專利名稱：改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法
改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法本發(fā)明涉及改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，主要用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞遺傳、 出生缺陷或產(chǎn)前診斷實(shí)驗(yàn)室作染色體制備及其核型分析的組織細(xì)胞培養(yǎng)。染色體是細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)，人類有23對(duì)染色體，其中22對(duì)為常染色體，1對(duì)為決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目的異常，會(huì)引起相應(yīng)的病變或生物學(xué)功能的改變。為了研究組織細(xì)胞中染色體的結(jié)構(gòu)與功能，需要做以下三步預(yù)實(shí)驗(yàn)操作其一是待檢組織塊的培養(yǎng)前處理，目的是使之成為單個(gè)細(xì)胞或近乎單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，以有利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)典的處理方法是無(wú)菌操作取組織塊5 10mg，以無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次后，剪碎組織塊(盡量達(dá)到近單個(gè)細(xì)胞狀)，以0. 25%胰酶或膠原酶Iml消化，5 10分鐘后，輕輕振搖，待大塊組織自然下沉后，吸取上層單個(gè)細(xì)胞和較小的組織，置離心管中， 1000r/min離心lOmin，吸棄上層液，用無(wú)菌生理鹽水洗3次，沉淀物轉(zhuǎn)至2個(gè)培養(yǎng)瓶中，加 3 5ml細(xì)胞培養(yǎng)液。其二是細(xì)胞培養(yǎng)，經(jīng)典的培養(yǎng)方法是將培養(yǎng)瓶置37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中、半開(kāi)啟瓶蓋、培養(yǎng)M 4 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，見(jiàn)有單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)， 換液，此后每隔1 2天觀察、換液一次，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至60% 80%融合并表現(xiàn)良好的活力時(shí)，可收獲細(xì)胞作染色體制片。其三是染色體制備，使染色體成形，以供染色體核型分析等 Z用ο經(jīng)典的組織塊培養(yǎng)前處理方法存在以下的缺點(diǎn)①是需用小剪刀反復(fù)剪碎組織塊 20 30分鐘，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。②是需要用胰酶或膠原酶消化5 10分鐘，消化后需用無(wú)菌生理鹽水懸浮細(xì)胞、離心沉淀、重復(fù)洗滌3次以去除殘余的酶，此過(guò)程操作繁瑣，酶試劑費(fèi)用昂貴、易失效，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，此外，長(zhǎng)時(shí)間的消化會(huì)破壞細(xì)胞膜表面的整合素，從而影響細(xì)胞的粘附力，并造成細(xì)胞外基質(zhì)合成時(shí)基因表達(dá)的改變，從而影響細(xì)胞合成胞外基質(zhì)、維持表型及增殖的能力，很難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞體外生長(zhǎng)和擴(kuò)增的目的。③操作過(guò)程步驟多，易污染而致細(xì)胞培養(yǎng)失敗。經(jīng)典組織細(xì)胞培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)是因?yàn)榻M織細(xì)胞需要在37°C、5% CO2的環(huán)境中生長(zhǎng)，在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，如果把培養(yǎng)瓶的蓋子擰緊，則培養(yǎng)瓶外(培養(yǎng)箱中)的CO2就難以進(jìn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)；反之，如果為了使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)與培養(yǎng)箱中的CO2含量處于平衡狀態(tài)，則需要以半開(kāi)啟或全開(kāi)啟培養(yǎng)瓶蓋的方式培養(yǎng)，特別是在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的情況下， 培養(yǎng)瓶外(培養(yǎng)箱中)的微生物很容易進(jìn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)而造成污染，致使細(xì)胞培養(yǎng)失敗。本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題，提出了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是要提供改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，它能夠有效地消除經(jīng)典組織塊培養(yǎng)前處理方法的缺點(diǎn)及經(jīng)典組織細(xì)胞培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的用無(wú)菌生理鹽水洗滌待檢組織塊，然后置于特制的組織研磨器中，研磨10 30秒鐘，加常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液1 3mL，懸浮細(xì)胞，移入防污染的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本發(fā)明簡(jiǎn)略了經(jīng)典方法中需要反復(fù)剪碎組織塊、膠原酶消化、重復(fù)洗滌和離心沉淀的過(guò)程，消除了由此產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)影響因素，同時(shí)使用了特制的培養(yǎng)瓶，既能有效地預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)菌污染，又能確保細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所需的(X)2含量和濕度。本發(fā)明可大大提高工作效率和細(xì)胞培養(yǎng)成功率、節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

圖1是根據(jù)本發(fā)明提出的防污染細(xì)胞培養(yǎng)瓶的剖面圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明提出的組織研磨器的剖面圖。下面結(jié)合圖1和圖2，對(duì)本發(fā)明所提供的改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法作詳細(xì)的描述。如圖1所示，防污染培養(yǎng)瓶1由塑料制成，其中培養(yǎng)瓶壁底2內(nèi)表面光滑平整，在組織細(xì)胞靜置培養(yǎng)的過(guò)程中，起初懸浮于液體培養(yǎng)基的組織細(xì)胞沉淀并貼壁在培養(yǎng)瓶壁底 2內(nèi)表面呈細(xì)胞集團(tuán)生長(zhǎng)，瓶頸外口呈螺紋狀，與瓶蓋3內(nèi)螺紋相接，兩者擰緊時(shí)呈密封狀態(tài)，蓋頂4為具有目前微生物實(shí)驗(yàn)室通用的普通濾菌器的結(jié)構(gòu)與功能，由石棉板制成，或由硅藻土和石棉混合制成，含有微細(xì)小濾孔，孔徑一般不超過(guò)0. 15 0. 22 μ m,但不小于44A， 這些小孔能機(jī)械性地過(guò)濾細(xì)菌、真菌等微生物，阻止這類微生物進(jìn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，而二氧化碳、水蒸汽等小分子氣體則能自由通過(guò)，進(jìn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，所以在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，使用具有濾菌器結(jié)構(gòu)和功能的蓋頂4的組織細(xì)胞培養(yǎng)瓶，當(dāng)擰緊瓶蓋后，既可使組織細(xì)胞在規(guī)定的二氧化碳濃度和水份濕度的條件下生長(zhǎng)，又可起到防止細(xì)菌、真菌等微生物進(jìn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)而污染作用。蓋頂4的功能可設(shè)置在瓶壁、瓶底、瓶頸及瓶蓋的其他部位。如圖2所示，組織研磨器由研棒1和研杯2組成，研杯2的口徑為0. 5 20cm，研杯高為1 20cm，研棒1的大小和長(zhǎng)度與研杯2相配套，以方便使用為標(biāo)準(zhǔn)。研棒1和研杯 2以瓷、玻璃、瑪瑙、氧化鋁或鐵為材料制成，也可以玻璃或塑料為材料制成的一次性用品。本發(fā)明具體的實(shí)施步驟是用無(wú)菌生理鹽水洗凈待檢組織塊，去除組織塊表面的污物或污染的細(xì)胞、血跡等，如疑有微生物污染，可用含100U/mL雙抗(青霉素、鏈霉素)的 PBS液浸泡或沖洗3次，對(duì)大的組織塊可考慮浸泡于75%灑精中5 10分鐘后再用無(wú)菌生理鹽水沖凈，取組織塊中部處理、培養(yǎng)。將已作預(yù)處理的組織塊置于本發(fā)明提供的組織研磨器中，研磨10 30秒鐘，加常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液1 3mL，懸浮細(xì)胞，移入本發(fā)明提供的防污染細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)M 4 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，見(jiàn)有單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，換液，此后每隔1 2天觀察、換液一次，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至 60 % 80 %融合并表現(xiàn)良好的活力時(shí)，可收獲細(xì)胞作常規(guī)染色體制片，使染色體成形，以供染色體核型分析等之用。
權(quán)利要求
1.一種用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，其主要特征是設(shè)計(jì)組織研磨器及防污染培養(yǎng)瓶，用于改良經(jīng)典染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，在待檢組織塊放入組織研磨器后，僅運(yùn)作10 30秒鐘，就可達(dá)到組織培養(yǎng)的細(xì)胞分散要求，即可用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，移入防污染細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，作常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)染色體制備，因此簡(jiǎn)略了經(jīng)典方法中需要反復(fù)剪碎組織塊、膠原酶消化、重復(fù)洗滌、離心沉淀及試劑配制等近2 小時(shí)的作業(yè)，而且消除了由經(jīng)典方法產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞物理和化學(xué)的損傷、實(shí)驗(yàn)污染和感染等影響因素，防污染培養(yǎng)瓶既能有效地預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)菌污染，又能確保其所需的CO2 含量和濕度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是防污染培養(yǎng)瓶1的蓋頂4由石棉板、硅藻土制成具有濾菌器結(jié)構(gòu)和功能，濾孔口徑不超過(guò)0. 15 0. 22 μ m，不小于44A，濾孔可設(shè)置在瓶壁、瓶底、瓶頸及瓶蓋的其他部位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是組織研磨器由研棒1和研杯2組成，研杯2的口徑為0. 5 20cm，研杯高為1 20cm，研棒1的大小和長(zhǎng)度與研杯2相配套，制作材料為瓷、玻璃、瑪瑙、氧化鋁或鐵，或以玻璃、塑料制作一次性用PΡΠ O
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于醫(yī)療領(lǐng)域的改良染色體制備組織細(xì)胞培養(yǎng)方法，其主要特征是設(shè)計(jì)并應(yīng)用由研棒1和研杯2組成的組織研磨器，僅運(yùn)作10～30秒鐘就可取代經(jīng)典方法中反復(fù)剪碎組織塊、膠原酶消化、重復(fù)洗滌、離心沉淀及試劑配制等近2小時(shí)的作業(yè)，還消除了由經(jīng)典方法產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞物理和化學(xué)的損傷、實(shí)驗(yàn)污染和感染等影響因素；同時(shí)設(shè)計(jì)了具有濾菌器結(jié)構(gòu)和功能的防污染培養(yǎng)瓶，既能有效地預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)菌污染，又能確保其所需的CO2含量和濕度，從而大大提高工作效率和細(xì)胞培養(yǎng)成功率、便于成批操作、節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本、優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方法。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102443563SQ20101051183
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月10日
發(fā)明者翁炳煥, 黃荷鳳 申請(qǐng)人:翁炳煥