專利名稱：一種分步酶解羊乳酪蛋白制備ace抑制肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分步酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法。
背景技術(shù)：
高血壓是最常見的心血管疾病之一，常引起心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中冠心病的主要危險(xiǎn)因素。高血壓是指在未使用降壓藥物的情況下，收縮壓> HOmmHg和(或)舒張壓彡90mmHg的情形。據(jù)國(guó)家高血壓研究中心最新統(tǒng)計(jì)，我國(guó)高血壓患者已達(dá)1.2億人，發(fā)病率為10.8%，其危害程度僅次于腫瘤，已成為危害人類健康的第二號(hào)殺手。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，至2020年，非傳染性疾病將占我國(guó)死亡原因的79%，其中心血管病將占首位。每降低5mmHg收縮壓，患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)就降低16%。目前，常用于抗高血壓藥物治療的主要有6種降壓藥物，分別是利尿劑、α-受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑和α -腎上腺素受體阻滯劑。這些降血壓藥物雖然有顯著的降壓效果，但卻存在一定的毒副作用，如咳嗽、過(guò)敏性血管水腫及腎功能不全加重等。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin - eonverting enzyme, ACE)在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用，經(jīng)碳端兩個(gè)氨基酸(His-Leu)的切除，能夠把原本無(wú)活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘难芫o張素II，引起血管收縮，使血壓上升；ACE還會(huì)使具有血管舒張功能的舒緩激膚失活，同樣又引起血壓上升的情形，ACE抑制膚能夠阻斷ACE引起的兩種生化反應(yīng)過(guò)程，起降血壓作用。ACE的制備方法主要有5種:化學(xué)降解法、酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和基因工程法，現(xiàn)在研究最多的是酶解法和微生物發(fā)酵法。相對(duì)于微生物發(fā)酵法，酶法反應(yīng)快速，制備ACE抑制肽抑制活性高，且原料廣泛，主要有乳類蛋白、植物類蛋白及動(dòng)物類蛋白，但目前乳源ACE抑制肽主要是以牛乳為原料，對(duì)羊乳尚未涉及到。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種分步酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，酪蛋白經(jīng)過(guò)超聲波處理，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，再通過(guò)復(fù)合酶解的方法使水解反應(yīng)更徹底，更迅速。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種分布酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，包括以下步驟:步驟1:將復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪，得到脫脂乳； 步驟2:將所得脫脂乳在35_75°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為0-1600rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的pH值為4.2-5.0,再使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min將酪蛋白進(jìn)行沉淀,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_40°C下預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在-55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定酪蛋白得率；步驟3:將所得酪蛋白凍干粉與純凈水混合，制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用180w的超聲波預(yù)處理60min ；步驟4:從所得酪蛋白溶液中取出100ml，在45_65°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入lmol/1的NaOH溶液，使酪蛋白溶液的pH值為6.5-8.5 ;按照酶與底物質(zhì)量比為2_10:100的比例，加入堿性酶Alcalase,水解l_3h時(shí)；水解過(guò)程中，每間隔0.5h取5ml水解液,在900C的恒溫水浴箱中保持lOmin，使堿性酶Alcalase失活，然后使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性；步驟5:將所得上清液吸取50ml，在35_55°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入Imol/I的NaOH溶液，使該溶液的pH值為7.0-9.0，再分別加入質(zhì)量比為1: 1、1: 2、2: 1、4:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶與底物質(zhì)量比為2-10:100，水解5h ;水解過(guò)程中，每間隔Ih取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持lOmin，使堿性酶Alcalase失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性，并對(duì)上清液·進(jìn)行冷凍干燥，得到ACE抑制肽。所述復(fù)原羊乳為羊奶粉與純凈水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解所得到的溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明采用分布酶解的方法對(duì)酪蛋白進(jìn)行水解，首先Alcalase酶作用于超聲波處理過(guò)的酪蛋白，得到含高活性ACE抑制肽的水解液，用中性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)水解液再次水解，使未水解完全的酪蛋白徹底水解。不同酶在不同時(shí)間段對(duì)酪蛋白作用于不同的部位，生成的ACE抑制肽種類更多，片段更小，有利于小分子肽的分離純化。本發(fā)明制備的ACE抑制肽產(chǎn)品其抑制比例能夠達(dá)到90%以上。將其作為功能因子添加到各類食品中，對(duì)高血壓患者具有降壓作用，而且性質(zhì)溫和并對(duì)正常血壓的人無(wú)作用，它還具有免疫活性、促進(jìn)消化吸收并具有減肥等多種功效。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。一種分布酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，包括以下步驟:步驟1:將復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪，得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在35_75°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為0-1600rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的pH值為4.2-5.0,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min將酪蛋白進(jìn)行沉淀,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_40°C預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在-55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定酪蛋白得率；所述脫脂乳在溫度為45°C，pH值為4.5，攪拌強(qiáng)度為800rpm的條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%。步驟3:將所得酪蛋白凍干粉與純凈水混合，制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用180w的超聲波預(yù)處理60min ；步驟4:從所得酪蛋白溶液中取出100ml，在45_65°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入lmol/1的NaOH溶液，使酪蛋白溶液的pH值為6.5-8.5 ;按照酶與底物質(zhì)量比為2_10:100的比例(酶用量[E] / [S] =2%-10%)，加入堿性酶Alcalase，水解l_3h時(shí)；水解過(guò)程中，每間隔
0.5h取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持lOmin，使堿性酶Alcalase失活，然后使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性；在八1(^1&%酶用量為[E]/[S]=6%，溫度為50°C、pH值為
8.0、水解時(shí)間2.5h的條件下，ACE抑制率達(dá)到最大，為88.32%。步驟5:將所得上清液吸取50ml，在35_55°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入Imol/I的NaOH溶液，使該溶液的pH值為7.0-9.0，分別加入質(zhì)量比為1: 1、1: 2、2: 1、4:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶與底物質(zhì)量比為2-10:100 (酶總用量[E]/[S]=2%-10%)，水解5h ;水解過(guò)程中，每間隔Ih取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持lOmin，使堿性酶Alcalase失活,使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min,除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性，并對(duì)上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到ACE抑制肽。在中性蛋白酶和胰蛋白酶的質(zhì)量比為1:1、總用量為間/[5]=4%，溫度為401:、？!1值為7.5，水解時(shí)間為Ih的條件下，ACE抑制率達(dá)到最大，為92.14%。所述復(fù)原羊 乳為羊奶粉與純凈水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解所得到的溶液。實(shí)施例一步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在35 V的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的pH值為4.6，酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_40°C預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉；當(dāng)脫脂乳在溫度為35°C，pH值為4.6，攪拌強(qiáng)度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到9.23%。實(shí)施例二步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，得到的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在45°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的PH達(dá)到4.5，使酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_40°C預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉；當(dāng)脫脂乳在45°C，pH為4.5，攪拌強(qiáng)度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%。步驟3:將所得酪蛋白凍干粉與純凈水混合，制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用180w的超聲波預(yù)處理60min ；步驟4:從所得酪蛋白溶液中取出100ml，在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入lmol/1的NaOH溶液，使酪蛋白溶液的pH值為6.5 ;按照酶與底物質(zhì)量比為4:100的比例(酶用量[E]/[S]=4%)，加入堿性酶Alcalase，水解2h時(shí)；取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持IOmin,使堿性酶Alcalase失活,然后使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性為82.35%。實(shí)施例三步驟1:將羊奶粉與水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解，得到的的復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪,得到脫脂乳；步驟2:將所得脫脂乳在45°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為800rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的pH值為4.5，酪蛋白進(jìn)行沉淀，使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_40°C預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在_55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉；當(dāng)脫脂乳在溫度為45°C，pH值為4.5，攪拌強(qiáng)度為SOOrpm條件下，酪蛋白得率最大，達(dá)到11.88%。步驟3:將所得酪蛋白凍干粉與純凈水混合，制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用180w的超聲波預(yù)處理60min ；步驟4:從所得酪蛋白溶液中取出100ml，在45_65°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入lmol/1的NaOH溶液，使酪蛋白溶液的pH值為8.0 ;按照酶與底物質(zhì)量比為6:100的比例(酶用量[E]/[S] =6%)，加入堿性酶Alcalase，水解2.5h時(shí)；取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持IOmin,使堿性酶Alcalase失活,然后使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性為88.32%。步驟5:將所得上清液吸取50ml，在40°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入Imol/I的NaOH溶液，使該溶液的pH值 為7.5，加入質(zhì)量比為1:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶與底物質(zhì)量比為4:100 (酶用量[E]/[S]=4%)，水解Ih ;取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持IOmin,使堿性酶Alcalase失活,使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性為
92.14%。上述具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述了本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種分布酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟1:將復(fù)原羊乳冷卻到4°C,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min后，除去脂肪，得到脫脂乳； 步驟2:將所得脫脂乳在35-75°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱攪拌器進(jìn)行攪拌，攪拌速度為0-1600rpm，邊攪拌邊滴加HCl溶液，使脫脂乳溶液的pH值為4.2-5.0,使用高速離心機(jī)在6400rpm下離心15min將酪蛋白進(jìn)行沉淀,棄去上清液,將沉淀的酪蛋白進(jìn)行冷凍干燥，在溫度為_40°C預(yù)凍12h，再轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機(jī)在-55°C下冷凍干燥24h，得到酪蛋白凍干粉，測(cè)定酪蛋白得率； 步驟3:將所得酪蛋白凍干粉與純凈水混合，制成質(zhì)量濃度為10%的酪蛋白溶液，用180w的超聲波預(yù)處理60min。
步驟4:從所得酪蛋白溶液中取出100ml，在45-65°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入lmol/1的NaOH溶液，使酪蛋白溶液的pH值為6.5-8.5 ;按照酶與底物質(zhì)量比為2_10:100的比例，加入堿性酶Alcalase，水解l_3h時(shí)；水解過(guò)程中，每間隔0.5h取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持IOmin,使堿性酶Alcalase失活,然后使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性； 步驟5:將所得上清液吸取50ml，在35-55°C的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，滴入lmol/1的NaOH溶液，使該溶液的pH值為7.0-9.0，分別加入質(zhì)量比為1: 1、1:2、2:1、4:1的中性蛋白酶和胰蛋白酶，所用的酶與底物質(zhì)量比為2-10:100，水解5h ;水解過(guò)程中，每間隔Ih取5ml水解液，在90°C的恒溫水浴箱中保持lOmin，使堿性酶Alcalase失活，使用高速離心機(jī)在9000rpm的條件下離心20min，除去未水解的酪蛋白，收集上清液并采用紫外分光光度法測(cè)定ACE抑制活性，并對(duì)上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到ACE抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分布酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于:所述復(fù)原羊乳為羊奶粉與純凈水按照質(zhì)量比例1:9進(jìn)行混合溶解所得到的溶液。
全文摘要
一種分布酶解羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽的方法，將復(fù)原羊乳冷卻離心去脂，得到脫脂乳，脫脂乳用等電點(diǎn)沉淀法制備酪蛋白，酪蛋白先用Alcalase進(jìn)行水解，通過(guò)水解條件的優(yōu)化得到含ACE抑制肽的水解液，并以此為底物，通過(guò)中性蛋白酶和胰蛋白酶水解條件的優(yōu)化，獲得具有高ACE抑制活性的小分子肽；本方法制備的ACE抑制肽產(chǎn)品的抑制比例能夠達(dá)到90%以上，具有ACE抑制肽種類多、片段小，有利于小分子肽的分離純化，且抑制比例高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/06GK103215332SQ20131013233
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者陳合, 王娟, 舒國(guó)偉 申請(qǐng)人:陜西科技大學(xué)