專利名稱：一種巨龍竹不同類型種源分子標記鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種種源鑒定方法，具體涉及一種基于SSR分子標記鑒定巨龍竹桿型的方法。
背景技術(shù)：
巨龍Xs^Dendrocalamus sinicus Chia et J.L.Sun)是世界上目前已知最高大的竹種，特有分布于滇南、滇西南的局部區(qū)域，具有較高的經(jīng)濟價值。巨龍竹種質(zhì)資源分為桿形特征基本穩(wěn)定2個明顯不同的變異類型，即竹桿彎曲、歪扭，竹節(jié)變形、縮短的彎曲型巨龍竹和節(jié)間正常、節(jié)部平滑，竹桿通直、分枝高而少的通直型巨龍竹。造成巨龍竹桿形差異的原因，主要是遺傳因素(杜凡等，巨龍竹的變異類型及其引種區(qū)劃的研究，2001，竹子研究匯刊，20 (1):19-21)。分子標記是以個體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反應。目前，分子標記技術(shù)已成為揭示植物種內(nèi)遺傳變異廣泛應用的技術(shù)。簡單序列重復(singlesequence repeat)簡稱 SSR 或微衛(wèi)星(microsatellite)序列，大量地存在于大多數(shù)真核生物及部分原核生物基因組的非編碼區(qū)和編碼區(qū)中，由串聯(lián)的1-6個核苷酸重復片段構(gòu)成，長度一般在IOObp以下，具有長度的可變性。簡單重復序列分布于巨龍竹整個基因組的不同位置上，不同表現(xiàn)型個體間每個位點上重復單位數(shù)目及序列可能不同，因而形成片段長度多態(tài)性。由于每個簡單重復序列的兩端的序列是高度保守的單拷貝序列，因而可根據(jù)其兩端的序列設(shè)計雙向引物。通直型巨龍竹桿形特征是竹材工業(yè)化利用的優(yōu)良指標，而彎曲型則不宜工業(yè)化利用。由于巨龍竹生長范圍狹窄，當前有關(guān)巨龍竹的研究手段和方法相對落后。目前，還沒有公開文獻資料發(fā)表關(guān)于巨龍竹種源鑒定的方法。因此，發(fā)明一種可以鑒定遺傳穩(wěn)定的通直型優(yōu)良種源的方法是當前巨龍竹推廣栽培所急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種能快速、準確的鑒定巨龍竹種源類型的SSR分子標記方法。為實現(xiàn)本上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案，包括以下步驟。(I)SSR引物篩選:從發(fā)明人前期設(shè)計的115對巨龍竹SSR引物中篩選特異性引物。(2)選取擬鑒定的巨龍竹樣品葉片，采用改進的CTAB法提取總DNA。(3)用篩選出的引物分別對樣品DNA模板進行PCR擴增。(4)檢測PCR擴增產(chǎn)物的有效性和特異性。(5)用擴增效果良好的PCR產(chǎn)物上毛細管電泳，檢測等位基因類型。(6)根據(jù)巨龍竹的基因型與桿型的相關(guān)性，確定樣品的桿型。

上述方法，步驟(I)所述的特異性引物的要求是，等位基因類型在通直型和彎曲型個體之間有顯著多態(tài)性，即等位基因類型不同時為純合子或雜合子，特異性好，沒有明顯雜峰。篩選出的5對SSR特異性引物，其核苷酸序列如下表I。
權(quán)利要求
1.一種巨龍竹桿型的SSR分子標記鑒定方法，包括以下步驟:SSR引物篩選，篩選5對特異性引物；選取擬鑒定的巨龍竹樣品葉片，采用改進的CTAB發(fā)提取總DNA ;分別用每一對引物對樣品DNA模板進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，檢測產(chǎn)物的有效性、特異性；用擴增效果良好的PCR產(chǎn)物上毛細管電泳，檢測等位基因類型；根據(jù)巨龍竹的基因型與桿型的相關(guān)性，確定樣品的桿型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的篩選SSR引物要求是，等位基因類型在通直型和彎曲型個體之間有顯著多態(tài)性，即等位基因類型不同時為純合子或雜合子，特異性好，沒有明顯雜峰。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的SSR引物是從發(fā)明人根據(jù)巨龍竹序列設(shè)計115對SSR引物中篩選得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，進行PCR擴增時，采用下述擴增體系:20μ I 體系，10μ 12XTaq PCR MasterMix，正反引物(5ng/μ I)各 0.32μ 1，DNA (50 ng/ μ I) 0.6 μ 1，補足 ddH20 至 20 μ I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，進行PCR擴增時，采用下述擴增程序:94°C預變性3min ;94°C變性30s，引物退火溫度退火40s，72°C延伸50s，運行35個循環(huán)；72°C延伸7min，4°C低溫保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的PCR擴增產(chǎn)物進行的電泳檢測采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述的毛細管電泳采用QIAxcel毛細管電泳系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:篩選得到的SSR特異性引物，其核苷酸序列如下表。
引物核蕾酸序列 Fr GTCAGGiGGCACMCAAMT DenOOSR: GACCTCTGCTTTCGCATAAF: MACAAAGCCAGTACTCACA Den007R: CTAACCCTGAGCGTGACCAC Fr ATCTAGGTGGTATGAACAAT Den036P.: CGTATGTATTTGTGTATCGG F; TCTGCTITTCTCTCTTGATT DenOSSR: GCTTTCATTTACTGCCCTCT'F; AGAAGAAGGGAACTCACAM Den096P.:1TGTCTTTTTTCGGGGATTC
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述每對引物采用退火溫度分別為:Den006，61°C ；Den007, 61°C ；Den036, 50°C ；Den058, 48°C ；Den096, 52°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(6)中，各對引物等位基因類型和巨龍竹桿型的對應關(guān)系如下表。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種巨龍竹稈型SSR分子標記鑒定方法。主要包括篩選SSR引物，從115對巨龍竹SSR引物中篩選出在不同稈型間多態(tài)性良好的引物，用于巨龍竹稈型鑒定；用改進的CTAB法提取樣品DNA；用篩選出的引物對樣品DNA模板進行PCR擴增；對擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；將有效性和特異性好的擴增產(chǎn)物上毛細管電泳讀出其等位基因類型；根據(jù)巨龍竹的基因型與稈型的相關(guān)性，進行準確的稈型鑒定。本發(fā)明還公開了對本方法的可靠性驗證。本發(fā)明提供的鑒定巨龍竹稈型的SSR分子標記方法穩(wěn)定可靠，不受巨龍竹生長環(huán)境的影響，可以簡便、快速、準確、高通量地應用于巨龍竹通直型優(yōu)質(zhì)種源的鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK103233066SQ20131013132
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月17日
發(fā)明者楊漢奇, 董禹然 申請人:楊漢奇, 董禹然