一種生物法合成α-或β-蒎烯的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了從乙酰輔酶A合成α-或β-蒎烯的生物學(xué)方法以及能夠合成α-或β-蒎烯的重組細(xì)胞，其中所用的乙酰輔酶A是從諸如葡萄糖的簡單起始材料獲得的。所述方法包括：通過代謝工程技術(shù)將乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和蒎烯合酶轉(zhuǎn)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，將得到的重組細(xì)胞經(jīng)過培養(yǎng)后，即可獲得目的產(chǎn)物α-或β-蒎烯。
【專利說明】一種生物法合成Ct -或β -蒎烯的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及利用生物法制備異戊二烯衍生物的方法。具體地，本發(fā)明涉及一種生 物法合成α_或β_菔烯的方法以及能夠合成α_或β_菔烯的重組細(xì)胞，其中所用的乙 酰輔酶Α是從諸如葡萄糖的簡單起始材料獲得的。

【背景技術(shù)】
[0002] 異戊二烯衍生物--菔烯是一種重要的平臺化合物，由于菔烯二聚體的高能量密 度和燃燒凈熱值很高（能量密度：〇. 938g/cm3 ;燃燒凈熱值：39. 5MJ/L)，被廣泛應(yīng)用于高密 度燃料的合成。除此之外，還可以用于合成藥理活性物、農(nóng)用及家用生物活性物、功能材料、 香料、松油醇、芳香醇、乙酸松油酯、二氫松油醇、二氫月桂烯醇及高密度噴氣燃料等。
[0003] 目前工業(yè)上獲得菔烯的主要方法是采用高效精餾塔從脂松節(jié)油或粗硫酸鹽松節(jié) 油中進(jìn)行分離提取。這種方法存在對設(shè)備要求高，操作困難，能耗大，效率低等缺點(diǎn)，同時造 成大量自然資源的浪費(fèi)。
[0004] 開展生物法制備菔烯的研究可以有效的解決高密度燃料存在的原料瓶頸問題。高 密度燃料是噴氣燃料的重要成員之一，是噴氣式飛機(jī)、導(dǎo)彈發(fā)動機(jī)的動力源，在導(dǎo)彈和航天 技術(shù)發(fā)展中起著重要的作用。由特定高密度化合物合成的高密度燃料與傳統(tǒng)精餾高密度燃 料相比具有密度更大，燃燒熱值更高，綜合性能更好的特點(diǎn)，但同時也受到原料來源制約造 成成本居高不下。降低高密度燃料成本、開發(fā)可持續(xù)的高密度燃料的合成技術(shù)，以滿足高密 度燃料在軍事應(yīng)用中的巨大缺口，解決高密度燃料原料不足問題具有重要戰(zhàn)略意義。
[0005] 生物體中主要存在兩種天然的代謝途徑進(jìn)行異戊二烯的生物合成，即甲羥戊酸 (MVA)途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸（MEP)途徑。MVA途徑主要存在于真核生物、古細(xì)菌和 高等植物的細(xì)胞液中，而MEP途徑存在于植物的質(zhì)體、細(xì)菌和藻類中。這兩類代謝途徑的最 終產(chǎn)物都是形成異戊二烯的前體物質(zhì)二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate， DMAPP)，之后經(jīng)過異戊二烯合成酶催化DMAPP至異戊二烯及其衍生物。
[0006] 此前，還沒有利用微生物發(fā)酵獲得菔烯的相關(guān)報道。本發(fā)明首次介紹了利用微生 物發(fā)酵獲得菔烯的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開一種利用可再生資源葡萄糖為原料，通過生物催化劑制備異戊二烯衍 生物--α -或β -菔烯，建立可持續(xù)發(fā)展的異戊二烯衍生物--α -或β -菔烯合成工藝 路線。
[0008] 本發(fā)明主要通過基因工程手段對MVA途徑合成異戊二烯衍生物--α -或β -菔 烯相關(guān)酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行外源表達(dá)。最終在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)成功建立了一種異戊二 烯衍生物--α-或β-菔烯的生物合成途徑。
[0009] 具體地，在第一方面中，本發(fā)明提供一種能夠從乙酰輔酶Α合成α-或β-菔烯的 重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下述基因片段：乙酰輔酶Α酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰 輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊 酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶，其中所述重 組細(xì)胞通過基因工程技術(shù)將所述基因片段轉(zhuǎn)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中而制備。其中可用的 宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。在優(yōu)選的是實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞為重組大 腸桿菌細(xì)胞，其能夠在包含葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從乙酰輔酶A合成 α_或菔烯。
[0010] 其中所述乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌Ginterococcusfaecalis)，或3)來源于 其它生物體，和乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功 能的蛋白的核酸序列。
[0011] 所述3-輕-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌Ginterococcusfaecalis)，或3)來源于 其它生物體，和3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因沒有明顯的同源性，編碼具有相同或 相似功能的蛋白的核酸序列。
[0012] 所述輕甲基戊二酰輔酶A還原酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌Ginterococcusfaecalis)，或3)來源于 其它生物體，和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相 似功能的蛋白的核酸序列。
[0013] 所述甲輕戊酸激酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選 釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它生物體，和甲羥戊酸激酶基因沒有明顯 的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0014] 所述甲輕戊酸-5-磷酸激酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它生物體，和甲羥戊 酸-5-磷酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0015] 所述甲輕戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它生物體，和甲羥戊 酸-5-二磷酸脫羧酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序 列。
[0016] 所述異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它生物體，和異戊烯焦 磷酸異構(gòu)酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0017] 所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源于：1)大腸桿菌（Escherichia coli)，或2)來 源于北美冷杉（Abiesgrandis),優(yōu)選北美冷杉或3)來源于其它生物體，和香葉酯二磷酸合 成酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0018] 所述菔烯合酶基因來源于：1)火炬松（Pinustaeda)，2)北美冷杉 (Abiesgrandis), 3)黃花蒿（ArtemiSia annua),或4)來源于其它生物體，和菔烯合酶基因 沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0019] 其中所用的宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，包括但不限于大腸桿菌細(xì)胞。
[0020] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在大腸桿菌中共同表達(dá)來源于糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/輕甲基戊二酰輔酶A還原酶基因 (mvaE，SEQ ID N0:l)，3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因（mvaS，SEQ ID N0:2);來源于釀 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的甲輕戊酸激酶基因（ERG12，SEQ ID N0:5)，甲輕戊 酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，SEQIDN0:6)，甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因（ERG19，SEQID N0 :7)，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（IDIl，SEQIDN0:8);來源于北美冷杉（Abi eSgrandiS) 的香葉酯二磷酸合成酶基因（GPPS2，SEQ ID NO :3)和來源于火炬松（Pinustaeda)的α -菔 烯合成酶基因（Pt30，SEQ ID NO :4)構(gòu)建能夠利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶Α生物合 成α-菔烯的重組大腸桿菌細(xì)胞。
[0021] 在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在大腸桿菌中共同表達(dá)來源于糞腸球菌的乙酰 輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶Α還原酶基因（mvaE，SEQ ID N0:l)，3-羥-3-甲 基戊二酰輔酶Α合酶基因（mvaS，SEQ ID NO :2);來源于釀酒酵母的甲羥戊酸激酶基因 (ERG12，SEQ ID N0:5)，甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，SEQ ID N0:6)，甲羥戊酸-5-二 磷酸脫羧酶基因（ERG19，SEQ ID N0:7)，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（IDI1，SEQ ID N0:8);來 源于北美冷杉的香葉酯二磷酸合成酶基因（GPPS2, SEQ ID NO :3)和來源于黃花蒿的β-菔 烯合成酶基因（QH6，SEQ ID NO :9)構(gòu)建能夠利用葡萄糖降解中間產(chǎn)物乙酰輔酶Α生物合成 β-菔烯的重組大腸桿菌細(xì)胞。
[0022] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，為在重組細(xì)胞中更好地表達(dá)，上述各種酶的基因序列 或由其衍生的編碼具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根據(jù)所用的宿主細(xì)胞的 密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化。
[0023] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，上述各種酶的基因序列或由其衍生的編碼具有相同 或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常規(guī)分子克隆技術(shù)克隆到宿主細(xì)胞中。另外，這 些核苷酸片段還可以與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件（例如，啟動子，增強(qiáng)子等）可操作地連接。這 些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，不需要付出創(chuàng)造性的勞動。這些核苷酸片段可操 作性連接可以借助于接頭也可以不用接頭，這可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行適 當(dāng)?shù)倪x擇。
[0024] 在第二方面中，本發(fā)明提供一種生物法合成α -或β -菔烯的方法，所述方法包括 下述步驟：
[0025] Α)構(gòu)建能夠從乙酰輔酶Α合成α-或β_菔烯的重組細(xì)胞（即，本發(fā)明第一方面 的重組細(xì)胞），所述重組細(xì)胞包含下述基因片段：乙酰輔酶Α酰基轉(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊 二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥 戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶；
[0026] B)利用A)中所述重組細(xì)胞在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑 誘導(dǎo)，經(jīng)過分離純化后即可獲得α-或β-菔烯。
[0027] 關(guān)于能夠從乙酰輔酶Α合成α-或β_菔烯的重組細(xì)胞的構(gòu)建可以參見本發(fā)明第 一方面的描述。
[0028] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞構(gòu)建好能夠從乙酰輔酶Α合成 α -或β -菔烯的重組細(xì)胞后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)技術(shù)常識或經(jīng)過有限次實(shí)驗(yàn)確定 合適的培養(yǎng)條件（例如，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度、攪拌速度、pH值、溶氧率、發(fā)酵時間等參數(shù)），也能 夠選擇合適的誘導(dǎo)劑，確定加入誘導(dǎo)劑的時機(jī)，等等。這不需要付出創(chuàng)造性的勞動。
[0029] 因此，本發(fā)明提供下列各項(xiàng)：
[0030] 1、一種生物法合成α -或β -菔烯的方法，所述方法包括下述步驟：
[0031] Α)構(gòu)建能夠從乙酰輔酶Α合成α -或β -菔烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下 述基因片段：乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶Α合酶、羥甲基戊二酰輔酶 A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷 酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶；
[0032] B)利用A)中所述重組細(xì)胞在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑 誘導(dǎo)，經(jīng)過分離純化后即可獲得α-或β-菔烯。
[0033] 2、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶基因來源于： 1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)來源于其它生物體，和乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因沒有明 顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0034] 3、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因來 源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)來源于其它生物體，和3-輕-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基 因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0035] 4、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因來源 于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)來源于其它生物體，和輕甲基戊二酰輔酶A還原酶基因沒 有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0036] 5、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述甲羥戊酸激酶基因來源于：1)釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae),優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它生 物體，和甲羥戊酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸 序列。
[0037] 6、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因來源于：1)釀酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其 它生物體，和甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能 的蛋白的核酸序列。
[0038] 7、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因來源于：1) 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源 于其它生物體，和甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或 相似功能的蛋白的核酸序列。
[0039] 8、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來源于：1)釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它 生物體，和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋 白的核酸序列。
[0040] 9、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源于：1)大腸桿 菌（Escherichia coli)，或2)來源于北美冷杉（Abiesgrandis)，優(yōu)選北美冷杉或3)來源 于其它生物體，和香葉酯二磷酸合成酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功 能的蛋白的核酸序列。
[0041] 10、根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中所述菔烯合酶基因來源于：1)火炬松 (Pinustaeda)，2)北美冷杉（Abiesgrandis)，3)黃花蒿（ArtemiSia annua)，或 4)來源于 其它生物體，和菔烯合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核 酸序列。
[0042] 11.根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，其中步驟A)所述的重組細(xì)胞通過基因工程技術(shù)將編 碼乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、 甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、 香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶的基因片段轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞構(gòu)建而成，其中所述宿主 細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。
[0043] 12、一種能夠從乙酰輔酶A合成α -或β -菔烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下 述基因片段：乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶Α合酶、羥甲基戊二酰輔酶 A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷 酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶，其中所述重組細(xì)胞通過基因工程技術(shù)將所述 基因片段轉(zhuǎn)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中而制備。
[0044] 13、根據(jù)第12項(xiàng)所述的重組細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌 細(xì)胞。
[0045] 本發(fā)明的有益效果：
[0046] 與傳統(tǒng)的制備工藝相比，利用微生物催化合成菔烯的路線具有如下的優(yōu)勢：（1) 由于有專一性的菔烯合成酶，所以生成的產(chǎn)物具有高選擇性，工業(yè)上可以大大降低分離成 本；（2)使用的原料為木質(zhì)纖維素降解獲得的葡萄糖是可再生資源。（3)整個過程是在常溫 常壓下進(jìn)行，能耗低。因此，利用生物催化手段制備菔烯將成為今后菔烯工業(yè)發(fā)展的必然趨 勢。此外，微生物具有生長速度快、發(fā)酵周期短、遺傳背景清楚、易于工程化操作、可利用廉 價的可再生資源等特點(diǎn)，因此微生物作為生物催化劑已成為近年來生產(chǎn)生物基化學(xué)品的有 效手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中：
[0048] 圖1是利用乙酰輔酶A生物合成異戊二烯衍生物--α -或β -菔烯代謝途徑示 意圖。
[0049] 圖2是pYJM3質(zhì)粒圖譜。
[0050] 圖3是pYJM4質(zhì)粒圖譜。
[0051] 圖4是pYJM5質(zhì)粒圖譜。
[0052] 圖5是發(fā)酵產(chǎn)物菔烯結(jié)構(gòu)的GC分析圖譜。
[0053] 圖6顯示工程菌YJM28產(chǎn)α -菔烯的時間曲線。工程菌YJM28的α -菔烯產(chǎn)量 (▲)和細(xì)胞生長（)。當(dāng)工程菌細(xì)胞生長12h開始進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0054] 圖7顯示誘導(dǎo)溫度對工程菌α -菔烯的影響。當(dāng)工程菌YJM28的細(xì)胞0D6(?達(dá) 0. 6-0. 9時，向培養(yǎng)基中添加終濃度為ImM的IPTG，分別在不同的溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)29h : 25°C (白色），30°C (淺灰色），34°C (灰色），37°C (深灰色）。上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)三次 的平均值。
[0055] 圖8顯示IPTG濃度對工程菌產(chǎn)α -菔烯的影響。當(dāng)工程菌YJM28的細(xì)胞0D_ 達(dá)0. 6-0. 9時，在誘導(dǎo)溫度為30°C，不同終濃度IPTG的條件下誘導(dǎo)66h :0. lmM( )， 0· 25mM( ? )，0· 5mM( ▲ )，lmM( ·)。上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)三次的平均值。
[0056] 圖9是發(fā)酵產(chǎn)物菔烯結(jié)構(gòu)的GC分析圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0057] 下面參照具體的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā) 明并不限于這些具體的實(shí)施例。
[0058] 實(shí)施例1
[0059] 通過在大腸桿菌中共同表達(dá)來源于糞腸球菌（Enterococcus faecalis)的乙酰輔 酶A?；D(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（mvaE，SEQ ID N0:1)，3-羥-3-甲 基戊二酰輔酶A合酶基因（mvaS，SEQ ID NO :2);來源于釀酒酵母的甲羥戊酸激酶基因 (ERG12，SEQ ID N0:5)，甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，SEQ ID N0:6)，甲羥戊酸-5-二 磷酸脫羧酶基因（ERG19, SEQ ID N0:7)，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（IDI1，SEQ ID N0:8); 來源于北美冷杉（Abiesgrandis)的香葉酯二磷酸合成酶基因（GPPS2, SEQ ID NO :3)和來 源于火炬松（Pinustaeda)的α-菔烯合成酶基因（Pt30, SEQ ID N0:4)，利用葡萄糖降解 中間產(chǎn)物乙酰輔酶A生物合成異戊二烯衍生物--α-菔烯。
[0060] 1. 1外源基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0061] 1.1.1外源基因的克隆
[0062] 1. 1. 1. 1糞腸球菌MVA上游代謝途徑基因的克隆
[0063] 來自于奠腸球菌（Enterococcusfaecalis)的mvaS基因 （GenBank No. AAG02439), mvaE基因 （GenBank N〇.AAG02438)由上海捷瑞公司通過化學(xué)合成方法獲得。之后分別與載 體pGH (購自上海捷瑞生物工程有限公司）連接獲得pGH/mvaS，pGH/mvaE。
[0064] 1· 1· 1. 2GPPS2, Pt30 基因的克隆
[0065] 分別對來自于 Abiesgrandis GPPS2 基因 （GenBank No. AF513112. 1)，Pinustaeda Pt30基因 （GenBank No. AF543530. 1)基因序列進(jìn)行稀有密碼子分析（http://www. genscript. com/cgi_bin/tools/rare_codon_analysis)，并將其稀有密石馬子優(yōu)化為 Ε· coli 偏好的密碼子（ http://www.jcat.de/)。優(yōu)化后的GPP合成酶基因（GPPS2)、菔稀合成酶基 因（Pt30)送上海捷瑞公司進(jìn)行化學(xué)合成，并連入pGH載體上分別形成pGH-GPPS2，pGH-Pt30 載體。
[0066] 1. 1. 2表達(dá)載體的構(gòu)建
[0067] 1. 1. 2. lpYJM24 載體構(gòu)建
[0068] 將 pGH-GPPS2 載體與 pACYCDuet-Ι 載體（Novagen)分別用 Ndel 和 Bglll 進(jìn)行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1 : 5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g · mL-1氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆， 從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pYJM24(pACY-GPPS2)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。
[0069] 1. 1. 2. 2pYJM26 載體構(gòu)建
[0070] 將 pACY-mvaE-mvaS-ispSPa 載體（pYJM20,參見 Jianming Yang，Plos One， 2012D0I :10.1371/journal, pone. 0033509)與 pACY-GPPS2(pYJM24)載體分別用 Ncol 和PstI進(jìn)行雙酶切，載體pACY-GPPS2與外源片段mvaE-mvaS按摩爾比1 : 5的比 例，4°C連接過夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，然后涂布加有 34 μ g · ml/1氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒 PYJM26 (PACY-mVaE-mvaS-GPPS2)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。
[0071] 1. 1. 2. 3pYJM27 載體構(gòu)建
[0072] 將 pGH-Pt30 載體與 pYJM26 (pACY-mvaE-mvaS-GPPS2)載體分別用 Bglll 和 Xhol 進(jìn)行雙酶切，載體pACY-mVaE-mvaS-GPPS2與外源片段Pt30按摩爾比1 : 5的比例，4°C連 接過夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，然后涂布加有34μ g · ml/1氯霉 素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pYJM27 (pACY-mvaE-mva S-GPPS2-Pt30)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。
[0073] 1. 1. 2. 4pYJM14 (pTrc-low)載體構(gòu)建
[0074] 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室建立的DNA組裝（Lego DNA assembling)方法構(gòu)建pTrc-low載體： 該方法是一種多個DNA片段在體外通過變性解鏈，退火組裝成重組質(zhì)粒的快速方法，連接 過程中無需任何限制性酶。在構(gòu)建的過程中，通過PCR(simple PCR, overlap extension PCR，long tailed primer PCR)的方法擴(kuò)增出一系列連續(xù)的片段（successive substrate fragments，SFs)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增這些片段時，需要在這些相鄰片段之間存在一段比較長的重疊 部分，將這些片段按等摩爾比例混合后，變性，退火。由于片段和片段之間的重疊區(qū)較長，占 整個片段長度的1/3-2/3,使得變性后的單鏈很容易與相鄰片段形成的單鏈進(jìn)行雜交，最終 形成環(huán)狀，將退火后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，最終可以形成重組質(zhì)粒。pTrc-low載體構(gòu)建過 程如下：
[0075] 分別以pTrchis2B骨架（來自Invitrogen公司）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)基因組為模板，擴(kuò)增出質(zhì)粒pTrchis2B的部分片段SFIBhB，SFB12hB，以及 釀酒酵母MVA途徑的下游4個基因的片段ERG 12 (SF128h 12，SFB12h 12) ;ERG8 (SF128h8， SF819h8) ;ERG19(SF819hl9, SF19IhI) ;IDI(SF19IhI， SFIBhl)，然后以這些片段或 pTrchis2B骨架為模板，通過普通PCR或者重疊 PCR擴(kuò)增出組裝質(zhì)粒的6個SFs片段SF128， SF819, SF19I，SFIB，SFB12, SFB。4 個基因 ERG12, ERG8, ERG19, IDI 之間的 3 個 RBS 序列是 在PCR擴(kuò)增時，通過設(shè)計(jì)引物時引入，使得4個基因由單一的trc(trp-lac promoter)啟動 子作用下進(jìn)行表達(dá)。表1為pTrc-low質(zhì)粒構(gòu)建的過程中片段擴(kuò)增的引物及模板，表2為所 用到的引物序列匯總。
[0076] 表1片段擴(kuò)增的引物與模板
[0077] Table 1PCR templates and primers for fragment construction
[0078]

【權(quán)利要求】
1. 一種生物法合成α-或β-菔烯的方法，所述方法包括下述步驟： Α)構(gòu)建能夠從乙酰輔酶Α合成α-或β-菔烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下述基 因片段：乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶Α合酶、羥甲基戊二酰輔酶Α還 原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異 構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶； B)利用A)中所述重組細(xì)胞在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑誘導(dǎo)， 經(jīng)過分離純化后即可獲得α-或β-菔烯。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶基因來源于： 1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)來源于其它生物體，和乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因沒有明 顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因來 源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)來源于其它生物體，和3-輕-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基 因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因來源 于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)來源于其它生物體，和輕甲基戊二酰輔酶A還原酶基因沒 有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲羥戊酸激酶基因來源于：1)釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae),優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它生 物體，和甲羥戊酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸 序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因來源于：1)釀酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其 它生物體，和甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能 的蛋白的核酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因來源于：1) 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源 于其它生物體，和甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或 相似功能的蛋白的核酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來源于：1)釀酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)，優(yōu)選釀酒酵母，或2)來源于其它細(xì)菌，或3)來源于其它 生物體，和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋 白的核酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源于：1)大腸桿 菌（Escherichia coli)，或2)來源于北美冷杉（Abiesgrandis)，優(yōu)選北美冷杉或3)來源 于其它生物體，和香葉酯二磷酸合成酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功 能的蛋白的核酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述菔烯合酶基因來源于：1)火炬松 (Pinustaeda)，2)北美冷杉（Abiesgrandis)，3)黃花蒿（Artemisia annua)，或 4)來源于 其它生物體，和菔烯合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核 酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟A)所述的重組細(xì)胞通過基因工程技術(shù)將編 碼乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、 甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、 香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶的基因片段轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞構(gòu)建而成，其中所述宿主 細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞。
12. -種能夠從乙酰輔酶A合成α-或β-菔烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下述基 因片段：乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶Α合酶、羥甲基戊二酰輔酶Α還 原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異 構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶和菔烯合酶，其中所述重組細(xì)胞通過基因工程技術(shù)將所述基因 片段轉(zhuǎn)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中而制備。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌 細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/70GK104120148SQ201310156997
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】咸漠, 楊建明, 馮紅茹, 張海波, 劉煒 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所