專利名稱：一種用于快速檢測華法林個體化用藥相關基因snp位點的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能用于快速檢測華法林個體化用藥相關基因SNP位點的方法，具體說是通過抽取人外周血DNA，通過Taq man探針特異性PCR擴增后進行熒光信號分析，對CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)兩個多態(tài)性位點進行快速精確基因分型。該方法可以用于臨床需要服用華法林的各類患者的輔助診斷、治療，屬于生物醫(yī)學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術。
背景技術：
華法林是目前廣泛應用的香豆素類口服抗凝藥，用于預防和治療血栓栓塞性疾病如:人工瓣膜置換、靜脈血栓形成(肺栓塞)、房顫等的口服抗凝治療，以及降低心肌梗死復發(fā)及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危險。但是華法林的劑量很難掌握，因為不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目前，CYP2C9和維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)基因多態(tài)性對華法林代謝的影響逐漸被認識，其中CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)與華法林關系最為密切，都與代謝酶的損傷有關，從而導致個體間和民族間華法林用量的差異。因此，臨床上一種快速準確的基因分型方法的應用將對需華法林治療的患者提供個體化的醫(yī)療方案?，F(xiàn)在已經證實有30多種基因相互作用決定華法林代謝、轉運和藥理作用?；颊卟煌乃幬锘蚪M學信息是導致華法林劑量差異的重要因素。與遺傳因素相關的低凝血酶原患者最常見的原因是CYP2C9代謝活性降低和藥物靶標VKORCl (vitamin K epoxidereductase complexl)低表達。這兩種基因的遺傳多態(tài)性在全世界范圍內可解釋15%和25%的華法林劑量變異。有研究顯示基于這兩種基因多態(tài)性的華法林使用劑量能夠有效的減少不良事件的發(fā)生和血栓性疾病的預防`[1，2]。因此美國FDA在2007年修改了華法林的使用說明，建議在使用華法林前進行基因分型。而且CYP2C9、VKORCl基因多態(tài)性分析已經成為國內外有條件的臨床實驗室重要檢測項目。目前檢測CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)遺傳多態(tài)性的最簡單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過應用特異性限制性內切酶消化PCR擴增產物，并根據(jù)消化位點是否消失來判斷其變異存在與否。但該方法操作復雜，樣本量多時易造成PCR產物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度而出現(xiàn)假陰性或假陽性結果，可靠性低。熒光定量PCR和多重PCR方法盡管特異性有所提高，但是這兩種方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，熒光信號的強弱，引物特異性以及低保真Taq酶等這些因素均可造成對結果的影響。DNA測序法價格相對昂貴且操作流程繁瑣，在人類后基因組時代突飛猛進的今天，這幾種方法均不能滿足當前對VKORCl (-1639G/A)和CYP2C9 (1075A/C) SNP位點快速準確分析的要求。Taqman探針的方法采用特異性的熒光標記的探針，特異性強，靈敏度高且操作方便，快速。該方法同樣被認為是SNP分型的金標準，在臨床應用的前景值得期待。其基本原理是:應用一對雙熒光標記的Taqman探針，分別針對雙等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針擴增出各自的基因型；用兩種熒光染料FAM，HEX (VIC)分別標記這兩種探針，就可以在一次PCR反應中完成對單個SNP位點的基因型判定。所以該方法中引物長度，探針長度，引物特異性，探針特異性對檢測結果的特異性和敏感性非常重要。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的首要技術問題是提供一種能快速精確進行華法林個體化用藥相關SNP位點基因分型的方法。本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供一種快速能精確進行華法林個體化用藥相關SNP位點基因分型的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案:一種能快速精確進行華法林個體化用藥相關SNP位點基因分型的方法，該方法通過提取人的外周血白細胞基因組DNA，采用Taqman探針的方法測定受試者的CYP2C9*3(1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)兩個位點的基因型。一組能快速精確進行華法林個體化用藥相關SNP位點基因分型的引物，該引物能特異性的擴增出CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)位點的擴增產物，一組能快速精確進行華法林個體化用藥相關SNP位點基因分型的探針，該探針能特異性的結合在目的片段， 通過PCR擴增實現(xiàn)熒光信號的倍增。其核心是利用Taq酶的3’ _5’外切核酸酶活性，切斷探針，產生熒光信號。

具有序列表SEQ ID No:1到10所示的堿基序列:其中SEQ ID No:1是CYP2C9 *3 (1061 A/C)，SEQ ID No:10 是 VKORCl (-1639G/A), SEQIDNo:2 和 3 所示序列為 CYP2C9*3(1061 A/C)位點F和R引物序列，SEQ ID No:4和5所示序列為VKORCl (-1639G/A)位點F和R引物序列。SEQ ID No:6和7所示序列為CYP2C9氺3 (1061A/C)位點FAM和HEX探針序列，SEQ ID No:8和9所示序列為VKORCl (-1639G/A)位點FAM和HEX探針序列。本發(fā)明提供第一組引物，其特征在于，所述引物為下列序列所示的引物對:F 引物 5，-TGCAAGACAGGAGCCACATG-3’ (SEQ ID No:2)R 引物 5，-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3，(SEQ ID No:3)本發(fā)明還提供第一組探針，其特征在于，所述探針為下列序列所示的探針:HEX 探針 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ; (SEQ ID No:6)，和FAM 探針 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID No:7)。進一步，本發(fā)明的第一組探針的5，端標記有報告基因，3，端標記有熒光淬滅基團。優(yōu)選所述探針的5’端標記的報告基因是FAM或VIC，3’端標記的熒光淬滅基團是TAMRA。本發(fā)明還提供上述引物或者探針在制備檢測CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點的試劑盒中的應用。所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點優(yōu)選和華法林個體化用藥相關。本發(fā)明提供第一種試劑盒，其特征在于，包括上述檢測CYP2C9*3(1061A/C)多態(tài)性位點的引物的核酸分子。該試劑盒優(yōu)選進一步包括上述任一探針，更優(yōu)選的是，所述試劑盒中引物和探針的含量為F引物0.5 μ 1，R引物0.5 μ 1，F(xiàn)AM探針0.1 μ 1，HEX探針0.1 μ I。本發(fā)明還提供一種上述試劑盒在檢測CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點中的應用，優(yōu)選的所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點和華法林個體化用藥相關。
本發(fā)明還提供第二組引物，其特征在于，所述引物為下列序列所示的引物對:F 引物 5，-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3’ (SEQ ID No:4)R 引物 5，-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3，(SEQ ID No:5)。本發(fā)明還提供第二組探針，其特征在于，所述探針為下列序列所示的探針:HEX 探針 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ; (SEQ ID No:8)，和FAM 探針 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ ID No:9)。進一步，本發(fā)明的第二組探針的5，端標記有報告基因，3，端標記有熒光淬滅基團。優(yōu)選所述探針的5’端標記的報告基因是FAM或VIC，3’端標記的熒光淬滅基團是TAMRA。本發(fā)明提供一種上述第二組引物或者第二組任一探針在制備檢測VKORCl(-1639G/A)多態(tài)性位點的試劑盒中的應用。所述VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點優(yōu)選和華法林個體化用藥相關。本發(fā)明還提供第二種試劑盒，其特征在于，包括第二組引物的核酸分子。優(yōu)選，所述試劑盒還包括上述任一第二組探針。進一步，所述試劑盒中的核酸分子含量優(yōu)選F引物0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針 0.1 μ 1，HEX 探針 0.1 μ I。本發(fā)明還提供上述第二種試劑盒在檢測VK0RC1(_1639G/A)多態(tài)性位點中的應用。優(yōu)選的，所述VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點和華法林個體化用藥相關。本發(fā)明還提供第三組引物，其特征在于，所述引物為第一組和第二組引物對:F 引物 5，-TGCAAGACAGGAGCCACATG-3’ (SEQ ID No:2)R 引物 5，-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3，(SEQ ID No:3)，和F 引物 5，-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3’(SEQ ID No:4)R 引物 5，-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3，(SEQ ID No:5)本發(fā)明還提供第三組探針，其特征在于，所述探針為第一組和第二組探針:HEX 探針 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ; (SEQ ID No:6)，F(xiàn)AM 探針 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID No:7)，和HEX 探針 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ; (SEQ ID No:8)，F(xiàn)AM 探針 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ I D No:9)。進一步，本發(fā)明的第三組探針的5，端標記有報告基因，3，端標記有熒光淬滅基團。優(yōu)選所述探針的5’端標記的報告基因是FAM或VIC，3’端標記的熒光淬滅基團是TAMRA。本發(fā)明還提供上述第三組引物或者任一探針在制備聯(lián)合檢測CYP2C9*3(1061A/C)多態(tài)性位點和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點的試劑盒中的應用。所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點優(yōu)選和華法林個體化用藥相關。本發(fā)明提供第三種試劑盒，其特征在于，包括上述第三組引物的核酸分子。該試劑盒優(yōu)選進一步包括上述第三組任一探針，更優(yōu)選的是，所述試劑盒中每對引物和探針的含量為 F 引物 0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針 0.1 μ 1，HEX 探針 0.1 μ I。本發(fā)明還提供一種上述第三組試劑盒在聯(lián)合檢測CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點中的應用，優(yōu)選的所述CYP2C9*3 (1061A/C)多態(tài)性位點和VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點和華法林個體化用藥相關。進一步，一種能快速精確進行華法林個體化用藥相關SNP位點基因分型的試劑盒(10人份)，由以下試劑組成:
TaqMan* Genotyping Master Mix28 μ I, F 引物 0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針
0.1 μ 1，HEX探針0.1 μ 1，余量為超純水，總體積為50μ I。F和R引物是序列表SEQ ID No:2和3，或SEQ ID No:4和5所示的堿基序列。FAM和HEX探針是序列表SEQ ID No:6和7，或SEQID No:8和9所示的堿基序列。試劑盒保存溫度為-20度。本發(fā)明具有以下優(yōu)點:使用了目前國際上普遍認同的TaqMan探針技術對CYP2C9*3 (1061 A/C)和VKORCl (-1639G/A)進行基因分型，其原理主要是，在TaqMan探針法的PCR反應體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5’端標記有報告基因，如FAM，VIC等，3’端標記有熒光淬滅基團，如TAMRA等。當探針完整的時候，報告基因所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其3’ _5’外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。



圖1CYP2C9*3 (1061 A/C)和 VKORCl (-1639G/A)各基因型的 TaqMan 基因分型圖譜。圖中紅點代表等位基因X，綠點代表等位基因XY，藍點代表等位基因Y。A圖為CYP2C9*3(1075 A/C)(rsl057910)探針分型結果，綠點為 CYP2C9*l/*3，紅點為 CYP2C9*1/*1 ;B 圖為VKORCl (-1639A/G) (rs9923231)探針分型結果，紅點為 VKORCl (-1639A/A)，藍點為 VKORCl(-1639G/G)，綠點為 VKORCl (-1639A/G)圖2CYP2C9*3 (1061 A/C)和 VKORCl (-1639G/A)各基因型的 DNA 測序圖譜。a圖為VKORCl (-1639G/A)位點的DNA測序圖，共有三種基因型分別是-1639A/A, -1639G/A和-1639G/G ；b圖為CYP2C9*l/*3位點的DNA測序圖，共有兩種基因型分別是CYP2C9*1/*1和 CYP2C9*l/*3。下面結合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，并非對發(fā)明的限定，依照本領域公知的現(xiàn)有技術，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
具體實施例方式實施例一種能用于快速精確華法林個體化用藥相關基因SNP位點基因分型的試劑盒一、試劑盒成分、使用方法及結果1.PCR擴增試劑:10人份量
權利要求
1.一種引物，其特征在于，所述引物為下列序列所示的一對或者兩對引物對:F 引物 5' -TGCAAGACAGGAGCCACATG-3' (SEQ ID No:2),R 引物 5' -GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3' (SEQ ID No: 3 )和 / 或F 引物 5' -AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3' (SEQ ID No:4),R 引物 5' -TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3' (SEQ ID No:5)。
2.一種探針，其特征在于，所述探針為下列序列所示的一組或者兩組探針:HEX 探針 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ;(SEQ ID No:6), FAM 探針 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID 吣:7)，和/或HEX 探針 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ;(SEQ ID No:8), FAM 探針 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ ID No:9)。
3.如權利要求2所述的探針，其中所述探針的5’端標記有報告基因，3’端標記有熒光淬滅基團，優(yōu)選所述探針的5’端標記的報告基因是FAM或VIC，3’端標記的熒光淬滅基團是 TAMRA。
4.權利要求1所述的引物或權利要求2-3的任一探針在制備檢測CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點的試劑盒中的應用。
如權利要求4的應用，所述CYP2C9*3 (1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點和華法林個體化用藥相關。
5.一種試劑盒，其特征在于，包括如權利要求1所述的引物。
6.如權利要求6的試劑盒，其進一步包括如權利要求2-3的任一探針。
7.如權利要求7的試劑盒，所述每個引物和探針的含量為:F引物0.5μ 1，R引物·0.5 μ 1，F(xiàn)AM 探針 0.1 μ I, HEX 探針 0.1 μ I。
8.權利要求6-8任一所述的試劑盒在檢測CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl(-1639G/A)多態(tài)性位點中的應用。
9.如權利要求10的應用，所述CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多態(tài)性位點和華法林個體化用藥相關。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于快速檢測華法林個體化用藥相關基因SNP位點的試劑盒及其檢測方法，屬于生物醫(yī)學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術。本發(fā)明通過抽取人外周血DNA，通過Taq man探針特異性PCR擴增后進行熒光信號分析，對CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)兩個多態(tài)性位點進行快速精確基因分型。本發(fā)明提供檢測上述多態(tài)性位點的引物、探針和試劑盒，以及該引物和探針制備試劑盒中的用途，以及根據(jù)上述多態(tài)性位點檢測結果確定患者的華法林用量的用途，該用途能夠有效的減少華法林用量相關不良事件的發(fā)生和血栓性疾病的預防?？梢杂糜谂R床需要服用華法林的各類患者的輔助診斷、治療。
文檔編號C12Q1/68GK103146692SQ20131005512
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權日2013年2月21日
發(fā)明者丁虎, 汪道文 申請人:丁虎, 汪道文