一種常見染色體數(shù)目異常診斷質(zhì)控細胞株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種醫(yī)學診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常診斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其主要特征是取因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的貼壁生長活細胞，以轉(zhuǎn)基因?qū)虢鑄4DNA連接酶連接同時經(jīng)BamHI酶切的pcDNA3.1(-)DNA和SV40LTag?DNA所構(gòu)建的SV40LTag-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒，使之與細胞DNA整合，G418篩選整合有重組子的細胞株，作傳代擴增、凍存，再提取這些染色體數(shù)目異常細胞株，按質(zhì)控所需比例混合，使原先每例細胞株僅有單一染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)楹幸欢ū壤?種染色體異常的嵌合體質(zhì)控細胞株，增加了鑒別診斷、嵌合體診斷的難度，備作常見染色體數(shù)目診斷的質(zhì)控細胞株，標本易得且將廢棄的多余細胞轉(zhuǎn)化為有效的永生化質(zhì)控細胞。
【專利說明】一種常見染色體數(shù)目異常診斷質(zhì)控細胞株及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種常見染色體數(shù)目異常診斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，主要應(yīng)用于 醫(yī)學領(lǐng)域的產(chǎn)前診斷實驗室作常見染色體數(shù)目異常診斷的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì) 評。

【背景技術(shù)】
[0002] 染色體是細胞核中的遺傳物質(zhì)，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為 決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，其中DNA占90%以上，RNA含量 隨細胞周期及生長情況而有所變化，一般占1%?10%。
[0003] 染色體結(jié)構(gòu)異常、數(shù)目異常及嵌合體，臨床上表現(xiàn)為染色體病，屬于常見的出生缺 陷，如先天愚型、原發(fā)性閉經(jīng)、兩性畸型等。染色體結(jié)構(gòu)異常包括染色體易位、缺失、倒位、環(huán) 狀等；染色體數(shù)目異常是指多出或缺少1條或數(shù)條染色體；嵌合體核型是指同一病例個體 并存數(shù)種染色體核型。目前診斷染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常的常規(guī)方法是染色體核型分析，即 用被檢的組織或細胞，經(jīng)過細胞培養(yǎng)、〇. 02 μ Ι/ml秋水仙素終止細胞生長、分離中期細胞、 0.075mol/L KC1低滲、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色體制片程序后，再經(jīng)胰酶消化、G 顯帶、染色體核型分析，從而作出染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目是否異常的判斷，但染色體核型分析需 經(jīng)細胞培養(yǎng)和制片，一般需2?3周后才能作出診斷報告，不能達到快速診斷的目的。近年 來開展的熒光原位雜交技術(shù)，能快速作出常見染色體數(shù)目是否異常的診斷，一般在24小時 就能作出診斷報告，因為產(chǎn)前診斷中的重大遺傳病如21-三體、18-三體、13三體、性染色體 數(shù)目異常均屬常見染色體數(shù)目異常，均可經(jīng)熒光原位雜交作出快速診斷，所以近年來熒光 原位雜交技術(shù)已被越來越廣泛地應(yīng)用于被定義為常見染色體數(shù)目異常的21-三體、18-三 體、13三體、性染色體異常（X與Y染色體）的產(chǎn)前診斷。
[0004] 作為所開展的各類實驗診斷項目，均應(yīng)有相應(yīng)規(guī)范的質(zhì)量控制措施。實驗室的質(zhì) 量控制是確保實驗診斷結(jié)果準確性的前提，已成為政府行為。為了加強實驗室的質(zhì)量控制， 我國于1982年成立了衛(wèi)生部臨床檢驗中心，下設(shè)室間質(zhì)評辦公室，專職從事于實驗診斷項 目的質(zhì)量控制。衛(wèi)生部[衛(wèi)醫(yī)發(fā)]1997第31號文件、《臨床實驗室管理辦法》、《醫(yī)院評審標 準實施細則》以及大量的文獻均指出，實驗室必須有規(guī)范的質(zhì)量控制標準，所開展的實驗診 斷項目必須參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的室間質(zhì)評。自1982年以來，在臨床檢驗學科先 后開展了臨床實驗的室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評。包括了對各檢驗項目的實驗前、中、后以及儀器、 試劑和實驗人員的質(zhì)量控制。質(zhì)量控制已滲透到臨檢、生化、微生物、免疫、基因、細胞形態(tài) 學診斷等各個實驗項目。實驗室的質(zhì)量控制已成為開展實驗診斷項目的準入制度、成為醫(yī) 院等級評審的重要標準。
[0005] 產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制已引起日益重視。隨著我國對生殖健康和出生缺陷工作的 是益重視，近年來各省市均建立了產(chǎn)前診斷中心，開展了 21三體綜合癥、18三體綜合征、 神經(jīng)管畸形等重大出生缺陷的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷，其中與重大出生缺陷相關(guān)的胎兒羊水 染色體異常的診斷已成為目前產(chǎn)前診斷的主要項目。由于產(chǎn)前診斷是新開展的學科，大多 專業(yè)人員的技術(shù)經(jīng)驗較為缺乏，特別是對于疑難、罕見病例、國內(nèi)外首報病例以及如貓叫綜 合癥等染色體異常不明顯但臨床后果嚴重的病例，誤診現(xiàn)象時有發(fā)生。我國國家主席令 (1994年10月27日第三十三號）公布的"產(chǎn)前診斷法規(guī)標準"以及國務(wù)院辦公廳[國發(fā)辦 (1999) 15號]轉(zhuǎn)發(fā)衛(wèi)生部"關(guān)于做好提高出生人口素質(zhì)工作意見"的通知中均強調(diào)指出， "各省、市產(chǎn)前診斷中心必須加強產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制、嚴把質(zhì)量關(guān)"。
[0006] 產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制是許多學者致力于研究的重要課題。國外有較多的文獻報 道了產(chǎn)前診斷質(zhì)量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等對產(chǎn)前細胞遺傳學診斷的細胞培 養(yǎng)及制片過程的影響因素作了深入的研究，提出了室內(nèi)質(zhì)量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像學產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制方法；Pihlk等認為必須加強產(chǎn)前篩查的質(zhì)量控制； 在2002?2004年期間，Bastien P等對法國23家實驗室作了弓形蟲產(chǎn)前分子診斷的室間 質(zhì)量評價，認為室間質(zhì)評對促進實驗室間的技術(shù)交流、發(fā)現(xiàn)問題、提高實驗診斷質(zhì)量起到重 要的作用。
[0007] 雖然我國行政主管部門以及學術(shù)界十分重視產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制（包括室內(nèi)質(zhì) 控和室間質(zhì)評），但因沒有可行的質(zhì)控物，所以無法開展實質(zhì)性的質(zhì)量控制。也就是說，要開 展產(chǎn)前診斷的室間質(zhì)評和室內(nèi)質(zhì)控，首先必須要有質(zhì)控物。研制可行的質(zhì)控物、開展產(chǎn)前診 斷質(zhì)量控制是質(zhì)量管理人員以及本專業(yè)技術(shù)人員長期以來想方設(shè)法解決但始終沒有解決 的難題。
[0008] 我們經(jīng)長期的研究和探索，設(shè)想如果能成功研發(fā)常見染色體數(shù)目異常永生化質(zhì)控 細胞，再將這種細胞由主管部門分發(fā)到各級產(chǎn)前診斷實驗室，同步于產(chǎn)前診斷的染色體病 診斷，開展質(zhì)量控制，考核各實驗人員對常見色體病數(shù)目異常的診斷能力，對增加專業(yè)人員 對疑難病例的診斷經(jīng)驗、控制實驗條件、減少誤診、提高產(chǎn)前診斷的準確性，具有重要的意 義。
[0009] 國外文獻報道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。SV40T抗原 基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定 的增殖特性和功能狀態(tài)。
[0010] 在產(chǎn)前診斷中，常有一些診斷報告后剩余的病例活細胞，本可用作質(zhì)量控制細胞， 但因為這類細胞未作特殊處理，很易死亡、難以大規(guī)模擴增以供許多實驗室反復(fù)多次作質(zhì) 控使用，所以就難以用作質(zhì)控細胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了解決產(chǎn)前診斷實驗室作常見染色體數(shù)目異常診斷中無可行質(zhì)控物的問題，本 發(fā)明人提出了本發(fā)明。
[0012] 本發(fā)明的目的是要提供一種用于醫(yī)學領(lǐng)域的產(chǎn)前診斷實驗室作技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì) 控和室間質(zhì)評的常見染色體數(shù)目異常診斷質(zhì)控細胞株及其制備方法。
[0013] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：取因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診 為常見染色體數(shù)目異常之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的 呈貼壁生長的原代或傳代活細胞，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入借T4DNA連接酶連接同時經(jīng)BamHI 酶切的pcDNA3. 1 (-) DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA所構(gòu)建的 SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)重組質(zhì)粒，使重組子與細胞DNA整合，以G418篩選整合有重組子的 細胞株，作傳代擴增后凍存細胞株，然后提取這些常見染色體數(shù)目異常的細胞株，按質(zhì)控所 需比例混合，使原先每例細胞株僅有單一染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)楹幸欢ū壤?種染色 體異常的嵌合體質(zhì)控細胞株，集中保存，備作熒光原位雜交等常見染色體數(shù)目異常診斷的 質(zhì)控細胞株。
[0014] 本發(fā)明以因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數(shù)目異常 之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的呈貼壁生長的原代或傳代 活細胞為原始細胞，標本易得（如2012年本室發(fā)現(xiàn)21-三體43例、18-三體28例、13三 體7例、X染色體數(shù)目異常15例、Y染色體數(shù)目異常12例）且將廢棄的剩余細胞轉(zhuǎn)化為有 效的質(zhì)控細胞株；以轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入SV40LTag-pcDNA3. 1(_)重組質(zhì)粒建成的質(zhì)控細胞株 具有永久生存、無限擴增的性能，可按需復(fù)制足夠的細胞株以滿足質(zhì)控要求；將5類各具單 一染色體數(shù)目異常的細胞株按質(zhì)控所需比例混合后，使原先每例細胞株僅有單一染色體數(shù) 目異常轉(zhuǎn)變?yōu)椴⒋嬉欢ū壤?類染色體異常的易誤診的嵌合體細胞株，從而增加了鑒別 診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復(fù)雜性，以疑難病例考核診斷水平、作室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì) 評，對及時發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題、制定改進預(yù)案、提高診斷水平具有意想不到的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明制備的一種18-三體絨毛組織細胞（代表性細胞）的質(zhì)控細胞系。
[0016] 圖2是本發(fā)明提出的5種染色體數(shù)目異常細胞等比例混合的質(zhì)控細胞株的熒光原 位雜交結(jié)果模擬圖。
[0017] 如圖1，細胞傳代至第75代、培養(yǎng)至第9天時，呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長 匯合率達95%以上。
[0018] 如圖2,包含有5個細胞，其中細胞1為18-三體細胞，1. 1、1.2、1.3各代表1條18 號染色體，比正常細胞多了 1條18號染色體；細胞2為少1條性染色體的細胞，2. 1代表1 條X染色體，正常細胞應(yīng)還有1條X染色體或1條Y染色體；細胞3為多1條Y染色體的 細胞，3. 1、3. 2各代表1條Y染色體，正常細胞只有1條Y染色體；細胞4為13-三體細胞， 4. 1、4. 2、4. 3各代表1條13號染色體，細胞內(nèi)多了 1條13號染色體，正常細胞為2條13號 染色體；細胞5為21-三體細胞，5. 1、5. 2、5. 3各代表1條21號染色體，細胞內(nèi)多了 1條21 號染色體，正常細胞為2條21號染色體。

【具體實施方式】
[0019] 1、原始細胞：所用的原始細胞來源于因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確 診為常見染色體數(shù)目異常之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的 呈貼壁生長的原代或傳代活組織細胞；其原代或傳代活組織細胞也可以涉及染色體結(jié)構(gòu)異 常的活組織細胞或除5種常見染色體數(shù)目異常以外的第1號至第22號染色體數(shù)目異?；?組織細胞。細胞類型為胎兒羊水、絨毛組織等細胞。
[0020] 2、SV40大T抗原DNA的提?。孩?SV40DNA酶切：從市售購買含有大T抗原基因的 SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H20或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和 18uL H20，加限制性內(nèi)切酶BamH I(l-5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，力口 入5uL電泳加樣緩沖液（也可通過加入0. 5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。②SV40DNA電 泳：取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上， 插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電 泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的10X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液 器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標準對照物，接通電極，使DNA向陽極 移動，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關(guān)閉電源。③從瓊脂糖 中分離約2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm長波紫外光源下（使用長波紫外光源以 防止DNA損傷）將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電 泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽（長度方向與電泳平行）， 加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA 全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l-5ml Eppendorf 管中，加入1. 5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正 丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿（2個）抽提2次，上 清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc、2倍體積預(yù)冷無水乙醇，于20°C過 夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加70%乙醇洗滌2次，棄干乙醇，加入 50μ 1 TE 溶解 DNA。
[0021] 3、SV40大Τ抗原DNA與pcDNA3. 1基因載體的連接：取9 μ 1上述DNA成份 (0· l-5yg)、10y 12Χ 連接緩沖液、1μ 110mmol/L ATP、T4DNA連接酶（20 ?500 粘性末端單 位）或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3. 1空載體混合，15°C溫育24h，構(gòu)建成SV40T/pcDNA3. 1 重組子。
[0022] 4、SV40T/pcDNA3. 1重組子的擴增、分離與鑒定：①大腸桿菌感受態(tài)的制備：其基 本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用 CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大 多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下：從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌 落（如大腸桿菌DH52)，或lml新鮮的16?20h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有l(wèi)OOmlLB培養(yǎng)基 的1L或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h (旋轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔 20?30min測量0D600值?0. 4,在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯 離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭） 以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置lmin以使最后殘留的痕量培 養(yǎng)液流盡，以l〇ml用冰預(yù)冷的0. lmMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3 轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置 lmin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0. 1M CaCl2重懸 每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無菌 吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取200 μ 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加入DNA或連 接反應(yīng)混合物（體積彡1〇μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將 離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速 將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1?2min，每離心管加800 μ 1S0C培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基 加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復(fù)蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗 生素抗性標記基因，將適當體積（每個90mm平板可達200μ1)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到 含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的S0B培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平 皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。②重組子的篩選、擴增與提?。河脽o菌牙簽或滅 菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基（如超級肉湯或TB超級 肉湯培養(yǎng)基）中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基（含有適當抗生素）的2L燒瓶 中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)（0D 6C4,為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒 瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4°C，6000g離心lOmin，用4mL GTL溶 液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個容積彡20mL的高速離心管中（細菌沉淀可以在-20°C或_70°C 無限期保存），加入lmL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin， 加入10mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置 lOmin，加入7. 5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放 置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可 見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0. 6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin， 于室溫，1500g離心lOmin，加入2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇， 并真空干燥（沉淀可在4°C長期保存）。③重組子的鑒定：上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的 DNA (含重組子SV40T/pcDNA3. 1)，同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝 膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大 小。
[0023] 5、SV40T/pcDNA3. 1重組子導(dǎo)入染色體異常組織細胞及其陽性克隆的篩選與擴 增：①染色體異常組織細胞的收集與培養(yǎng)：以無菌操作提取在作其他實驗或其他檢查后多 余、廢棄的染色體異常組織細胞，以細胞終濃度約為lXl〇5/mL備用，取上述呈單個分散 的細胞或經(jīng)處理后成為單個分散的細胞接種于含5?10nm 〇l/L胰島素、20%胎牛血清的 RPMI1640液中或接種于含20 %胎牛血清、5?10nm〇l/L胰島素的低糖DMEM細胞培養(yǎng)基 中，置于37°C，體積分數(shù)5 % C02培養(yǎng)箱內(nèi)，細胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細胞形態(tài)為梭形、小 園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數(shù)生長期時，即考慮 收集培養(yǎng)細胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l_2ml0. 01 %的膠原酶II液（以消化液 能覆蓋整個瓶底為準），靜置2-10min (顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測），吸去膠原酶II液，加入低糖 DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，轉(zhuǎn)入 離心管離心沉淀，去上清液，細胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導(dǎo) 入。②SV40T/pcDNA3. 1的導(dǎo)入：在上法分離所得細胞中，選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述2X105 個細胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細胞生成單層、細胞形 態(tài)為梭形、僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛 進入對數(shù)生長期時，即轉(zhuǎn)染重組子SV40T/pcDNA3. 1，在1. 5ml微量離心管中制備下列溶液： 管A，將SV40T/pcDNA3. 1溶于100 μ 1無血清培養(yǎng)液中；管B，將20 μ 1 Lipofectamine溶 于80 μ 1無血清培養(yǎng)液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min，吸去細胞培養(yǎng)液后，用無血 清培養(yǎng)液洗滌細胞2次，在Lip〇f ectamine-SV40T/pCDNA3. 1混合物中加入lml無血清培養(yǎng) 液，輕輕混勻，再滴加至細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入lml無血清培養(yǎng)液，在C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h， 吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400mg · Γ1的G418 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個細胞集落進行亞克隆，擴大培養(yǎng)后再加大G418濃度 到800mg · Γ1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進行傳代擴增，另外染色體異 常組織細胞與SV40或EB病毒共同培養(yǎng)后，感染了病毒DNA并發(fā)生整合的染色體異常組織 細胞進行傳代擴增。
[0024] 6、染色體數(shù)目異常組織細胞株的傳代、擴增：收集上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入SV40 大T抗原基因的陽性單克隆細胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基配成約1 X 105/mL的 細胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nm 〇l/L胰島 素的低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，如圖1所示，使細胞貼壁生長，至匯合率達80?85%、 處于對數(shù)生長期的前期時收集細胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代接種、培養(yǎng)，記 錄代數(shù)并觀察細胞生長特點。如圖1所示，細胞傳代至第75代、培養(yǎng)至第9天時，呈圓形、 梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95%以上，從第76代以后，傳代細胞生長減慢、貼壁 稀疏。
[0025] 7、原液質(zhì)控細胞株的制備：（1)原液活質(zhì)控細胞株的制備：取生長狀態(tài)良好、處于 對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細胞，經(jīng)過消化、終止和離心分離（1200r/min，6min)，用含 二甲亞砜的凍存液0. 5?lml重懸細胞，細胞密度為5X105個/ml，加入凍存管，經(jīng)4°C， 0. 5h ;-20°C，2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存。（2)原液固定質(zhì)控細胞的制備：（1)終止 培養(yǎng)、收獲細胞前2?3h，加入濃度為20 μ g/ml的秋水仙素，每5ml培養(yǎng)基中用7號針頭， 力口 3?4滴使最終濃度為0. 1 μ g/ml。輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2?3h，以積 累較多停止在中期的分裂象。（2)收獲細胞：由恒溫箱取出培養(yǎng)瓶，以0.25%胰蛋白酶消化 貼壁細胞5分鐘，每次收獲1瓶，用吸管充分吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，使細胞全部脫離瓶壁，然后將 細胞液移至錐形離心管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，去上清液。（3)低滲處理：加入37°C預(yù) 溫的〇· 〇75mol/LKC18ml，反復(fù)吹打（約一百次）后，置37°C水浴箱中低滲處理25min左右。 (4)預(yù)固定：加入新鮮制備固定液lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)，輕輕混勻。（5)離心：2000 轉(zhuǎn)/min,離心lOmin，吸棄上清液。（6)固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混勻，固 定lOmin。（7)離心：同上，吸去上清液。（8)再固定：加固定液8ml，混勻，固定lOmin。（9) 離心：同上，吸去上清液。（10)制備原液質(zhì)控細胞懸液：根據(jù)細胞量多少，加入適量固定液， 充分混勻，制成濃度為l〇 5/ml的細胞懸液，保存?zhèn)溆谩?br> [0026] 8、應(yīng)用質(zhì)控細胞株的制備：⑴應(yīng)用活質(zhì)控細胞株的制備：提取5例在不同時間制 備的、凍存于_196°C液氮中的染色體數(shù)目異常的原液活質(zhì)控細胞株，以5例之比均為1 : 1 的等濃度、等體積或細胞數(shù)進行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用活 質(zhì)控細胞株，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20%; 另外根據(jù)需要，取1例原液活質(zhì)控細胞株與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、 1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例 或細胞數(shù)比例進行混合，制成不等比應(yīng)用活質(zhì)控細胞株，含有不同類型和比例的染色體數(shù) 目異常，如某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%,后者為 98% ;如某1例取lml與另外1例染色體正常的同濃度細胞懸液50ml混合，則理論上前者 的嵌合體比例為2%。此外，應(yīng)活質(zhì)控細胞株還可進行傳代擴增后使用。（2)應(yīng)用固定質(zhì)控 細胞的制備：提取5例在不同時間制備的染色體數(shù)目異常的原液固定質(zhì)控細胞，以5例之 比均為1 : 1的等濃度、等體積或細胞數(shù)進行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制 成等比應(yīng)用固定質(zhì)控細胞，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的 核型各占20% ;另外根據(jù)需要，取1例原液固定質(zhì)控細胞與另外的1例、2例、3例或4例按 1 : 0.5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ? 50的體積比例或細胞數(shù)比例進行混合，制成不等比應(yīng)用固定質(zhì)控細胞，含有不同類型和比 例的染色體數(shù)目異常，如某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例 為2%，后者為98%;如某1例取lml與另外1例染色體正常的同濃度細胞懸液50ml混合， 則理論上前者的嵌合體比例為2%。經(jīng)如此反復(fù)傳代擴增和混合不同病例的染色體數(shù)目異 常細胞所制備的質(zhì)控細胞（株），不但數(shù)量足夠的多，達到用之不盡，而且使原先一般每份 原液活質(zhì)控細胞株或原液固定質(zhì)控細胞中只有一種染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性谕环?應(yīng)用活質(zhì)控細胞株或應(yīng)用固定質(zhì)控細胞中同時含有多種不同比例的、不同類型的易誤診染 色體數(shù)目異常的特征，從而增加了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復(fù)雜性，標本易得 且將廢棄的多余細胞轉(zhuǎn)化為可用于染色體核型分析的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評，在 室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評價、提高診斷水平的應(yīng)用中具有顯著的效果。
[0027] 9、染色體數(shù)目異常永生化質(zhì)控細胞庫的建立：將上述在不同時間制備的固定質(zhì)控 細胞（原液固定質(zhì)控細胞和應(yīng)用固定質(zhì)控細胞）以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液 配成濃度為l〇5/ml的細胞懸液，經(jīng)分裝、加滿固定液至管口和封口后，按年、月、日的制備日 期及標本來源地址的大寫英文字母編號，集中保存于_2〇°C，備作染色體數(shù)目診斷的質(zhì)量控 制之用。同時將相應(yīng)的5種染色體數(shù)目異常核型的標準描述、按照年、月、日的制備日期以 及標本來源地址的大寫英文字母編號錄入計算機，使用時從計算機中抽取待用質(zhì)控細胞編 號，然后從質(zhì)控細胞庫中找出相應(yīng)的質(zhì)控細胞作質(zhì)量評價；活質(zhì)控細胞株（原液活質(zhì)控細 胞株和應(yīng)用活質(zhì)控細胞株）以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）配成濃度為10 5/ml的 細胞懸液，經(jīng)每管lml分裝后，按年、月、日的制備日期及標本來源地址的大寫英文字母編 號，集中保存于_196°C液氮中，備作染色體數(shù)目診斷的質(zhì)量控制之用。同時將相應(yīng)的各種染 色體數(shù)目異常核型的標準描述、按照年、月、日的制備日期以及標本來源地址的大寫英文字 母編號錄入計算機，使用時從計算機中抽取待用質(zhì)控細胞編號，然后從質(zhì)控細胞庫中找出 相應(yīng)的質(zhì)控細胞作質(zhì)量評價
[0028] 10、室內(nèi)質(zhì)控中的應(yīng)用：從計算機中抽取質(zhì)控細胞編號，然后從質(zhì)控細胞庫中找出 相應(yīng)的質(zhì)控細胞，發(fā)送到各實驗室或相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員，在收到質(zhì)控細胞后，作為室內(nèi)質(zhì)控 物，與臨床待作染色體數(shù)目異常診斷的標本在相同條件下作同步染色體數(shù)目診斷。如果質(zhì) 控細胞的染色體數(shù)目診斷結(jié)果沒有達到要求，則說明診斷方法的試劑、儀器、操作方法等方 面有問題，應(yīng)查明原因、重新檢測后報告結(jié)果。
[0029] 11、室間質(zhì)評中的具體應(yīng)用：
[0030] ①準備質(zhì)控細胞：取1例或數(shù)例質(zhì)控細胞，按需要的例次或比例混合，混合的質(zhì)控 細胞株還可經(jīng)擴增后發(fā)放使用?，F(xiàn)以5例染色體數(shù)目異常質(zhì)控細胞株等比例細胞數(shù)混合為 例，每種染色體數(shù)目異常的細胞各占20%。然后將質(zhì)控細胞發(fā)送到各受試對象做室間質(zhì)量 評價。
[0031] ②熒光原位雜交（FISH)檢測質(zhì)控細胞染色體數(shù)目及結(jié)果判定：各受試對象收到 質(zhì)控細胞后，如為活質(zhì)控細胞株，則可酌情對質(zhì)控細胞株進行傳代擴增后測試，以增加細 胞數(shù)；如為固定質(zhì)控細胞，則直接測試。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的AneuVysion 試劑盒，含有兩個不同的雜交區(qū)域，共完成5條染色體的數(shù)目分析：第18號（Spectrum Aqua,青色）、X(Spectrum Green,綠色）、Y(Spectrum Orange,紅色）號染色體為計數(shù)探 針（Chromosome Enumerating Probe，CEP)，混合后雜交第 1 個區(qū)域；第 13 號（Spectrum Green,淺綠色）和21 (Spectrum Orange,紫紅色）號染色體為區(qū)域特異性探針（Locus Specific Identifier，LSI)，混合后雜交第2個區(qū)域。方法是取13和21號染色體為位點 特異探針，18、X和Y染色體為著絲粒探針，將質(zhì)控細胞株（與實驗室被檢標本）同步，經(jīng) 2000r/min離心lOmin，去上清，留沉淀0. 2ml，離心管中加入4ml膠原酶37°C溫浴30min， 2000r/min離心lOmin，去上清，然后加入5ml預(yù)溫的15mol/L KC1，在37水浴中低滲25min， 2000r/min離心lOmin，去上清。加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1)固定lOmin， 離心2000r/min離心lOmin去上清，反復(fù)兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標本片自 冰柜中取出，依次放人70 %、85 %、100 %乙醇中脫水，室溫干燥，預(yù)處理好的玻片置73 °C， 70%甲酰胺中5min。在暗室中將兩種探針混合液各10 μ 1加在玻片的靶區(qū)域，蓋上蓋玻片， 避免產(chǎn)生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中42°C雜交過夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜 交效果，每例標本計數(shù)60?100個細胞，記錄雜交信號數(shù)目并采集圖像，要求細胞核膜必須 完整，核內(nèi)雜交信號明亮清晰無重疊，信號彌散及微弱均不作統(tǒng)計。
[0032] ③測試結(jié)果：經(jīng)探針雜交后，細胞內(nèi)的18號染色體顯示青色的點，每條18號顯示 1個青色的點，2條則顯示2個青色的點，3條則顯示3個青色的點；細胞內(nèi)X(女性）染色 體顯示綠色的點，每條X染色體顯示1個綠色的點，2條則顯示2個綠色的點，3條則顯示3 個綠色的點；細胞內(nèi)Y(男性）染色體顯示紅色的點，每條Y染色體顯示1個紅色的點，2條 則顯示2個紅色的點，3條則顯示3個紅色的點；細胞內(nèi)的13號染色體顯示淺綠色的點，每 條13號顯示1個淺綠色的點，2條則顯示2個淺綠色的點，3條則顯示3個淺綠色的點；細 胞內(nèi)的21號染色體顯示紫紅色的點，每條21號顯示1個紫紅色的點，2條則顯示2個紫紅 色的點，3條則顯示3個紫紅色的點。
[0033] 圖2為5種染色體數(shù)目異常質(zhì)控細胞等濃度等量混合、制片、熒光原位雜交所得結(jié) 果模擬圖，如圖2所示，細胞1為18-三體細胞，1. 1、1. 2、1. 3各代表1條18號染色體，細胞 內(nèi)多了 1條18號染色體，有3個青色的點，正常細胞為2條18號染色體、2個青色的點；細 胞2為少1條性染色體的細胞，2. 1代表1條X染色體，只有1個綠色的點，正常細胞應(yīng)還有 1條X染色體（1個綠色的點）或1條Y染色體（1個紅色的點）；細胞3為多1條Y染色體 的細胞，3. 1、3. 2各代表1條Y染色體，正常細胞只有1條Y染色體、1個紅色的點；細胞4 為13-三體細胞，4. 1、4.2、4. 3各代表1條13號染色體，細胞內(nèi)多了 1條13號染色體，有3 個淺綠色的點，正常細胞為2條13號染色體、2個淺綠色的點；細胞5為21-三體細胞，5. 1、 5. 2、5. 3各代表1條21號染色體，細胞內(nèi)多了 1條21號染色體，有3個紫紅色的點，正常細 胞為2條21號染色體、2個紫紅色的點。
[〇〇34] ④結(jié)果評價：各受試實驗室將結(jié)果包括染色體數(shù)目異常的種類、比例回報室間質(zhì) 評組織者，由組織者對各室結(jié)果作統(tǒng)一評比成績，找出誤診原因、討論改正措施，以動態(tài)發(fā) 現(xiàn)質(zhì)量問題、加強質(zhì)量管理、提高診斷質(zhì)量。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常診斷質(zhì)控細胞株及其制備 方法，其主要特征是取因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數(shù)目 異常的剩余的貼壁生長活細胞，以轉(zhuǎn)基因?qū)虢鑄4DNA連接酶連接同時經(jīng)BamHI酶切的 pcDNA3. 1 (-)DNA 和 SV40LTag DNA 所構(gòu)建的 SV40LTag-pcDNA3. 1 (-)質(zhì)粒，使之與細胞 DNA 整合，G418篩選整合有重組子的細胞株，作傳代擴增、凍存，再提取這些染色體數(shù)目異常細 胞株，按質(zhì)控所需比例混合，制成疑難的常見染色體數(shù)目異常診斷質(zhì)控細胞株，所用原始細 胞易得，且將廢棄的多余細胞轉(zhuǎn)化為可永久生存、無限擴增的永生化質(zhì)控細胞，可按需復(fù)制 足夠的細胞株以滿足質(zhì)控要求，多種染色體數(shù)目異常細胞按質(zhì)控所需比例混合后使原先每 例細胞株僅有單一染色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)楹幸欢ū壤亩喾N染色體數(shù)目異常的嵌合體 質(zhì)控細胞株，增加了鑒別診斷、嵌合體診斷的難度，用以染色體數(shù)目檢測室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì) 評及技術(shù)水平考核，具有更有效的質(zhì)量控制效果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常診 斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其特征是常見染色體數(shù)目異常包含21-三體、18-三體、13三 體、X和Y染色體數(shù)目異常5類。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常診 斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其特征是SV40大T抗原DNA與常見染色體數(shù)目異常細胞DNA 整合制成了能傳代至第75代、培養(yǎng)至第9天、仍呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率 達95%以上的質(zhì)控細胞株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常診 斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其特征是按質(zhì)控所需比例混合包含： 以5例染色體數(shù)目異常原液活質(zhì)控細胞株之比均為1 : 1的等濃度、等體積或細胞數(shù) 進行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用活質(zhì)控細胞株，理論上21-三 體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20% ; 以1例原液活質(zhì)控細胞株與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例或細胞數(shù) 比例進行混合，制成不等比應(yīng)用活質(zhì)控細胞株，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目異常； 以5例染色體數(shù)目異常的原液固定質(zhì)控細胞，以5例之比均為1 : 1的等濃度、等體積 或細胞數(shù)進行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用固定質(zhì)控細胞，理論 上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20% ; 以1例原液固定質(zhì)控細胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、 1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例或細胞數(shù) 比例進行混合，制成不等比應(yīng)用固定質(zhì)控細胞，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目異常，如 某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%，后者為98%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常 診斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其特征是每1份質(zhì)控細胞包含有1?5種不同的染色體數(shù) 目異常，可同時用于相對應(yīng)的1?5種染色體數(shù)目異常檢測的質(zhì)量控制，無需備用多份質(zhì)控 物，使用方便、經(jīng)濟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常 診斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其特征是每1份質(zhì)控細胞由1?5種不同比例的染色體數(shù) 目異常細胞組合而成，能設(shè)定染色體數(shù)目異常檢出率（百分比）的界限和質(zhì)量指標；5種染 色體數(shù)目異常質(zhì)控細胞之間以及與正常細胞之間可配制2%?100%的某1種或數(shù)種染色 體數(shù)目異常的嵌合體質(zhì)控細胞，能反映、控制低比例染色體數(shù)目異常的檢測質(zhì)量，或達到與 低比例染色體數(shù)目異常的實際病例的同步檢測，具有更有效的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價效果。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常診 斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其特征是染色體數(shù)目異常永生化質(zhì)控細胞庫包含：以固定液 (甲醇：冰醋酸=3 : 1的）為媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制備日期及標本來源 地址的大寫英文字母編號的、細胞濃度為l〇5/ml的、由原液固定質(zhì)控細胞和應(yīng)用固定質(zhì)控 細胞構(gòu)成的固定質(zhì)控細胞；以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）為媒介的、-196°C液氮 保存的、按年、月、日的制備日期及標本來源地址的大寫英文字母編號的、細胞濃度為1〇 5/ ml的、由原液活質(zhì)控細胞系和應(yīng)用活質(zhì)控細胞系構(gòu)成的活質(zhì)控細胞系。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學實驗診斷質(zhì)量控制的常見染色體數(shù)目異常診 斷質(zhì)控細胞株及其制備方法，其特征在于，涉及以染色體結(jié)構(gòu)異常、除5種常見染色體數(shù)目 異常以外的第1號至第22號染色體數(shù)目異常的細胞為原始細胞所制備的質(zhì)控細胞株。
【文檔編號】C12N15/85GK104059883SQ201310109781
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月19日
【發(fā)明者】翁炳煥 申請人:翁炳煥