一種3-脫氫奎尼酸合成酶突變體及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種3-脫氫奎尼酸合成酶突變體及其基因和應(yīng)用。該3-脫氫奎尼酸合成酶突變體是將如序列表中SEQ?ID?No:1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的第153位、第175位、第177位和第336位氨基酸經(jīng)過取代為一個氨基酸且具有3-脫氫奎尼酸合成酶活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的重組3-脫氫奎尼酸合成酶大幅提高了原始出發(fā)酶的活性，能夠大大提高莽草酸途徑中莽草酸的產(chǎn)量。
【專利說明】一種3-脫氫奎尼酸合成酶突變體及其基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程和酶工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種3-脫氫奎尼酸合成酶突 變體及其基因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 莽草酸（Shikimic acid，SA)，化學(xué)名為3,4,5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸。它是 合成芳香族氨基酸、生物堿、吲哚衍生物及手性藥物的前體，其自身具有鎮(zhèn)痛、抗炎及抗血 栓形成的作用。
[0003] 莽草酸的制備方法主要包括：植物提取法、化學(xué)合成法和生物合成法。植物提 取法主要是從八角茴香的果實中分離獲得莽草酸。雖然八角茴香中的莽草酸含量高達(dá) 10%以上，但是八角茴香屬于木蘭科東方小型樹種，僅分布在全球極少數(shù)地區(qū)，其生長受 溫度、濕度和土壤等自然環(huán)境的影響較大，導(dǎo)致植物提取法的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足日益增加 的需求?；瘜W(xué)合成莽草酸雖有多種途徑，但均工藝復(fù)雜且產(chǎn)率不高，如Diels-Alder和逆 Diels-Alder反應(yīng)合成法的產(chǎn)率都只有15%左右。生物合成法主要是以經(jīng)過傳統(tǒng)誘變和分 子育種獲得的重組菌為生產(chǎn)菌株，以葡萄糖等為原料，通過發(fā)酵培養(yǎng)合成莽草酸。3-脫氫奎 尼酸合成酶是微生物體內(nèi)莽草酸合成途徑的關(guān)鍵酶之一，其酶活性的高低與莽草酸產(chǎn)量密 切相關(guān)。
[0004] 蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化技術(shù)，是蛋白質(zhì)工程的新策略，主要是利用分子生物學(xué)手段 在體外改造酶的基因，產(chǎn)生基因多樣性，然后結(jié)合靈敏的篩選技術(shù)，迅速得到理想的突變 體，最終定向選擇有價值的非天然酶。其核心技術(shù)為突變體文庫構(gòu)建技術(shù)及高通量篩選方 法?；谀壳爸参锾崛》ê突瘜W(xué)合成法均不能滿足莽草酸日益增長的需求，而生物合成法 產(chǎn)量也不夠理想的情況下，有必要通過基因工程手段對莽草酸的生物合成途徑進(jìn)行研究和 改造，以達(dá)到高產(chǎn)莽草酸的目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的生物合成法中3-脫氫奎尼酸合成 酶活性不夠高而導(dǎo)致莽草酸產(chǎn)量不高的缺陷，提供一種3-脫氫奎尼酸合成酶突變體及其 基因和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明中利用易錯PCR技術(shù)對大腸桿菌（Escherichia coli)W3110的3-脫氫奎 尼酸合成酶進(jìn)行定向改造，并利用對營養(yǎng)缺陷型宿主的基因功能回補進(jìn)行高通量篩選，進(jìn) 而考察突變體基因的表達(dá)并測定突變體酶活性，最終獲得酶活性顯著提高的突變體。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種分離的蛋白質(zhì)，所述分離的蛋白質(zhì)是將如序 列表中SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的第153位、第175位、第177位和第336位 氨基酸經(jīng)過取代為一個氨基酸且具有3-脫氫奎尼酸合成酶活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明中，所述的分離的蛋白質(zhì)具有3-脫氫奎尼酸合成酶活性，其為重組3-脫氫 奎尼酸合成酶。較佳地，所述分離的蛋白質(zhì)為將如序列表中SEQ ID No: 1所示氨基酸序列 的蛋白質(zhì)的第153位的甲硫氨酸突變?yōu)樘K氨酸（M153T);所述氨基酸序列中第175位的脯 氨酸突變?yōu)樘K氨酸（P175T);所述氨基酸序列中第177位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔‥177G); 所述氨基酸序列中第336位的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸（L336S)所得的蛋白質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明中，所述分離的蛋白質(zhì)的制備方法為本領(lǐng)域的常規(guī)制備方法。所述制備方 法較佳地為：從自然界中天然存在的蛋白質(zhì)中分離獲得，從重組表達(dá)該蛋白質(zhì)的表達(dá)轉(zhuǎn)化 體中分離獲得或者通過人工合成蛋白質(zhì)序列獲得。所述制備方法更佳地為：將編碼所述蛋 白質(zhì)的核酸分子克隆到重組載體中，將所得重組載體轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化體中，得到重組表達(dá)轉(zhuǎn)化 體，通過培養(yǎng)所得重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，即可分離純化獲得所述蛋白質(zhì)。
[0010] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：一種分離的核酸，所述核酸是編碼上述分離的蛋 白質(zhì)的核酸分子。
[0011] 其中所述核酸的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法，所述制備方法較佳地包括： 從自然界中提取天然存在的編碼上述分離的蛋白質(zhì)的核酸分子，通過基因克隆技術(shù)獲得編 碼上述分離的蛋白質(zhì)的核酸分子，或者通過人工全序列合成的方法得到編碼上述分離的蛋 白質(zhì)的核酸分子。
[0012] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知：編碼上述分離的蛋白質(zhì)的核酸分子的堿基序列可以適當(dāng) 引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。所述的多聚核苷酸的 同系物可以通過對編碼該分離的蛋白質(zhì)的核酸分子的堿基序列的一個或多個堿基在保持 酶活性范圍內(nèi)進(jìn)行替換、缺失或增加來制得。
[0013] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是：一種包含上述核酸的重組表達(dá)載體。
[0014] 其中所述重組表達(dá)載體可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得，即：將本發(fā)明所述的核酸分 子連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的表達(dá)載體為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體。所述載體 較佳地包括：各種質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，本發(fā)明所述載體優(yōu)選Novagen公司的 質(zhì)粒 pETDuet-1。
[0015] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四是：一種包含上述重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
[0016] 其中所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的制備方法較佳地為：將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿 主微生物中制得。所述的宿主微生物較佳地為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿足 使上述重組表達(dá)載體穩(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶的編碼所述的分離的蛋白質(zhì)的基因能夠 被有效表達(dá)即可。其中所述宿主微生物較佳地為：大腸桿菌（E.coli)，更佳地為大腸桿菌 BL21(DE3)。將前述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因 工程菌株。其中所述轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，較佳地為化學(xué)轉(zhuǎn)化法，熱激法或電轉(zhuǎn) 法。
[0017] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之五是：一種重組3-脫氫奎尼酸合成酶的制備方法，其中 包括如下步驟：培養(yǎng)上述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組3-脫氫奎尼酸合成酶。
[0018] 其中所述制備方法較佳地為：將上述重組大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培 養(yǎng)過夜后，按1%的接種量接種至LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D_值達(dá)到0. 6時，加入IPTG至 終濃度為〇. 5mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，將菌液于12000r/min下離心5min，棄上清得到菌體，然后 用10mM磷酸甘油鹽溶液(含0. 25mM C〇C12,0. 5mM NAD+，pH6. 6)按1. 5ml/g菌體的比例重懸 菌體，菌懸液于冰浴中超聲破碎，12000r/min4°C下離心20min，取上清，上清液用10mM磷酸 鉀溶液(含〇. 25mM C〇Cl2，pH6. 6)于4°C下透析24h后，即可得到高效表達(dá)的重組3-脫氫奎 尼酸合成酶。
[0019] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之六是：上述分離的蛋白質(zhì)或上述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體在生產(chǎn) 莽草酸中的應(yīng)用。
[0020] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實 例。
[0021] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0022] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0023] 隨著流感病毒亞型的連續(xù)爆發(fā)，莽草酸作為合成抗流感特效藥"達(dá)菲"的主要原料 變得供不應(yīng)求。本發(fā)明的重組3-脫氫奎尼酸合成酶具有3-脫氫奎尼酸合成酶的活性，是 生物合成莽草酸途經(jīng)中的關(guān)鍵酶。本發(fā)明的重組3-脫氫奎尼酸合成酶大幅提高了原始出 發(fā)酶的活性，其酶活性較野生型3-脫氫奎尼酸合成酶提高了 30%，從而能夠大大提高莽草 酸生物合成途徑中莽草酸的產(chǎn)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的特征和有益效果。
[0025] 圖1為M9固體平板上3-脫氫奎尼酸合成酶（aroB)基因缺失及回補對菌體生長 的影響，其中，1:大腸桿菌BL21 (DE3);2?4:aroB基因缺失型大腸桿菌BL21 (DE3);5? 8 :利用質(zhì)粒pETDuet-aroB進(jìn)行基因功能回補的aroB基因缺失型大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0026] 圖2為aroB基因缺失型大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)aroB基因突變體的SDS-PAGE 電泳圖，Μ :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（寬）；1?6 :含有質(zhì)粒pETDuet-aroB的aroB基因缺失型大 腸桿菌BL21 (DE3);7:aroB基因缺失型大腸桿菌BL21 (DE3)。

【具體實施方式】
[0027] 下面通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0028] 本發(fā)明對大腸桿菌（Escherichia coli W3110)3_脫氫奎尼酸合成酶基因（該基因 名稱：aroB，其在GenBank中的登錄號為12930302)進(jìn)行定向進(jìn)化，利用易錯PCR技術(shù)構(gòu)建 3-脫氫奎尼酸合成酶基因突變體文庫，并以3-脫氫奎尼酸合成酶營養(yǎng)缺陷型菌株為宿主 通過基因功能回補對其基因突變體文庫進(jìn)行篩選，進(jìn)而考察生長良好的突變體的基因表達(dá) 量和酶活性，最終獲得一株酶活性顯著提高的突變體。
[0029] 下述實施例中所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0030] 實施例13-脫氫奎尼酸合成酶基因的突變體文庫的構(gòu)建
[0031] (1)設(shè)計用于易錯PCR擴(kuò)增3-脫氫奎尼酸合成酶基因的引物，上游引物B1(如SEQ ID No:2 所示)的序列為 5'-AAAACCATGGAGAGGATTGTCGTTACTCTCGG-3'，下游引物 B2 (如 SEQ ID No: 3 所示）的序列為 5' -GACAAAGCTTACGCTGATTGACAATCGGCAAT-3'，分別含有 Nco I 和 Hind III酶切位點。
[0032] (2)以大腸桿菌 W3110 (購自 E. coli Genetic Stock Center，Yale University, 即耶魯大學(xué)大腸桿菌保藏中心)的基因組為模板，利用引物B1和B2在Taq DNA聚合酶的催 化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得3-脫氫奎尼酸合成酶基因片段，瓊脂糖凝膠回收第一輪易錯PCR 獲得的基因片段，并以其為模板進(jìn)行第二輪易錯PCR。PCR反應(yīng)體系（20μ1)如下：Taq DNA 聚合酶（5們0.2以1，染色體基因模板0.5以1，]\%2+(251111)4 4 1，]\1112+(51111)0.4 4 1，（^丁？ (10mM) 0· 4μ 1，dTTP (10mM) 2μ 1，dGTP (10mM) 0· 4μ 1，dCTP (10mM) 2μ 1，上游引物 B1 (20以]\〇0.5 4 1，弓丨物82(2(^]\〇0.5 4 1，10\?0?緩沖液(不含]\%2+)2 4 1，（1(1!1207.1 4 1， 以上試劑均購自上海捷瑞生物工程有限公司。擴(kuò)增的程序為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 40s，58°C退火 40s，72°C延伸 lmin，共 35 個循環(huán)；72°C再延伸 lOmin。
[0033] (3)用Nco I和Hind III對經(jīng)兩輪易錯PCR擴(kuò)增的3-脫氫奎尼酸合成酶基因片 段和載體pETDuet-KNovagen公司)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用T4連 接酶（TaKaRa公司）于16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化3-脫氫奎尼酸合成酶基因缺陷型菌株 (構(gòu)建過程見實施例2)并涂布于含有100mg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12? 16h，待單菌落長出后，將平板放于4°C保藏備用。
[0034] 實施例23-脫氫奎尼酸合成酶基因突變體文庫的篩選
[0035] (1) 3-脫氫奎尼酸合成酶基因缺陷型菌株的構(gòu)建
[0036] 將表達(dá)Red重組酶的質(zhì)粒pKD46 (購自耶魯大學(xué)大腸桿菌保藏中心，該質(zhì)粒 信息在文獻(xiàn) Baba T, Ara T, Hasegawa M, et al. Construction of Escherichia coli K-12in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection Mol Syst Biol2006:2-8中有披露）導(dǎo)入E. coli BL21(DE3)，在含有l(wèi)OOmg/mL氨芐青霉素的LB固體 平板上篩選轉(zhuǎn)化子(培養(yǎng)溫度為30°C )。將轉(zhuǎn)化子接種LB液體培養(yǎng)基，30°C 200r/min下振 蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體〇D_達(dá)到0. 2時加入ImM L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red重組酶，誘導(dǎo)時間不少 于lh，0D_約為0. 6時收獲菌體，制備感受態(tài)細(xì)胞。利用電轉(zhuǎn)化法將用于同源重組的片段 導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。用于同源重組的片段是以BR1 (5' -GCGGCTCTGTGAAATCCC-3'）和BR2 (5, -GTTGTTGACCATCCGTTGC-3'）為引物（BR1 和 BR2 的序列分別如 SEQ ID No:4 和 SEQ ID N0:5所示)，以大腸桿菌3-脫氫奎尼酸合成酶突變株E.C0liJW3352-l(購自耶魯大學(xué)大 腸桿菌保藏中心，該菌株信息在文獻(xiàn)Baba T, Ara T, Hasegawa M, et al. Construction of Escherichia coli K-12in-frame, single-gene knockout mutants:the Keio collection Mol Syst Bi〇12006:2-8中有披露)的基因組為模板獲得的含有卡那霉素抗性的PCR片段。 然后，迅速向電轉(zhuǎn)后的感受態(tài)細(xì)胞中加入lml LB培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)lh后升溫42°C繼續(xù)培養(yǎng) lh，取適量培養(yǎng)后的菌液涂布含有25mg/mL卡那霉素的LB固體平板。次日，通過點種試驗 選擇具有卡那霉素抗性但不具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，以菌落PCR的方法驗證3-脫氫 奎尼酸合成酶基因的缺失，并測序。測序結(jié)果表明3-脫氫奎尼酸合成酶基因缺陷型菌株構(gòu) 建成功。
[0037] (2) 3-脫氫奎尼酸合成酶基因突變體文庫的篩選
[0038] 3-脫氫奎尼酸合成酶基因缺失將導(dǎo)致宿主菌成為營養(yǎng)缺陷型菌株，因此，可在基 本培養(yǎng)基上，以該營養(yǎng)缺陷型菌株為宿主，通過3-脫氫奎尼酸合成酶基因功能回補實驗， 對突變體文庫進(jìn)行篩選，從而獲得依然具有酶功能的突變體（圖1)。將實施例1中獲得的所 有單菌落點種M9固體培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)，37°C下靜置培養(yǎng)24h，選取在M9固體培養(yǎng)基上 可以生長的菌落。M9培養(yǎng)基（1L):5XM9鹽溶液200ml，20%葡萄糖20ml，1M MgS042ml，lM CaCl20. lml，瓊脂15g。5XM9鹽溶液（1L):磷酸氫二鈉(十二水）75g，磷酸氫二鉀15g，氯化 鈉2. 5g，氯化銨5g，用去離子水定容體積至1L，調(diào)節(jié)pH至7. 4,高壓滅菌20min備用。
[0039] 實施例33-脫氫奎尼酸合成酶基因突變體的表達(dá)
[0040] 將實施例2中M9固體培養(yǎng)基上生長的突變體菌株接種至裝有20ml種子培養(yǎng)基的 250ml三角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜后，按1%接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至 〇D_約為0. 6時，加入IPTG至終濃度為1禮，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后將菌液于12000r/min下離 心5min，棄上清，菌體用于SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖2所示，與7號宿主菌相比，1?6號 菌株表達(dá)了 38kDa的目的蛋白，其表達(dá)量較高。
[0041] 實施例43-脫氫奎尼酸合成酶基因突變體的酶活測定
[0042] 參照文獻(xiàn)（Frost J W, Bender J L, Kadonaga J T, et al. Dehydroquinate synthetase from Escherichia coli:purification,cloning,and construction of overproducers of the enzyme. Biochemistry, 1984, 23(19) :4470-4475.)中的方法進(jìn)行酶 活測定。按照實施例3中的方法收集菌體，用lOmM磷酸甘油鹽溶液(含0. 25mM C〇Cl2, 0. 5mM NAD+，pH6. 6)按1. 5ml/g菌體的比例重懸菌體，菌懸液于冰浴中超聲破碎，12000r/min4°C 下離心20min，取上清。上清液用10mM磷酸鉀溶液(含0.25mM CoCl2，pH6.6)于4°C下透 析24h后即為粗酶液，用于酶活力測定。2mL酶活測定體系中含有100 μ Μ磷酸鉀緩沖液 (ρΗ7·4)，0·5μΜ DAHP，0.2yM CoCl2,0.02yM NAD+以及適量粗酶液，反應(yīng)溫度為 37°C (參考自文獻(xiàn) Srinivasan PR, Rothschild J, Sprinson DB. The enzymic conversion of 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid7_phosphate to 5-dehydroquinate[J]. J Biol Chem, 1963, 238(10) :3176-3182)。反應(yīng) Omin 和 30min 的反應(yīng)液各取 0· 5mL，分別加入 0. 2mL10%三氯乙酸以沉淀蛋白，離心取上清，加入顯色液2mL，測定548nm處的吸光度，計算 差值。酶活力單位：在上述反應(yīng)條件下，反應(yīng)體系中l(wèi)min內(nèi)使DAHP減少1 μ Μ的酶量。
[0043] 酶活測定結(jié)果表明3號突變體的酶活性較野生型的酶活性提高了 30%。將 該突變體接種LB液體培養(yǎng)基，37°C 200r/min下過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以上游引物Ρ1 (5 ' -ATGCGTCCGGCGTAGA-3 '）和下游引物 P2 (5 ' -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 '）進(jìn)行測序 (P1和P2的序列分別如SEQ ID No:6和SEQ ID此:7所示)，結(jié)果表明其突變位點為組531\ P175T、E177G和 L336S。
[0044] 應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種 改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0001] 序歹丨j表 P4E1310038C <110〉上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 <120〉--種3-脫望〖_尼酸合成酶突變體及其基因和應(yīng)用 <130> P4R1310038C <160> 7 <170> Patentln version 3.5 <210〉 1 <211> 362 <212〉 PRT <213 > Escherichia coli <400> 1 Met Glu Arg lie Val Val Thr Leu Gly Glu Arg Ser Tyr Pro lie Thr 15 10 15 lie Ala Ser Gly Leu Phe Asn Glu Pro Ala Ser Phe Leu Pro Leu Lys 20 25 30 Ser Gly Glu Gin Val Mel Leu Val Thr Asn Glu Thr Leu Ala Pro Leu 35 40 45 Tyr Leu Asp Lys Val Arg Gly Val Leu Glu Gin Ala Gly Val Asn Val 50 55 60 Asp Ser Val Tie i.eu Fro Asp Gly Glu Gin Tyr Lys Ser i.eu Ma Val 65 70 75 80 Leu Asp Thr Val Phe Thr Ala Leu Leu Gin Lys Pro His Gly Arg Asp 85 90 95 Thr Thr Leu Val Ala Leu Gly Gly Gly Val Val Gly Asp Leu Thr Gly 100 105 110 Phe Ala Ala Ala, Ser Tyr Gin Arg Gly Val Arg Phe lie Gin Val Pro 115 120 125 Thr Thr Leu Leu Ser Gin Val Asp Ser Ser Val Gly Gly Lys Thr Ala 130 135 140 VaJ Asn His Pro Leu Gly Lys Asn Thr Tie Gly Ala Phe Tyr Gin Pro
[0002] 序歹 Ij 表 P4E1310038C 145 150 155 160 Ala Ser Val Val Val Asp Leu Asp Cys Leu Lys Thr Leu Pro Thr Arg 165 170 175 Gly Leu Ala Ser Gly Leu Ala Glu Val lie Lys Tyr Gly lie lie Leu 180 185 190 Asp Gly Ala Phe Phe Asn Trp Leu Glu Glu Asn Leu Asp Ala Leu Leu 195 200 205 Arg Leu Asp Gly Pro Ala Met Ala Tyr Cys lie Arg Arg Cys Cys Glu 210 215 220 Leu Lys Ala Glu Val Val Ala Ala Asp Glu Arg Glu Thr Gly Leu Arg 225 230 235 240 Ala Leu Leu Asn Leu Gly His Thr Phe Gly His Ala lie Glu Ala Glu 245 250 255 Met Gly Tyr Gly Asn Trp Leu His Gly Glu Ala Val A]a Ala Gly Met 260 265 270 Val Met Ala Ala Arg Thr Ser Glu Arg Leu Gly Gin Phe Ser Ser Ala 275 280 285 Glu Thr Gin Arg lie lie Thr Leu Leu Lys Arg Ala Gly Leu Pro Val 290 295 300 Asn Gly Pro Arg Glu Met Ser Ala Gin Ala ?γτ Leu Pro His Met Leu 305 310 315 320 Arg Asp Lys Lys Val Leu Ala Gly Glu Met Arg Leu He Leu Pro Ser 325 330 335 Ala lie Gly Lys Ser Glu Val Arg Ser Gly Val Ser His Glu Leu Val 340 345 350 Leu Asn Ala lie Ala Asp Cys Gin Ser Ala 355 360 <210〉 2 <211> 32 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉引物
[0003] <400〉 2 序歹 Ij 表 P4E1310038C aaaaccatgg agaggattgt cgttactctc gg 32 <210〉 3 <211> 32 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉引物 <400> 3 gacaaagctt acgctgattg acaatcggca at 32 <210> 4 <211〉 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉引物 <400> 4 gcggctctgt gaaatccc 18 <210〉 5 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉引物
[0004] 序列表 P4EI3I003HC <400> 5 gttgttgacc atccgttgc 19 <210> 6 <211〉 16 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉引物 <400〉 6 atgcgtccgg cgtaga 16 <210> 7 <211〉 20 <212> DKA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉引物 <400> 7 tgctagttat tgctcagcgg 20
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述分離的蛋白質(zhì)是將如序列表中SEQ ID No: 1所 示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的第153位、第175位、第177位和第336位氨基酸經(jīng)過取代為一個 氨基酸且具有3-脫氫奎尼酸合成酶活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于： 所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中第153位的甲硫氨酸突變?yōu)樘K氨酸； 所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中第175位的脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸； 所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中第177位的谷氨酸突變?yōu)楦拾彼幔? 所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中第336位的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸。
3. -種分離的核酸，其特征在于，所述核酸是編碼如權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)的核酸 分子。
4. 一種包含如權(quán)利要求3所述的核酸的重組表達(dá)載體。
5. -種包含如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體。
6. -種重組3-脫氫奎尼酸合成酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步 驟：培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組3-脫氫奎尼酸合成酶。
7. 如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或如權(quán)利要求5所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體在生產(chǎn)莽草酸中的應(yīng) 用。
【文檔編號】C12N15/63GK104120119SQ201310157144
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】朱寶泉, 劉宇, 林軍, 胡海峰, 周斌 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院