牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA試劑盒及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA試劑盒及用途，試劑盒采用已滅活的純化BHV-1病毒粒子作為包被抗原,依據(jù)阻斷ELISA原理檢測牛血清中牛傳染性鼻氣管炎病毒的抗體。試劑盒中96孔板中的包被抗原為滅活的純化BHV-1病毒粒子,其具有良好的抗原性。試劑盒包括雜交瘤細(xì)胞株、ELISA板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、終止液、底物顯色液A、底物顯色液B、陽性對照、陰性對照。該試劑盒敏感性強(qiáng)，特異性高，使用方便，易于標(biāo)準(zhǔn)化，尤其適用于大規(guī)模樣品的檢測，可以作為調(diào)查牛傳染性鼻氣管炎流行情況的金標(biāo)準(zhǔn)。與美國IDEXXgE阻斷試劑盒相比，有很高陽性符合率及陰性符合率，可以作為診斷牛傳染性鼻氣管炎的標(biāo)準(zhǔn)方法。
【專利說明】牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷EL ISA試劑盒及用 途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種用于牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢 測的阻斷ELISA試劑盒，還涉及一種用檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA 試劑盒的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 牛傳染性鼻氣管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性 鼻氣管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis viruse，IBRV)即牛 1 型皰疫病毒 (Bovine herpe svirus-l，BHV_l)引起的一種牛呼吸道接觸性傳染病，又稱"壞死性鼻炎"、 "紅鼻病"。
[0003] 牛1型皰疹病毒（BHV-1)是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的成員，它是一種有囊膜 的雙股DNA病毒。BHV-1的病毒粒子為圓球型，成熟的粒子直徑約有150?220nm，主要包 括核心、衣殼被膜和囊膜三部分。其中核心是由病毒的DNA和蛋白質(zhì)相互纏繞而成，而核衣 殼是一個二十面體，它外觀呈六角形，空間上立體對稱。其外表面有162個殼粒，周圍是一 圈帶有脂質(zhì)的囊膜。
[0004] 牛傳染性鼻氣管炎的臨床癥狀分為呼吸道型、生殖道型、流產(chǎn)型、腦炎型和眼炎型 五種。呼吸道型表現(xiàn)為鼻氣管炎，為本病最常見的一種類型；生殖道型表現(xiàn)為母畜外陰陰道 炎，又稱傳染性膿皰性外陰陰道炎，公畜龜頭包皮炎，因此稱傳染性膿皰性龜頭包皮炎；流 產(chǎn)型一般見初胎青年母牛懷孕期的任何階段，也可發(fā)生于經(jīng)產(chǎn)母牛；腦炎型：易發(fā)生于4? 6月齡犢牛；眼炎型表現(xiàn)為結(jié)膜角膜炎，常與呼吸道型合并發(fā)生。IBRV感染后雖然沒有顯示 出很高高的死亡率，但是感染后會造成潛伏感染和終生感染，而且病牛會長期甚至終生都 帶毒，當(dāng)機(jī)體的抵抗力降低時，則又重新激活，向外排毒，使得該病極難根治。
[0005] 該病于1955年被首次發(fā)現(xiàn)，至今幾乎所有的國家均檢出IBR抗體。目前僅在澳大 利亞、丹麥、芬蘭、挪威、瑞典、瑞士根除了該病。我國最早是于20世紀(jì)70年代在進(jìn)口牛群 中發(fā)現(xiàn)該病。20世紀(jì)80年代由周泰沖等在深圳海關(guān)從新西蘭的進(jìn)口奶牛中分離出該病病 毒,之后在1986年由鄧沛霖、1987年由王則興等又從乳牛、水牛、黃牛中分離到此病毒，證 實IBR在我國牛群中確實存在。在本實驗室，2012年由范強(qiáng)等利用乳膠凝集抗體檢測的方 法檢測了從我國內(nèi)蒙古、新疆和江蘇三省采集的521份臨床樣品，陽性率達(dá)到34. 57%。
[0006] 病毒中和試驗（VN)和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)是檢測抗體的常規(guī)方法，歐洲的 實驗室已經(jīng)建立一些阻斷ELISA方法，主要應(yīng)用于牛傳染性鼻氣管炎的流行病學(xué)調(diào)查中。 本發(fā)明制備了牛傳染性鼻氣管炎病毒的單克隆抗體，用辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記該單抗， 建立了阻斷ELISA抗體檢測方法，為牛傳染性鼻氣管炎提供可靠的數(shù)據(jù)支持。
[0007] 目前許多發(fā)達(dá)國家均在推行牛傳染性鼻氣管炎的控制和消滅計劃，其基本做法法 是推廣使用基因缺失疫苗和配套的鑒別診斷試劑盒，一方面通過疫苗免疫降低發(fā)病率和感 染率，另一方面通過鑒別診斷篩選出免疫后的帶毒牛，將帶毒牛進(jìn)行隔離飼養(yǎng)或直接淘汰， 逐步使牛群得到凈化。我國作為養(yǎng)牛大國，牛傳染性鼻氣管炎的危害十分嚴(yán)重，有條件的牛 場應(yīng)當(dāng)借鑒發(fā)達(dá)國家的做法和經(jīng)驗，逐步實施對牛傳染性鼻氣管炎的控制和凈化，提高經(jīng) 濟(jì)效益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種用于牛傳染性鼻氣管炎gB病毒抗體檢測阻斷 ELISA試劑盒，該試劑盒敏感性強(qiáng)，特異性高，使用方便，易于標(biāo)準(zhǔn)化，與美國IDEXX gE阻斷 試劑盒相比，有很高陽性符合率及陰性符合率，可以作為診斷牛傳染性鼻氣管炎的標(biāo)準(zhǔn)方 法。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷 ELISA試劑盒在檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體中的應(yīng)用，該應(yīng)用用于檢測牛血清中有無 牛傳染性鼻氣管炎病毒的抗體出現(xiàn)，即檢測被檢牛是否感染牛傳染性鼻氣管炎病毒，靈敏 性極強(qiáng)，幾乎無假陽性及假陰性出現(xiàn)，尤其適用于大規(guī)模樣品的檢測，可以作為調(diào)查牛傳染 性鼻氣管炎流行情況的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0011] 一種用于牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，試劑盒采用滅活 的純化BHV-1病毒粒子作為包被抗原，依據(jù)阻斷ELISA原理檢測牛血清中牛傳染性鼻氣管 炎病毒的抗體。試劑盒中96孔板中的包被抗原為純化的BHV-1病毒粒子，其具有良好的 抗原性。所述的試劑盒包括由保藏號為CCTCC N0:C201345的雜交瘤細(xì)胞系分泌的抗牛傳 染性鼻氣管炎病毒gB蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)記物。 申請人:于2013年4月3日將該雜交瘤 細(xì)胞株送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC N0 : C201345,分類命名：雜交瘤細(xì)胞株1H3。
[0012] 一種用于牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA試劑盒，其特征在于：雜 交瘤細(xì)胞株、ELISA板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、終止液、底物顯色液A、底物顯色液B、 陽性對照、陰性對照、酶標(biāo)單克隆抗體：所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗牛傳染性鼻氣管炎 病毒gB蛋白單克隆抗體。
[0013] 所述的ELISA板條：每個試劑盒裝有2塊或5塊ELISA微孔板，每塊ELISA板條 為能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為純化的BHV-1病毒粒子,規(guī)格為8 孔X 12條；
[0014] 所述的血清稀釋液：血清稀釋液為即用型；
[0015] 所述的濃縮洗滌液：洗滌液為10倍濃縮，使用前稀釋；
[0016] 所述的底物顯色液A :0· 006%H202緩沖液；
[0017] 所述的底物顯色液B :TMB顯色液；
[0018] 所述的終止液：0. 025%氫氟酸（HF);
[0019] 陽性對照；陰性對照。
[0020] -種辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗牛傳染性鼻氣管炎病毒gB蛋白單克隆抗體，其 制備步驟是：
[0021] 一、建立細(xì)胞系：
[0022] 1.抗原制備：
[0023] MDBK細(xì)胞接種BHV-1野毒，待80%細(xì)胞出現(xiàn)裂解脫落，-78 - -82°C凍融三次，4°C 下，6000rpm離心40min，取上清，于4°C下，25000rpm離心2h，TEN重懸沉淀，利用鹿糖梯度 離心法得到純化的病毒粒子。
[0024] 2.抗原免疫：
[0025] 滅活純化病毒粒子后，免疫6周齡BALB/C小鼠，首次基礎(chǔ)免疫皮下注射抗原 1〇〇 μ g/只，使用完全弗氏佐劑；每隔2周進(jìn)行一次免疫，共三次，皮下注射抗原100 μ g/只 /次，使用不完全弗氏佐劑；融合前3天腹腔注射加強(qiáng)免疫，200 μ g/只，不加佐劑。
[0026] 3.雜交瘤細(xì)胞的制備：
[0027] a)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：
[0028] 空白小鼠1只，眼眶放血，收集陰性血清，75% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）酒精浸泡5min，小鼠固 定，無菌取脾臟，加3ml基本1640研磨，補(bǔ)加基本1640至10ml，靜置2min，吸上層與50ml 離心管備用，再加基本1640至10ml，重復(fù)兩次，lOOOrpm離心lOmin去上清，lOOmlHAT培養(yǎng) 基重懸，37°C備用。
[0029] b)免疫脾細(xì)胞的制備：
[0030] 強(qiáng)化免疫小鼠，眼眶放血收集陽性血清，75% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))酒精浸泡5min，小鼠固定， 無菌取脾臟，加3ml基本1640研磨，補(bǔ)加基本1640至10ml，靜置2min，吸上層與50ml離心 管備用，再加基
[0031] c)骨髓瘤細(xì)胞的制備：
[0032] 拉頸處死，75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酒精浸泡5min，小鼠固定，無菌取腫瘤，置勻漿器，加5ml 基本1640研磨，補(bǔ)加基本1640至10ml，靜置2min，吸上層與50ml離心管備用，再加基本 1640至10ml，重復(fù)兩次，lOOOrpm離心lOmin去上清，基本1640重懸骨髓瘤細(xì)胞，總體積達(dá) 20ml，另一 50ml離心管加20ml淋巴細(xì)胞分離液，將骨髓瘤細(xì)胞懸液輕輕地沿管壁加在分離 液之上，lOOOrpm離心lOmin，吸位于界面致密的白色細(xì)胞層(可適當(dāng)吸取上層培養(yǎng)基)，補(bǔ)加 適量基本1640, lOOOrpm離心lOmin，棄上清，加10ml基本1640重懸，計數(shù)后4°C備用。
[0033] d)細(xì)胞融合及HAT選擇雜交瘤：
[0034] 骨髓瘤細(xì)胞（1-2*107)與免疫細(xì)胞（1*108)于50ml離心管混勻，lOOOrpm離心 lOmin，倒空上清(滅菌濾紙吸干至沉淀處)，輕敲管底，使細(xì)胞沉淀略加松動，37°C水浴中， lmi η內(nèi)慢慢滴入預(yù)溫至37度的50%PEG0. 8ml，邊加邊用吸管攪拌，繼續(xù)攪拌30s后靜置lm in，慢慢加入37°C預(yù)溫的基礎(chǔ)164040ml (提前裝入離心管)，具體方法如下（37°C水浴中完 成):第lmin逐滴滴入lml，第2min加lml，第3-4min加3ml，第5min加5ml，每次加時需緩 慢加入，并不斷輕輕攪拌，最后緩慢加入基礎(chǔ)1640,補(bǔ)足40ml，總時間為lOmin，1000rp m離 心lOmin去上清，重懸有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基重懸，分種于4塊96孔板，37°C，5%C02培養(yǎng) 箱培養(yǎng)。
[0035] 雜交瘤細(xì)胞融合兩周后，按照常規(guī)免疫酶技術(shù)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選，篩選出能 分泌針對牛傳染性鼻氣管病毒抗體的融合細(xì)胞。
[0036] 4.雜交瘤細(xì)胞的克隆化和凍存：
[0037] a)雜交瘤細(xì)胞的克?。?br> [0038] (1)制備飼養(yǎng)層：按照2. 2. 4. 2制備飼養(yǎng)細(xì)胞，18-20ml完全1640培養(yǎng)基重懸脾細(xì) 胞，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0039] (2)吸管吹打雜交瘤細(xì)胞使其懸浮于培養(yǎng)基中，取樣、計數(shù)，調(diào)整濃度至50、20、10/ ml，采用有限稀釋法，具體步驟為：
[0040] ①完全1640培養(yǎng)基稀釋計數(shù)后細(xì)胞使其濃度為103cells/ml，該細(xì)胞懸液視為A 液；
[0041] ②取A液0. 2ml于3. 8ml完全640培養(yǎng)基中，其濃度為50cellS/ml，該細(xì)胞懸液視 為B液；
[0042] ③取B液1. 6ml于2. 4ml完全640培養(yǎng)基中，其濃度為2〇cells/ml，該細(xì)胞懸液視 為C液；
[0043] ④取C液2ml于2ml完全640培養(yǎng)基中，其濃度為lOcells/ml，該細(xì)胞懸液視為D 液；
[0044] (3)分別將上述B、C、D雜交瘤細(xì)胞懸液接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔 ΙΟΟμ 1，使每孔分別為5、2、1個細(xì)胞，每個稀釋度做兩列。
[0045] (4)置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3天后半量換液或補(bǔ)液，7天后細(xì)胞上清效價。
[0046] (5)選取0D63tol較高的再次克隆，一般進(jìn)行3次克隆，至雜交瘤細(xì)胞呈單克隆生長， 并且細(xì)胞上清效價較高。
[0047] b)雜交瘤細(xì)胞的凍存：
[0048] 細(xì)胞凍存液：含10% (體積比）二甲基亞砜的胎牛血清。
[0049] 將24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞株，在細(xì)胞對數(shù)生長期時，收集細(xì)胞懸液，lOOOrpm離 心lOmin，棄去細(xì)胞上清，用適量細(xì)胞凍存液重懸，混勻后分裝于細(xì)胞凍存管中，lml/管，依 次4°C 30min、-20°C 2h、-80°C過夜，次日移入液氮罐中進(jìn)行凍存。
[0050] 二、單克隆抗體的制備：
[0051] 本發(fā)明中，大量生產(chǎn)單克隆抗體的方案為小鼠腹水法。
[0052] 方法為：將小鼠提前五天腹腔注射弗氏不完全佐劑500 μ 1/只，然后將陽性細(xì) 胞的上清收集于離心管中，細(xì)胞用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基從孔壁上吹打下來，吸入15ml離心管 中，lOOOrpm離心lOmin，然后再用1640基礎(chǔ)液重懸，洗兩次，最后用適量的1640基礎(chǔ)液 重懸，小鼠腹腔注射500 μ 1/只。9至10天后，小鼠腹部明顯變大，酒精棉在小鼠腹部消 毒，用l〇ml注射器針頭插入小鼠腹部，同時用15ml離心管收集從針頭中自動流出的腹水。 1500rpm離心lOmin，去除細(xì)胞，將上清收集于另一個15ml離心管中，凍存于-20°C冰箱中。
[0053] 三、單克隆抗體純化及辣根過氧化酶標(biāo)記：
[0054] L單克隆抗體的純化：
[0055] 上述獲得的腹水單抗的純化方案為辛酸一硫酸銨沉淀法。
[0056] 步驟為：將收集的腹水12000rpm離心5分鐘，取上清X ml ;加入4x ml的醋酸緩 沖液；每X ml上述腹水加辛酸33ul，邊加邊攪拌(慢）；加完后繼續(xù)攪拌30min，然后在4°C 下12000rpm離心30min ;上清用濾紙進(jìn)行過濾，收集的上清調(diào)PH7. 4 45%SAS沉淀一次， 攪拌30min后4°C沉淀過夜；4°C下12000rpm離心30min，去上清，用10mM Tris (ρΗ9· 0)重 懸沉淀，再用10mM Tris (ρΗ9. 0)透析3天，每天換一次透析液；吸出分裝，lml每管，-2(TC 保存。
[0057] 純化后的單克隆抗體辣根過氧化酶標(biāo)記的制備方案為改良過碘酸鈉法。
[0058] 步驟為：取 5mg HRP 溶于 0· 5mL 蒸餾水；加入 0· 5mL0. 06mol/L NaI04,4°C輕攪 30min，溶液呈黃綠色；加入0. 5mL0. 16mol/L乙二醇，室溫避光輕攪作用30min，終止氧化反 應(yīng)；加入5mg抗體（IgG)，裝入透析袋，置0· 05mol/L，pH9. 6碳酸鹽緩沖液1000mL中，4°C透 析過夜，更換3次；取出透析袋中液體，加入5mg/mL NaHB40. 2mL4°C 2h或過夜；加等體積飽 和硫酸銨溶液沉淀結(jié)合物，置4°C 30min后，3000rpm離心15min，棄上清；將沉淀物溶于PBS (0. 02M pH7. 4)中，裝入透析袋，并以此緩沖液透析平衡6-12h，換液3次；透析后吸出液體 分裝于-20°C保存。
[0059] 將制備抗牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行保藏， 申請人:于 2013年4月1日將該雜交瘤細(xì)胞株送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址：中國武漢武 漢大學(xué)，保藏編號CCTCC NO :C201345,分類命名：雜交瘤細(xì)胞株1H3。
[0060] 四、單克隆抗體抗原表位的鑒定
[0061] 1.免疫沉淀
[0062] ⑴取 200 μ 1 純化 BHV-1 病毒粒子，加入 133 μ 1 Extraction buffer (含有 PMSF 和Aptot inin)，充分混勻溶解。
[0063] ⑵將上述溶液于_80°C凍存4h以上。
[0064] ⑶取出并迅速解凍，加入25%Triton-1003. 3 μ 1，冰水放置30min后重懸。
[0065] ⑷加入約1 μ g空白小鼠血清和20 μ 1 Protein A+G Agarose,4°C下震搖4h。
[0066] (5) 2500rpm 離心 5min，取上清共 300 μ 1，分裝 150 μ 1/ 管。
[0067] (6)兩管分別加入約2 μ g單克隆抗體1Η3,4°C下震搖過夜。
[0068] (7)加入 40 μ 1 Protein A+G Agarose，4°C下震搖 3h。
[0069] (8) 2500rpm 離心 5min，棄上清。
[0070] ⑶PBS洗沉淀5次。
[0071] (10) 40 μ 11 X SDS-PAGE sample buffer 重懸沉淀，瞬時高速離心。
[0072] (11) 95°C 下處理 5min。
[0073] (12)進(jìn)行 SDS-PAGE 與 Western blot。
[0074] 2.質(zhì)譜鑒定
[0075] 將SDS-PAGE膠圖（附圖2Α)中與Western blot (附圖2Β)對應(yīng)的蛋白膠上的條 帶切下，送武漢言行生物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果與Western blot結(jié)果均顯示單克隆抗體 1H3針對牛傳染性鼻氣管炎病毒gB蛋白。
[0076] -種用于牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA試劑盒在檢測牛傳染性 鼻氣管炎病毒抗體中的應(yīng)用。其應(yīng)用過程是：
[0077] 1.本發(fā)明試劑盒的檢測原理：
[0078] 采用阻斷法，將滅活的純化BHV-1病毒粒子包被于微孔板中，然后用1%BSA將酶 標(biāo)板封閉，加入待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)陽性對照、陰性對照，37°C孵育后加入酶標(biāo)單克隆抗體，繼 續(xù)在37°C下孵育后，加入辣根過氧化物酶底物顯色，終止液終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀在630nm 波長下，測定各孔吸光度值，0D值的大?。ńK止顯色反應(yīng)后顏色的深淺）與待測樣本中牛 傳染性鼻氣管炎病毒抗體的含量成反比。
[0079] 2.本發(fā)明試劑盒的組成：
[0080] a)酶標(biāo)板的最佳制備方法：
[0081] 用pH9. 60. 05M的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，將上述制備的純化BHV-1病毒 粒子稀釋成4 μ g/ml，按100 μ 1/孔加入微孔板中，包被過夜，次日，棄去包被液，按200ul/ 孔加入1%BSA的封閉液，37°C靜置2小時，洗滌甩干后裝入包裝袋，加入干燥劑，真空保存。
[0082] b)工作試劑的配置：
[0083] 洗滌液（ρΗ7· 4,0· 15M PBS) :ΚΗ2Ρ040· 2g，Na2HP04-12H202. 9g，NaC18. 0g，KC10. 2g， Tween-20 (0. 1%) lml，加蒸饋水至1000ml，濃縮成10倍作為存儲液。
[0084] 血清稀釋液：牛血清白蛋白0. lg，加洗滌緩沖液至100ml。
[0085] 底物緩沖液：pH5. 0磷酸鹽檸檬酸緩沖液，0. 2M Na2HP0425. 7ml，0. 1M檸檬酸 24. 3ml,加蒸饋水50ml。
[0086] 底物顯色液A :0· 006%H202緩沖液；
[0087] 底物顯色液B :取Na2HP04 · 12H2014. 2g，檸檬酸10. 5g,用ddH20定容至500m配成 0. lmL磷酸鹽檸檬酸緩沖液，pH5. 0,按終濃度為20mg/L添加聯(lián)苯二胺；
[0088] 終止液：0· 025% 氫氟酸（HF) ;HF(40%)625 μ L，用 ddH20 定容至 100mL。
[0089] c)標(biāo)準(zhǔn)BHV-1陽性血清及標(biāo)準(zhǔn)BHV-1陰性血清的制備：
[0090] 在ELISA檢測過程中不同的操作人員和不同的檢測批次間會存在一定的誤差，操 作誤差會導(dǎo)致檢測樣品0D值的誤差。本發(fā)明研制了標(biāo)準(zhǔn)BHV-1抗體陽性對照血清和標(biāo)準(zhǔn) BHV-1抗體陰性對照血清，用于檢測條件的優(yōu)化和檢測結(jié)果的判定。
[0091] 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的制備：
[0092] 選用健康成年牛，免疫前經(jīng)檢測為牛傳染性鼻氣管炎抗體陰性后，隔離觀察7日。 將牛傳染性鼻氣管炎病毒懸液滅活后，加入等量的佐劑乳化后作為免疫原。通過頸部肌肉 注射途徑分3次接種免疫原，每次間隔21日，末次免疫后7?10日采血檢測。采血并分離 血清，用待檢血清進(jìn)行ELISA試驗檢測抗體。取備用血清經(jīng)56°C滅活30分鐘后用樣品稀釋 液適當(dāng)稀釋，按血清量的〇. 01 %加入硫柳汞，〇. 45 μ m濾膜過濾除菌。無菌分裝，每管lml， 4°C貯存。
[0093] 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的制備：
[0094] 選用健康成年牛，經(jīng)檢測為牛傳染性鼻氣管炎陰性抗體陰性，隔離觀察7日后，采 取頸部動脈采血方式，無菌采集血液，離心并分離血清備用（2?8°C保存，有效期為12個 月）。取備用血清經(jīng)56°C滅活30分鐘后用樣品稀釋液適當(dāng)稀釋，按血清量的0. 01 %加入硫 柳汞，0. 45 μ m濾膜過濾除菌，無菌分裝，每管lml，4°C貯存。
[0095] d)檢測牛傳染性鼻氣管炎的阻斷ELISA試劑盒的組建：
[0096] 組建牛傳染性鼻氣管炎的酶聯(lián)免疫試劑盒，包含以下組分：
[0097] 96孔酶標(biāo)板；辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗；標(biāo)準(zhǔn)陽性對照；標(biāo)準(zhǔn)陰性對照；濃縮洗 滌液；
[0098] 血清稀釋液；終止液。
[0099] 3.本發(fā)明試劑盒的檢測方法
[0100] a)用上述制備的試劑盒進(jìn)行檢測：
[0101] 1)將待測血清、陽性對照及陰性對照用抗體稀釋液按比例稀釋，每孔?〇〇μ 1，加 入酶標(biāo)板，37°C孵育1小時；
[0102] 2)洗滌液清洗3-5次；
[0103] 3)每孔加入稀釋后的酶標(biāo)單克隆抗體100μ 1，37°C孵育lh;
[0104] 4)洗漆液清洗3_5次；
[0105] 5)每孔加入底物A、B各50μ 1，37°C孵育15min ;
[0106] 6)每孔加入終止液50 μ 1 ;
[0107] 7)酶標(biāo)儀檢測630nm吸光度值。
[0108] b)檢測結(jié)果分析：
[0109] 1.測中陰性對照血清（NC)的0D值與陽性對照血清（PC)的0D值差值至少為0. 4 即NC-PC蘭0· 4,檢測被認(rèn)為有效。
[0110] S=樣品孔0D630值，N=陰性對照孔0D630值。
[0111] 如果S/N比值彡0. 6,樣品判定為BHV-1抗體陽性。
[0112] 如果S/N比值彡(λ 7但XX 6,樣品重測。
[0113] 如果S/N比值>0. 7,樣品判定為BHV-1抗體陰性。
[0114] 2.檢測時陽性及陰性對照使用復(fù)孔，最終使用0D值為兩個的平均值。
[0115] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0116] 現(xiàn)有技術(shù)有乳膠凝集和中和試驗等，乳膠凝集雖然操作簡便但敏感性很低，假陰 性率很高，中和試驗操作繁瑣，對技術(shù)人員的實驗操作能力要求高，不易于大規(guī)模樣品的 檢測。而本發(fā)明敏感性強(qiáng)，特異性高，使用方便，易于標(biāo)準(zhǔn)化，建立了一種準(zhǔn)確、快速、安全 性好、能夠進(jìn)行大量篩查牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體檢測的方法，并且該試劑盒與美國 IDEXX試劑盒有很高的符合率，陽性符合率為96. 12%，陰性符合率為100%，總符合率為 97. 57%，幾乎無假陽性與假陰性出現(xiàn)，為動物檢驗檢疫部門提供了一套實用性強(qiáng)，效果可靠 的診斷試劑盒產(chǎn)品。下表為所建立試劑盒與美國IDEXX試劑盒的比對結(jié)果即敏感性試驗結(jié) 果：
[0117]

【權(quán)利要求】
1. 一種牛傳染性鼻氣管炎病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于：雜交瘤細(xì)胞能 分泌針對BHV-1 gB蛋白的抗體，雜交瘤細(xì)胞株為1H3，CCTCC N0:C201345。
2. -種檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體的阻斷ELISA試劑盒，其特征在于：雜交瘤細(xì) 胞株、ELISA板條、血清稀釋液和濃縮洗滌液、終止液、底物顯色液A、底物顯色液B、陽性對 照、陰性對照、酶標(biāo)單克隆抗體：所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗牛傳染性鼻氣管炎病毒 gB蛋白的單克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA試劑盒， 其特征在于：所述的ELISA板條：每個試劑盒裝有2塊或5塊ELISA微孔板，每塊ELISA板 條為能自行拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板，包被抗原為滅活的純化BHV-1病毒粒子； 所述的血清稀釋液：血清稀釋液為即用型； 所述的濃縮洗滌液：洗滌液為10倍濃縮，使用前稀釋； 所述的底物顯色液A :0. 006%H202緩沖液； 所述的底物顯色液B :TMB顯色液； 所述的終止液：〇. 025%氫氟酸。
4. 權(quán)利要求2所述的一種牛傳染性鼻氣管炎病毒gB抗體檢測阻斷ELISA試劑盒在檢 測牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/91GK104120109SQ201310153641
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】劉正飛, 王單晶, 范強(qiáng) 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)