5是未治療組，用病毒攻擊健康動(dòng)物。表2概述了使用的siRNA的總量。
病毒攻擊通過(guò)不同傳遞途徑的比較研究，經(jīng)ILAS選擇的鼻吸入和噴霧給予SARS CoV。
siRNA的傳遞將siRNA與合適體積的溶解溶液(5％葡萄糖的無(wú)RNA酶水溶液)混合。盡管在siRNA有效傳遞入猴肺方面沒(méi)有可利用的文獻(xiàn)，但最近的小鼠研究表明肺特異性siRNA傳遞可通過(guò)鼻內(nèi)給予實(shí)現(xiàn)，而不需要病毒載體或轉(zhuǎn)染劑。我們通過(guò)鼻吸入和噴霧傳遞siRNA溶液，與病毒攻擊所使用的相同。
表1.治療組
表2.使用的試劑
評(píng)價(jià)siRNA的效力和毒性siRNA對(duì)SARS-CoV病毒復(fù)制、癥狀、病理學(xué)和生理學(xué)指標(biāo)的抑制作用反映出siRNA抗SARS的效力。siRNA的毒性主要由臨床體征和/或病理學(xué)顯示，基本上可由動(dòng)物對(duì)施用的siRNA劑量的耐受能力反映。
SARS-CoV病毒的復(fù)制在感染后第0(恰好在攻擊前)、4和7天，麻醉猴子，并取出鼻/咽拭樣和血樣。拭樣用于檢測(cè)病毒基因組mRNA拷貝數(shù)(通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR，Q-RT-PCR)和分離SARS-CoV(通過(guò)感染容納細(xì)胞)；血樣用于Q-RT-PCR。在處死猴子時(shí)(感染后第7天兩只，感染后第11天兩只)，收集肺和血樣進(jìn)行病毒分離。用于Q-RT-PCR的引物先前已描述。如上所述通過(guò)用拭樣或血樣感染容納細(xì)胞(例如Vero細(xì)胞)進(jìn)行病毒分離。在組織培養(yǎng)物上經(jīng)過(guò)1-3次盲傳之后可出現(xiàn)CPE。記錄CPE，通過(guò)Q-RT-PCR測(cè)試每次傳代的組織培養(yǎng)物的上清液。根據(jù)出現(xiàn)的CPE，對(duì)比同一代的某些組織培養(yǎng)物上清液樣品的病毒滴度，病毒滴度以TCID50表示。這有希望顯示出測(cè)試組和對(duì)照組之間的某些動(dòng)態(tài)差異。作為參照，Q-RT-PCR實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)89％SARS患者的89％，病毒分離可采用組織培養(yǎng)物中1輪以上的傳代物。
臨床體征和肺功能每天記錄，包括呼吸道癥狀、體溫、氣管支氣管淋巴結(jié)大小。另外，分析動(dòng)脈血，還檢測(cè)脈搏血氧。
組織學(xué)測(cè)試在感染后第7天和第11天，分別處死每組的兩只猴子。對(duì)肺組織切片進(jìn)行傳統(tǒng)的組織學(xué)和免疫組織學(xué)檢查(包括原位雜交，F(xiàn)ISH)。
常規(guī)血檢在取拭樣的同時(shí)取血樣。檢測(cè)常規(guī)血檢的主要項(xiàng)目，例如WBC、DC、RBC、GB、HCT、MCV、MCH和RDW。
肝酶活性檢查進(jìn)行常規(guī)的肝活性檢查，例如血清ALT、血清膽紅素、凝血酶原、白蛋白、LDH等。
初步結(jié)果以30mg/劑的劑量和4次重復(fù)給藥傳遞siRNA雙鏈體是安全的。治療的猴子在給藥后沒(méi)有出現(xiàn)可見(jiàn)的癥狀，所治療猴肺的損傷不是由siRNA傳遞引起，而是由SARS-CoV感染引起。向猴肺重復(fù)鼻內(nèi)給予0.5ml含siRNA藥物的溶液非常有效(圖22)。根據(jù)組I和組IV或V之間的動(dòng)物肺病理狀況對(duì)比(圖23)，觀測(cè)到siRNA雙鏈體在猴肺中的預(yù)防效力。
根據(jù)組I和組IV或V之間動(dòng)物肺病理狀況對(duì)比，向猴肺中共給予siRNA雙鏈體和SARS-CoV產(chǎn)生抗SARS-CoV活性。顯然，我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)研究中觀測(cè)到的抗SARS-CoV活性在此猴子實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)。這些結(jié)果表明基于siRNA的抗SARS-CoV療法對(duì)SARS治療有效，具有高度的特異性和安全性。
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權(quán)利要求
1.一種分離的雙鏈RNA分子，所述分子包含的第一鏈含有對(duì)應(yīng)于SARS病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，包含的第二鏈含有與所述SARS病毒所述核苷酸序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中所述雙鏈分子抑制所述SARS病毒所述核苷酸序列的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的RNA分子，其中所述第一鏈和第二鏈?zhǔn)菃为?dú)的互補(bǔ)鏈。
3.權(quán)利要求1的RNA分子，其中所述第一鏈和第二鏈包含在單個(gè)分子中，其中所述單個(gè)分子包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
4.任一前述權(quán)利要求的RNA分子，其中所述SARS病毒的核苷酸序列選自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
5.權(quán)利要求4的RNA分子，其中所述第一鏈包含選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
6.一種檢測(cè)樣品中SARS病毒的方法，所述方法包括(a)使得自所述樣品的RNA接觸基因特異性引物，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈的cDNA分子，其中所述基因特異性引物包含的3′區(qū)與SARS序列互補(bǔ)，其包含的5′序列與SARS序列不互補(bǔ)；接著(b)使用一對(duì)引物以PCR擴(kuò)增所述第一鏈的cDNA，其中第一個(gè)引物與所述基因特異性引物的所述5′區(qū)互補(bǔ)，其中第二個(gè)引物含有SARS基因組中所述基因特異性引物所述3′區(qū)識(shí)別區(qū)域上游的序列，以及(c)檢測(cè)所述PCR的產(chǎn)物。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述基因特異性引物與SARS nsp1、nsp9或刺突蛋白序列互補(bǔ)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述基因特異性引物含有選自以下的序列GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gac aac ctgctc ata aa、GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATA gag gatggg cat cag ca和GAA CAT CGA TGA CAA GCT TAG GTA TCG ATAgtg tta aaa cca gaa gg。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第一個(gè)引物含有序列GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述第二個(gè)引物含有選自以下的序列GGG AAG TTC AAG GTT ACA AGA ATG TGA GAA、CGG TGTAAG TGC AGC CCG TCT TAC ACC GTG和CCT TGA CCG GTGCAC CAC TTT TGA TGA TGT。
11.一種治療或預(yù)防患者冠狀病毒感染的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的含分離雙鏈RNA分子的組合物，其中所述RNA分子含有的第一鏈包含對(duì)應(yīng)于冠狀病毒核苷酸序列的核糖核苷酸序列，含有的第二鏈包含與所述冠狀病毒所述核苷酸序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中所述雙鏈分子抑制所述冠狀病毒的所述核苷酸序列的表達(dá)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述冠狀病毒是SARS病毒。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一鏈和第二鏈?zhǔn)菃为?dú)的互補(bǔ)鏈。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一鏈和第二鏈包含在單個(gè)分子中，其中所述單個(gè)分子包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
15.權(quán)利要求12-13任一項(xiàng)的方法，其中所述SARS病毒的核苷酸序列選自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一鏈包含選自以下的序列AACCTTTGGAGAAGATACTGT、AATCACATTTGAGCTTGATGA、AAGTTGCTGGTTTTGCAAAGT、AAGGATGAGGAAGGCAATTTA、AAGCTCCTAATTACACTCAAC和AATGTTACAGGGTTTCATACT。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述雙鏈RNA分子含選自以下的序列SC2、SC5、SC14和SC15。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述雙鏈RNA分子傳遞入所述患者的氣道中。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述傳遞入所述氣道中通過(guò)鼻內(nèi)傳遞或通過(guò)傳遞入氣管實(shí)現(xiàn)。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物包含載體中的所述雙鏈RNA分子，所述載體含無(wú)RNA酶的葡萄糖水溶液。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述葡萄糖溶液含約5％葡萄糖。
22.權(quán)利要求12的方法，其中所述雙鏈RNA分子的劑量為1-100mg/kg所述患者體重。
23.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物作為無(wú)RNA的水溶液在氣溶膠或粉末中傳遞。
24.一種治療患者呼吸道疾病的方法，所述方法包括給予所述患者氣道雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子含有的第一鏈包含對(duì)應(yīng)于所述疾病相關(guān)基因核苷酸序列的核糖核苷酸序列，含有的第二鏈包含與所述基因所述核苷酸序列互補(bǔ)的核糖核苷酸序列，其中所述疾病相關(guān)基因在所述疾病中表現(xiàn)出不需要的高水平基因表達(dá)，其中所述雙鏈分子抑制所述疾病所述相關(guān)基因的所述核苷酸序列的表達(dá)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述疾病所述相關(guān)基因是病原生物基因。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述病原生物為細(xì)菌、病毒或真菌。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述疾病為自身免疫炎癥或肺癌。
28.權(quán)利要求12的方法，其中使用至少兩種雙鏈RNA分子，所述雙鏈RNA分子靶向SARS病毒的至少兩種不同核苷酸序列。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述兩種核苷酸序列選自nsp1序列、nsp9序列和刺突蛋白序列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)的組合物和方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明描述了以呼吸道感染(包括SARS冠狀病毒)為目標(biāo)的核酸物質(zhì)如siRNA分子及其類似物和其使用方法，用于臨床治療SARS、呼吸道病毒感染、用于生物防御所需的預(yù)防和治療呼吸道感染、用于治療呼吸道疾病以及用于開(kāi)發(fā)呼吸道疾病和感染的治療靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01N43/04GK1922330SQ200480017121
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者Q·Q·唐, P·Y·盧, F·Y·謝, Y·劉, J·徐, M·C·沃德?tīng)?申請(qǐng)人:因特拉迪格姆公司