能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌及其分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌及其分離方法。所述唾液乳酸桿菌拉丁名為L(zhǎng)actobacillussalivariusLI01，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.7045。本發(fā)明公開(kāi)了該菌的形態(tài)學(xué)特征為：菌體桿狀，不產(chǎn)孢子，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色呈陽(yáng)性。本發(fā)明公開(kāi)了該菌的全細(xì)胞脂肪酸主要成份為：16:0約38.48%，18:1w9c約8.29%，19:0cyclow10c/19w6約14.68%，18:0約5.94%，19:0cyclow10c/19w6約12.75%，19:0cyclow8c約11.55%，19:1w6c約12.75%，18:1w7c約14.68%。本發(fā)明還公開(kāi)了該菌的16S核糖體DNA(16SrDNA)全序列。本發(fā)明公開(kāi)的分離篩選方法包括三個(gè)步驟：MRS營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，以白色念珠菌覆蓋層初篩，以液體共培養(yǎng)復(fù)篩。該方法快捷有效，所得菌種抗白念能力強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌及其分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌及其分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白色念珠菌又稱白假絲酵母菌(Candida Albicans),廣泛存在于自然界和人的皮膚、口腔、上呼吸道、腸道及陰道，是一種條件致病性真菌。健康狀態(tài)下，人體表或體內(nèi)的白色念珠菌數(shù)量較少，不引起疾病。當(dāng)機(jī)體免疫力下降或微生態(tài)受到破壞等特殊情況下，白色念珠菌大量生長(zhǎng)，引起急性、亞急性或慢性感染，是最常見(jiàn)的真菌病。可能誘發(fā)白色念珠菌感染的因素有:獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，基因缺陷，抗生素和免疫抑制劑的使用，腫瘤及腫瘤放化療，器官移植等。 [0003]皮膚念珠菌病好發(fā)于皮膚皺褶處(腑窩、腹股溝，乳房下，肛門周圍及甲溝，指間)，表現(xiàn)為皮膚潮紅、潮濕、發(fā)亮，有時(shí)蓋上一層白色或呈破裂狀物，病變周圍有小水泡。粘膜念珠菌病以鵝口瘡、口角炎、陰道炎最多見(jiàn)，在粘膜表面蓋有凝乳大小不等的白色薄膜，剝除后，留下潮紅基底，并產(chǎn)生裂隙及淺表潰瘍。念珠菌疹是念珠菌及其代謝產(chǎn)物引起的皮膚變態(tài)反應(yīng)，主要損害為成群的無(wú)菌性水皰，多見(jiàn)于手指間，也可見(jiàn)到銀屑病樣、玫瑰糠疹樣、月旨溢性皮炎樣、蕁麻疹樣、離心性環(huán)狀紅斑樣損害。白色念珠菌經(jīng)血液入侵并擴(kuò)散到全身時(shí)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的感染，常見(jiàn)的有肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腦炎等，偶爾也可發(fā)生敗血癥，在院內(nèi)感染中十分常見(jiàn)，且不易診斷治療，致死率極高。近年來(lái)隨著大劑量抗生素、激素、免疫抑制劑的應(yīng)用，以及器官移植術(shù)的開(kāi)展，白色念珠感染發(fā)病率漸趨增高，?？晌＜吧斐蓢?yán)重后果。
[0004]抗真菌藥物是目前治療白色念珠菌感染最常用的手段。同時(shí)，使患者遠(yuǎn)離可能含有白色念珠菌的食品，并禁食有利于酵母菌生長(zhǎng)的食物，也是需要采取的措施之一。如有可能，抗生素或免疫抑制劑應(yīng)該被停用，或者減少到不得不使用的最低劑量。然而，很多請(qǐng)況下，即使三種治療手段同時(shí)應(yīng)用，也不能使病人完全擺脫白色念珠菌的困擾。一旦停用抗真菌藥物，白色念珠菌感染就會(huì)復(fù)發(fā)。因此，造成相關(guān)感染的根本原因并不在白色念珠菌本身，提高人體免疫力并恢復(fù)微生態(tài)平衡才是解決問(wèn)題的根本途徑。
[0005]益生菌尤其是乳酸桿菌在維護(hù)微生態(tài)平衡、防治感染中具有重要作用。乳酸桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而減少了可供有害微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分；能夠分泌過(guò)氧化氫、硫化氫和抗菌肽等物質(zhì)，直接抑制或殺滅有害菌生長(zhǎng)；通過(guò)分泌乳酸等有機(jī)酸降低環(huán)境PH值，減少白色念珠菌等滋生；與表皮細(xì)胞的黏膜黏附占位，避免條件致病菌對(duì)機(jī)體接觸與侵襲；調(diào)節(jié)增強(qiáng)免疫能力，主動(dòng)殺滅有害菌；促進(jìn)表皮細(xì)胞增生等重要功能。不同乳酸桿菌的抗菌能力和抗菌譜差別很大，篩選具有抗白色念珠菌功能的乳酸桿菌，對(duì)于防治感染，保護(hù)和促進(jìn)人類健康都具有重要意義。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是提供一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌及其分離方法。[0007]能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳桿菌L3cioAaci77w5.sali varius LiOl,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.7045，保藏時(shí)間2012年12月26日，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵政編碼100101。
[0008]所述的能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌形態(tài)學(xué)特征為:菌體為桿狀，不產(chǎn)孢子，無(wú)運(yùn)動(dòng)性。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成白色群落。理化的特征如下:能發(fā)酵葡萄糖，果糖，蜜二糖，海藻糖，乳糖，甘露糖醇，甘露糖，棉子糖，蔗糖，半乳糖，鼠李糖，麥芽糖和山梨糖醇產(chǎn)酸，不能利用阿拉伯糖，木糖，纖維二糖，松三糖，甲基AD-葡萄糖苷，甲基AD-甘露糖苷，水楊苷，甘油或山梨糖發(fā)酵產(chǎn)酸。
[0009]能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的16S核糖體DNA (16S rDNA)全序列為SEQ ID NO:1 所示。
[0010]能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的全細(xì)胞水解脂肪酸含量為:
[0011]一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的分離方法包括如下步驟:
1)分別取少量來(lái)自不同健康人不同部位含微生物樣本，加入到0.5~10毫升富集培養(yǎng)基中，20~37°C、厭氧條件下，富集培養(yǎng)24~72小時(shí)；
2)將上述樣本富集培養(yǎng)基，稀釋后100~10000倍后，取50~300微升涂布到篩選平板上，20~37°C厭氧培養(yǎng)24~72小時(shí)；
3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，加入到滅菌后冷卻到40~60°C的半固體培養(yǎng)基，混合均勻，最終濃度IO7~IO8個(gè)；
4)將3-10毫升上述40~60°C新鮮配 置的含有白色念珠菌的半固體培養(yǎng)基，鋪到篩選平板上，37°C好氧培養(yǎng)12~48小時(shí)，觀察抑菌圈；
5 )從篩選平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在復(fù)篩液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~36小時(shí)，離心、過(guò)濾去除微生物，接入0.5%~5%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，比較并選取能較好抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的菌株。
[0012]所述的富集培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨5~10克，牛肉膏5~10克，酵母提取物2~5克，葡萄糖5~10克，乳果糖2~5克，吐溫80 0.5~I克，磷酸氫二鉀I~2克，三水乙酸鈉2~5克，檸檬酸二銨I~2克，七水硫酸鎂0.2~0.5克，四水硫酸錳0.03~0.07克，pH6.0~7.0，蒸餾水900~100毫升。
[0013]所述的篩選平板培養(yǎng)基的成份為:酵母提取物3~8克，胰蛋白胨8~12克，葡萄糖5~15克，磷酸二氫鉀4~8克，硫酸亞鐵0.02~0.05克，七水硫酸鎂0.4~0.8克，三水乙酸鈉20~30克，檸檬酸二銨I~3克，四水硫酸錳0.1~0.2克，瓊脂15~25克，吐溫80 0.5~I克，pH值5.0~6.0。
[0014]所述的半固體培養(yǎng)基的成份為:瓊脂粉3~10克，蛋白胨5~10克，酵母提取物3~5克，葡萄糖15~20克，吐溫80 0.5~I克，磷酸氫二鉀I~2克，醋酸鈉2~5克，ρΗ5.5~6.5，蒸餾水900~100毫升。
[0015]所述的復(fù)篩液體培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨5~10克，牛肉膏5~10克，酵母提取物3~5克，葡萄糖15~20克，吐溫80 0.5~I克，磷酸氫二鉀I~2克，醋酸鈉2~5克，檸檬酸二銨I~2克，七水硫酸鎂0.2~0.5克，四水硫酸錳0.03~0.07克，ρΗ6.0~7.0，蒸餾水900~100毫升。
[0016]經(jīng)與其他菌種和分離方法比較、反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:I)所述的能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌所需的發(fā)酵周期短、抑菌性能強(qiáng)、操作過(guò)程簡(jiǎn)便、發(fā)酵成本低、后處理步驟簡(jiǎn)單。
[0017]2)所述的唾液乳酸桿菌自身生長(zhǎng)過(guò)程中能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)，且不含菌體的發(fā)酵液也具有良好的抑制白色念珠菌生長(zhǎng)功能。
[0018]3)所述的能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌具有較廣泛的抗菌譜，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、志賀氏菌、肺炎鏈球菌等都具有良好的抑制效果。
[0019]4)所述的能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌具有良好的耐酸、耐膽汁等能力，是一種潛在的益生菌，在治療皮膚、陰道、消化道等的白色念珠菌感染等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0020]5)所述的分離方法具有簡(jiǎn)單有效，針對(duì)性強(qiáng)，假陽(yáng)性結(jié)果少的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0022]圖1是唾液乳酸桿菌sali varius LIOl的16SrDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
I)取0.5克來(lái)自不同健康人的新鮮糞便樣本，分別加入到10毫升富集培養(yǎng)基中，37°C、厭氧條件下，富集培養(yǎng)24小時(shí)；富集培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨5克，牛肉膏5克，酵母提取物2克，葡萄糖8克，乳果糖2克，吐溫80 0.5克，磷酸氫二鉀2克，三水乙酸鈉2克，檸檬酸二銨2克，七水硫酸鎂0.2克，四水硫酸錳0.03克，蒸餾水950毫升，ρΗ6.2ο
[0024]2)將上述樣本富集培養(yǎng)基稀釋1000倍后，取100微升涂布到篩選平板上，37°C厭氧培養(yǎng)48小時(shí)；篩選平板培養(yǎng)基的成份為:酵母提取物5克，胰蛋白胨8克，葡萄糖10克，磷酸二氫鉀4克，硫酸亞鐵0.02克，七水硫酸鎂0.4克，三水乙酸鈉20克，檸檬酸二銨I克，四水硫酸錳0.2克，瓊脂15克，吐溫80 0.5克，蒸餾水950毫升，pH值5.5。
[0025]3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，加入到滅菌后冷卻到45°C的半固體培養(yǎng)基，混合均勻，最終濃度5xl07個(gè)；半固體培養(yǎng)基的成份為:瓊脂粉7克，蛋白胨5克，酵母提取物3克，葡萄糖15克，吐溫80 0.5克，磷酸氫二鉀2克，醋酸鈉3克，蒸餾水900~100毫升，pH6.5。
[0026]4)將7毫升上述45°C新鮮配置的含有白色念珠菌的半固體培養(yǎng)基，鋪到篩選平板上，37°C好氧培養(yǎng)24小時(shí)，觀察抑菌圈。
[0027]5)從篩選平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在復(fù)篩液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，離心、過(guò)濾去除微生物，接入1%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，比較并選取能較好抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的菌株。復(fù)篩液體培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨10克，牛肉膏5克，酵母提取物5 克，葡萄糖15克，吐溫80 I克，磷酸氫二鉀2克，醋酸鈉2克，檸檬酸二銨2克，七水硫酸鎂0.5克，四水硫酸錳0.07克，蒸餾水960毫升，pH6.0。
[0028]實(shí)施例2I)分別取0.2克來(lái)自不同健康女性的陰道分泌物樣本，加入到5毫升富集培養(yǎng)基中，37°C、厭氧條件下，富集培養(yǎng)24小時(shí)；富集培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨8克，牛肉膏6g，酵母提取物4克，葡萄糖6克，乳果糖3克，吐溫80 0.7克，磷酸氫二鉀1.5克，三水乙酸鈉4克，檸檬酸二銨I克，七水硫酸鎂0.3克，四水硫酸錳0.04克，蒸餾水950毫升，ρΗ6.2ο
[0029]2)將上述樣本富集培養(yǎng)基，稀釋后5000倍后，取200微升涂布到篩選平板上，37°C厭氧培養(yǎng)24小時(shí)；篩選平板培養(yǎng)基的成份為:酵母提取物4克，胰蛋白胨10，葡萄糖8克，磷酸二氫鉀48克，硫酸亞鐵0.04克，七水硫酸鎂0.6克，三水乙酸鈉25克，檸檬酸二銨3克，四水硫酸錳0.2克，瓊脂18克，吐溫80 0.6克，蒸餾水950毫升，pH值5.6。
[0030]3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，加入到滅菌后冷卻到50°C的半固體培養(yǎng)基，混合均勻，最終濃度IO8個(gè)；半固體培養(yǎng)基的成份為:瓊脂粉5克，蛋白胨9克，酵母提取物3克，葡萄糖15克，吐溫80 0.9克，磷酸氫二鉀2克，醋酸鈉3克，pH5.8，蒸餾水970毫升。
[0031]4)將8毫升上述50°C新鮮配置的含有白色念珠菌的半固體培養(yǎng)基，鋪到篩選平板上，37°C好氧培養(yǎng)48小時(shí)，觀察抑菌圈；復(fù)篩液體培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨5克，牛肉膏6克，酵母提取物5克，葡萄糖16克，吐溫80 0.7克，磷酸氫二鉀1.5克，醋酸鈉3克，檸檬酸二銨2克，七水硫酸鎂0.3克，四水硫酸錳0.04克，蒸餾水950毫升，pH6.4。
[0032]5)從篩選平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在復(fù)篩液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時(shí)，離心、過(guò)濾去除微生物，接入1.2%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，比較并選取能較好抑制白色念珠 菌生長(zhǎng)的菌株。
[0033]實(shí)施例3
I)分別取200微升來(lái)自不同健康人的唾液樣本，加入到5毫升富集培養(yǎng)基中，37°C、厭氧條件下，富集培養(yǎng)48小時(shí)；富集培養(yǎng)基成份為:蛋白胨6克，牛肉膏5.5克，酵母提取物3克，葡萄糖7克，乳果糖3克，吐溫80 0.7克，磷酸氫二鉀1.5克，三水乙酸鈉2.5克，檸檬酸二銨1.5克，七水硫酸鎂0.3克，四水硫酸錳0.04克，pH6.5，蒸餾水960毫升。
[0034]2)將上述樣本富集培養(yǎng)基，稀釋后4000倍后，取100微升涂布到篩選平板上，37°C厭氧培養(yǎng)48小時(shí)；篩選平板培養(yǎng)基的成份為:酵母提取物4克，胰蛋白胨9，葡萄糖10克，磷酸二氫鉀5克，硫酸亞鐵0.05克，七水硫酸鎂0.8克，三水乙酸鈉25克，檸檬酸二銨2克，四水硫酸錳0.2克，瓊脂18克，吐溫80 0.8克，pH值6.0,蒸餾水950毫升。
[0035]3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，加入到滅菌后冷卻到46°C的半固體培養(yǎng)基，混合均勻，最終濃度5xl07個(gè)；半固體培養(yǎng)基的成份為:瓊脂粉6克，蛋白胨7克，酵母提取物4克，葡萄糖16克，吐溫80 0.8克，磷酸氫二鉀2克，醋酸鈉3克，pH5.5，蒸餾水950毫升。
[0036]4)將7毫升上述46°C新鮮配置的含有白色念珠菌的半固體培養(yǎng)基，鋪到篩選平板上，37°C好氧培養(yǎng)24小時(shí)，觀察抑菌圈；復(fù)篩液體培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨7克，牛肉膏6克，酵母提取物4克，葡萄糖15克，吐溫80 0.7克，磷酸氫二鉀1.5克，醋酸鈉3克，檸檬酸二銨2克，七水硫酸鎂0.3克，四水硫酸錳0.05克，pH6.5，蒸餾水960毫升。
[0037]5)從篩選平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在復(fù)篩液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)，離心、過(guò)濾去除微生物，接入1.2%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，比較并選取能較好抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的菌株。
[0038]實(shí)施例4
I)取唾液乳酸桿菌salivarius LIOl單克隆,加入到5毫升富集培養(yǎng)基中，37°C、厭氧條件下，富集培養(yǎng)24小時(shí)；富集培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨6克，牛肉膏6克，酵母提取物3克，葡萄糖7克，乳果糖4克，吐溫80 0.6克，磷酸氫二鉀1.5克，三水乙酸鈉3克，檸檬酸二銨1.5克，七水硫酸鎂0.3克，四水硫酸錳0.05克，蒸餾水950毫升，pH6.2。
[0039]2)取唾液乳酸桿菌salivarius LIOl富集培養(yǎng)基2微升,無(wú)菌條件下滴種到篩選平板上，37°C厭氧培養(yǎng)24小時(shí)；篩選平板培養(yǎng)基的成份為:酵母提取物6克，胰蛋白胨10克，葡萄糖7克，磷酸二氫鉀6克，硫酸亞鐵0.04克，七水硫酸鎂0.4克，三水乙酸鈉25克，檸檬酸二銨2克，四水硫酸錳0.2克，瓊脂15克，吐溫80 0.6克，蒸餾水950 毫升，pH 值 5.5。
[0040]3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，加入到滅菌后冷卻到45°C的半固體培養(yǎng)基，混合均勻，最終濃度8xl07個(gè)；半固體培養(yǎng)基的成份為:瓊脂粉6克，蛋白胨7克，酵母提取物7克，葡萄糖5克，吐溫80 0.6克，磷酸氫二鉀1.6克，醋酸鈉4克，蒸餾水900~100毫升，pH6.5。
[0041]4)將6毫升上述45°C新鮮配置的含有白色念珠菌的半固體培養(yǎng)基，鋪到滴種唾液乳酸桿菌sali vari us LIOl的篩選平板上，37°C好氧培養(yǎng)24小時(shí),抑菌圈大小在8~20mm。
[0042]實(shí)施例5
I)取唾液乳酸桿菌sali var`ius LIOl單克隆,加入到6毫升富集培養(yǎng)基中，37°C、厭氧條件下，富集培養(yǎng)24小時(shí)；富集培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨6克，牛肉膏7克，酵母提取物4克，葡萄糖8克，乳果糖3克，吐溫80 0.5克，磷酸氫二鉀1.4克，三水乙酸鈉2克，檸檬酸二銨克，七水硫酸鎂0.4克，四水硫酸錳0.03克，蒸餾水950毫升，pH6.2。
[0043]2)取唾液乳酸桿菌sali varius LIOl 富集培養(yǎng)基,8000rpm 離心5分鐘，取上清過(guò)濾除菌，用上述富集培養(yǎng)基分別稀釋到40%、60%、80%和100%的濃度。
[0044]3)分別取2微升對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，加入到198微升上述40%、60%、80%和100%濃度的唾液乳酸桿菌Zacio如sali varius LIOl發(fā)酵液中，37°C好氧培養(yǎng)24小時(shí)，抑菌率分別在30%、50%、70%和100%左右。
[0045]實(shí)施例6
唾液乳酸桿菌sali varius LIOl的16SrDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析實(shí)例見(jiàn)附圖1:
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。
[0046]本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神和主要特征的具體形式來(lái)概述。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不能限制本發(fā)明，權(quán)利要求書(shū)指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說(shuō)明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌salivarius L101,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.7045。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌，其特征在于所述的唾液乳酸桿菌形態(tài)學(xué)特征為:菌體桿狀，不產(chǎn)孢子，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成乳白色群落。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌，其特征在于所述唾液乳酸桿菌的16S核糖體DNA全序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌，其特征在于所述的唾液乳酸桿菌的全細(xì)胞水解脂肪酸組成為: 脂ItSSf3類含量 14:liv5cO 34 14:0151 15:0 ^iteisoft0.16 16:1 16:1 w6c1.SS
16:1'v6c: 16:1 'v7c0.99 16:1 w5cOJS 16:038.4S I ~:0.§Mdso_0-22 r；lwSc029 l?:0cvdo0.30 1S:1%v9cS-29°
19:0 cvcio 'VIOc 19w6 14.6S 1S:1 w5c0.2" 1S:05.94 19:0 iso0.45 19:0 cvdo vrIOc 19\v6 12-75
19:0 cjjdo wSc11.55 20:1OJO
16:1 ^v7C 16:1 v:6c2-S7 19:1 \v6c12.^5 1S:1 'v，c14.6S
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的分離方法，其特征在于包括如下步驟: 1)分別取少量來(lái)自不同健康人不同部位含微生物樣本，加入到0.5~10毫升富集培養(yǎng)基中，20~37°C、厭氧條件下，富集培養(yǎng)24~72小時(shí)； 2)將上述樣本富集培養(yǎng)基，稀釋100~10000倍后，取50~300微升涂布到篩選平板上，20~37°C厭氧培養(yǎng)24~72小時(shí)； 3)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，加入到滅菌后冷卻到40~60°C的半固體培養(yǎng)基，混合均勻，最終濃度IO7~IO8個(gè)/毫升；.4)將3-10毫升上述40~60°C新鮮配置的含有白色念珠菌的半固體培養(yǎng)基，鋪到篩選平板上，37°C好氧培養(yǎng)12~48小時(shí)，觀察抑菌圈； .5 )從篩選平板中，菌斑上方有白色念珠菌抑菌圈的菌斑中挑取菌落，在復(fù)篩液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12~36小時(shí)，離心、過(guò)濾去除微生物，接入1%~5%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白色念珠菌，比較并選取能較好抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的分離方法，其特征在于所述的富集培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨5~10克，牛肉膏5~10克，酵母提取物2~5克，葡萄糖5~10克，乳果糖2~5克，吐溫80 0.5~I克，磷酸氫二鉀I~2克，三水乙酸鈉2~5克，檸檬酸二銨I~2克，七水硫酸鎂0.2~0.5克，四水硫酸錳0.03~0.07克，pH6.0~7.0，蒸餾水900~100毫升。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的分離方法，其特征在于所述的篩選平板培養(yǎng)基的成份為:酵母提取物3~8克，胰蛋白胨8~12，葡萄糖5~15克，磷酸二氫鉀4~8克，硫酸亞鐵0.02~0.05克，七水硫酸鎂0.4~0.8克，三水乙酸鈉20~30克，檸檬酸二銨I~3克，四水硫酸錳0.1~0.2克，瓊脂15~25克，吐溫80 0.5~I克，pH值5.0~6.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的分離方法，其特征在于所述的半固體培養(yǎng)基的成份為:瓊脂粉3~10克，蛋白胨5~10克，酵母提取物3~5克，葡萄糖15~20克，吐溫80 0.5~I克，磷酸氫二鉀I~2克，醋酸鈉2~5克，ρΗ5.5~6.5，蒸餾水900~100毫升。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種能夠抑制白色念珠菌生長(zhǎng)的唾液乳酸桿菌的分離方法，其特征在于所述的復(fù)篩液體培養(yǎng)基的成份為:蛋白胨5~10克，牛肉膏5~10克，酵母提取物3~5克，葡萄糖15~20克，吐溫80 0.5~I克，磷酸氫二鉀I~2克，醋酸鈉2~5克，檸檬酸二銨I~2克，七水硫酸鎂0.2~0.5克，四水硫酸錳0.03~0.07克，ρΗ6.0~7.0，蒸餾水900~100毫升。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103555604SQ201310096605
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月25日
【發(fā)明者】李蘭娟, 呂龍賢, 胡新俊, 錢貴榮 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)