專利名稱：高產(chǎn)γ-氨基丁酸的植物乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)Y-氨基丁酸的新菌株-植物乳桿菌(Lactobacillus
plantarum) LW106,及其在微生物發(fā)酵制備、-氨基丁酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生理及醫(yī)學(xué)研究證實(shí)Y-氨基丁酸是人腦中重要的活性物質(zhì)，但人體Y-氨基丁酸的積累隨著年齡的增長和精神壓力變得異常困難。因此外源補(bǔ)充Y-氨基丁酸使其維持在正常水平對人體尤其對于失眠、抑郁、高壓、更年期、老年人群的健康十分重要，研究表明每天攝入3(T50mg天然Y-氨基丁酸就能起到十分理想的保健作用。由于用量微少，
Y-氨基丁酸還可同其它營養(yǎng)功能因子配伍，用于普通食品和保健食品，因此Y -氨基丁酸具有良好的市場前景。利用天然物質(zhì)及采用生物技術(shù)生產(chǎn)的Y-氨基丁酸可視為天然Y-氨基丁酸，較化學(xué)法合成Y-氨基丁酸具有更好安全性和吸收性。因此，應(yīng)用生物技術(shù)制造高含Y-氨基丁酸的配料和食品是滿足Y-氨基丁酸巨大市場需求的主要手段。乳酸菌作為一種公認(rèn)為安全的微生物，可通過生物轉(zhuǎn)化高效制備Y-氨基丁酸。與動物性乳酸菌相比，植物乳酸菌具有更強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力，因此更有利于Y-氨基丁酸生物合成。目前已分離篩選短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等產(chǎn)Y -氨基丁酸的植物乳酸菌。植物乳桿菌是一種重要的植物乳酸菌，其發(fā)酵過程中能產(chǎn)出特有的乳酸桿菌素，具有天然防腐作用，其產(chǎn)出的酸性物質(zhì)能降解重金屬，其3葡萄糖苷酶具有較高的活性，具有減毒作用，此外植物乳桿菌還具有合成共軛亞油酸的能力，2009年植物乳桿菌被批準(zhǔn)為新資源食品。因此植物乳桿菌是一種優(yōu)良Y-氨基丁酸生產(chǎn)菌種。目前已分離得到多株產(chǎn)Y-氨基丁酸的植物乳桿菌。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)梁巖等篩選到一株產(chǎn)Y-氨基丁酸的植物乳桿菌S35,產(chǎn)量為4.52g/L,范杰等篩選到一株產(chǎn)Y -氨基丁酸的植物乳桿菌，產(chǎn)量為4.98g/L ;浙江師范大學(xué)蔣冬花分離到一株植物乳桿菌，Y -氨基丁酸產(chǎn)量為約4g/L ;浙江工業(yè)大學(xué)丁興等分離到一株植物乳桿菌，Y -氨基丁酸產(chǎn)量為0.527g/L，但其研究成果中產(chǎn)GABA能力都不高，也很少能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，從乳酸菌中篩選高產(chǎn)GABA的功能性植物乳酸菌對GABA產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人類健康均具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前選育的產(chǎn)Y-氨基丁酸植物乳酸菌產(chǎn)Y-氨基丁酸能力不強(qiáng)等問題，本發(fā)明提供一株利用固體雙層平板快速高通量篩選法從自然發(fā)酵泡菜中篩選獲得的高產(chǎn)
Y-氨基丁酸的乳酸菌菌株-植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Lff106及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一株高產(chǎn)Y -氨基丁酸的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LWl06,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，郵編100101，保藏編號為:CGMCCN0.5655，保藏日期為:2011年12月26日，分類命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。該菌株MRS固體培養(yǎng)基上菌落為乳白色，小，呈圓形，中央凸起，表面光滑；顯微鏡下細(xì)胞呈短桿狀，有時(shí)成對或成鏈狀排列；革蘭氏染色陽性，兼性厭氧；該菌株接觸酶、氧化酶、葡萄糖產(chǎn)氣、精氨酸產(chǎn)氨、明膠液化、淀粉水解、硝酸還原、V.P.反應(yīng)均為陰性，API試劑鑒定該菌株與植物乳桿菌的同源性為99.7% ;該菌株16SrRNA序列與植物乳桿菌的同源性達(dá)到99%。以上形態(tài)學(xué)、生理生化及16SrRNA序列鑒定該菌株為植物乳桿菌。

本發(fā)明還涉及所述的植物乳桿菌LW106在微生物發(fā)酵制備Y -氨基丁酸中的應(yīng)用。具體的，所述應(yīng)用為:將植物乳桿菌LW106接種至含谷氨酸鈉的適用于植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后于發(fā)酵液中獲得Y-氨基丁酸。通常在發(fā)酵培養(yǎng)前，保藏的菌株還需經(jīng)活化培養(yǎng)和種子擴(kuò)大培養(yǎng)。優(yōu)選的，所述微生物發(fā)酵在pH5.(T5.5、28 32 °C下進(jìn)行。具體的，利用所述植物乳桿菌LW106進(jìn)行微生物發(fā)酵制備Y -氨基丁酸的過程可如下:①挑取適量試管穿刺菌種接入MRS液體培養(yǎng)基，28^320C，活化培養(yǎng)18 24h ；②在含f 5g/L谷氨酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基(一級種子培養(yǎng)基)中，按19T5% (v/v)的接種量接種經(jīng)活化的培養(yǎng)液，于28 32°C下靜置培養(yǎng)18 24h作為一級種子液；③在含2(T25g/L谷氨酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基(二級種子培養(yǎng)基)中，按19T5% (v/v)的接種量接種一級種子培養(yǎng)液，于28 32°C下靜置培養(yǎng)36 48h作為二級種子液；④在含4(T50g/L谷氨酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，按1% 5% (v/v)的接種量接種二級種子培養(yǎng)液，于28 32°C，靜置培養(yǎng)48 120h，培養(yǎng)過程中使用65%磷酸調(diào)節(jié)pH，控制發(fā)酵pH在5 5.5。所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下(不包括添加的谷氨酸鈉):每升培養(yǎng)基中含小麥5 10g，麥麩15 20g，大豆粉5 10g，番茄汁5 10mL，靈芝發(fā)酵殘液l(T50mL，酵母粉5 10g，氯化鈣
0.r0.3g，維生素B60.3^0.5g，余量為自來水，pH為6 8 ;培養(yǎng)基的配制方法為:先將小麥粉、麥麩與大豆粉混合，加入1/3^1/2的水后添加一定量的液化酶，85°C保溫f2h，冷卻至室溫后加入其他成分和水，調(diào)節(jié)pH為6.5飛.8，121°C滅菌2(T30min即可。所述靈芝發(fā)酵殘液為靈芝經(jīng)液體發(fā)酵、去除菌絲體后的發(fā)酵液，發(fā)酵液胞外多糖含量約為0.3^0.5g/L。具體制備方法可如下:(I)菌種活化:挑取靈芝菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基，于28 3(TC恒溫培養(yǎng)6 8d，置4°C冰箱備用；PDA斜面培養(yǎng)基組成:馬鈴薯10(T200g/L，葡萄糖l(T50g/L，瓊脂l(T20g/L, pH自然；(2)種子擴(kuò)大培養(yǎng):活化的斜面菌絲體接入液體種子培養(yǎng)基，在28 30°C、15(T200r/min下振蕩培養(yǎng)4d，得種子液；液體種子培養(yǎng)基組成:馬鈴薯10(T00g/L，葡萄糖l(T50g/L，酵母粉 I 5g/L，磷酸二氫鉀 I 5g/L，MgSO4 7H201 5g/L，pH 自然；(3)發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按3 10%的體積比接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 391:，150 2001'/1^11下振蕩培養(yǎng)6 8(1，得發(fā)酵液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖20 50g/L，酵母粉 I 5g/L，蛋白胨 0.5 2g/L，磷酸二氫鉀 0.5 2g/L，MgSO4 7H200.1 2g/L，pH自然。
上述所得發(fā)酵液離心或過濾去除菌絲體，即得所述靈芝發(fā)酵殘液。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)Y-氨基丁酸的新菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)可以獲得Y -氨基丁酸含量為2(T25g/L的發(fā)酵液，總固形物含量達(dá)到噴霧干燥的要求，經(jīng)噴霧干燥，產(chǎn)品Y-氨基丁酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%以上。本發(fā)明植物乳桿菌LW106來自于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，利用植物乳桿菌LW106生產(chǎn)制備的Y -氨基丁酸不存在安全隱患，達(dá)到食品安全級別。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1:從四川泡菜中篩選植物乳桿菌LW106菌株
(一)培養(yǎng)基快速高通量初篩高產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳酸菌的固體雙層培養(yǎng)基:下層培養(yǎng)基配方為:CaC0320g/L，葡萄糖30g/L，酵母抽取物(粉末)5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸二氨2g/L，醋酸鈉5g/L，硫酸鎂 7H200.5g/L，硫酸錳 7H200.2g/L，吐溫800.lg/L，瓊脂糖f 15g/L，余量為水；上層培養(yǎng)基配方為:谷氨酸鈉50g/L，吐溫805g/L，磷酸吡哆醛
0.5g/L，苯酚0.15g/L，次氯酸鈉溶液(有效氯0.25g/L)，瓊脂糖l(Tl5g/L，余量為水；復(fù)篩MRS液體培養(yǎng)基:谷氨酸鈉5(Tl00g/L，葡萄糖30g/L，酵母抽取物(粉末)5g/L，蛋白胨10g/L,磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸二氨2g/L，醋酸鈉5g/L，MgSO4 7H200.5g/L，MnSO4 7H200.2g/L，吐溫 800.lg/L，余量為水。
(二)方法 取泡菜汁0.5 5mL，進(jìn)行梯度稀釋分別取1(T4、1(T5濃度IOOy L涂布于初篩培養(yǎng)基，28 32°C培養(yǎng)36 48h。挑選周圍藍(lán)綠色水解圈大的單菌落、分離純化，將分離菌株接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59^10%谷氨酸鈉的復(fù)篩培養(yǎng)基，28 32°C培養(yǎng)36 48h，取發(fā)酵液利用氨基酸自動分析儀分析確認(rèn)Y-氨基丁酸產(chǎn)量。最后，對高產(chǎn)Y-氨基丁酸的分離菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及16s RNA鑒定，篩選乳酸菌并分類。篩選獲得的植物乳桿菌(L.plantarum)Lff106,菌落乳白色,小,呈圓形，中央凸起，表面光滑；顯微鏡下細(xì)胞呈短桿狀，有時(shí)成對或成鏈狀排列；無鞭毛，不運(yùn)動，無孢子；革蘭氏染色陽性，兼性厭氧；API鑒定該菌株與植物乳桿菌的同源性為99.7% ；16S rRNA序列與植物乳桿菌的同源性達(dá)到99%。實(shí)施例2:植物乳桿菌(L.plantarum) Lff106用于Y -氨基丁酸高效制備的方法(—)菌株保藏編號為:CGMCCN0.5655 的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) Lff106 ；(二)培養(yǎng)基配方活化培養(yǎng)基(MRS液體培養(yǎng)基):葡萄糖30g/L，酵母抽取物(粉末)5g/L，蛋白胨IOg/L，磷酸氫二鉀 2g/L，檸檬酸二氨 2g/L，醋酸鈉 5g/L，MgSO4 7H200.5g/L，MnSO4 7H200.2g/L，吐溫800.lg/L，瓊脂糖l(Tl5g/L，自然pH，余量為自來水；一級種子培養(yǎng)基:谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3g/L的MRS液體培養(yǎng)基，MRS液體培養(yǎng)基配方同上；二級種子培養(yǎng)基:谷氨酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，每IL發(fā)酵培養(yǎng)基配方:每升培養(yǎng)基中含小麥8g,麥麩18g,大豆粉8g,番爺汁8mL,靈芝發(fā)酵殘液30mL,酵母粉8g，氯化鈣0.2g，維生素B60.5g，余量為自來水，pH為6 8。培養(yǎng)基的配制方法為:先將小麥粉、麥麩與大豆粉混合，加入1/3^1/2的水后添加ImL的耐高溫a -淀粉酶(博立，酶活為20000U)，85°C保溫I 2h，冷卻至室溫后加入其他成分和水，調(diào)節(jié)pH為6.5 6.8，121°C滅菌20 30min即可。

靈芝發(fā)酵殘液制備過程如下:(I)菌種活化:挑取泰山赤靈芝I號(TL-1)菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基，于28°C恒溫培養(yǎng)6d，置4°C冰箱備用；PDA斜面培養(yǎng)基組成:馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L, pH自然;(2)種子擴(kuò)大培養(yǎng):活化的斜面菌絲體接入液體種子培養(yǎng)基，在28°C、150r/min下振蕩培養(yǎng)4d，得種子液；液體種子培養(yǎng)基組成:馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L，磷酸二氫鉀 3g/L，MgSO4 7H201.5g/L，pH 自然;(3)發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按3%的體積比接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28°C,150r/min下振蕩培養(yǎng)6d，得發(fā)酵液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖35g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨 lg/L，磷酸二氫鉀 lg/L, MgSO4 7H200.5g/L，pH 自然。上述所得發(fā)酵液離心或過濾去除菌絲體，即得所述靈芝發(fā)酵殘液。
(三)方法從保藏的MRS固體穿刺培養(yǎng)基中挑取適量菌種接入MRS液體培養(yǎng)基，28 32°C靜置活化20h ；250mL三角瓶中裝入IOOmL —級種子培養(yǎng)基，取靜置培養(yǎng)20h的活化培養(yǎng)液，按5%的接種量接種后，28 32°C靜置培養(yǎng)20h作為一級種子液；6L具塞三角瓶中裝入5L 二級種子培養(yǎng)基，取一級種子液，按5%的接種量接種后，28 32°C靜置培養(yǎng)40h作為二級種子液；700L發(fā)酵罐中裝入500L大麥發(fā)酵培養(yǎng)基，按3%的接種量接種后，28 32°C靜置培養(yǎng)72h，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)過程中使用65%磷酸調(diào)節(jié)pH，控制發(fā)酵pH在5.5。此制備方法可得高Y-氨基丁酸含量的發(fā)酵液，經(jīng)氨基酸酸自動分析儀檢測為:21.8g/L，谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化率為:90%。發(fā)酵液經(jīng)濃縮，加入玉米淀粉噴霧干燥可得到Y(jié)-氨基丁酸含量在20% 25%的粉末產(chǎn)品。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)Y -氨基丁酸的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LW106,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，郵編100101，保藏編號為:CGMCC N0.5655，保藏日期為:2011年12月26臼。
2.如權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌LW106在微生物發(fā)酵制備Y-氨基丁酸中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述微生物發(fā)酵在ρΗ5.(Γ5.5、28 32°C下進(jìn) 行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸的植物乳桿菌(L.plantarum)LW106，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，郵編100101，保藏編號為CGMCC NO.5655，保藏日期為2011年12月26日。本發(fā)明菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)可以獲得γ-氨基丁酸含量為20~25g/L的發(fā)酵液，總固形物含量達(dá)到噴霧干燥的要求，經(jīng)噴霧干燥，產(chǎn)品γ-氨基丁酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%以上。本發(fā)明植物乳桿菌LW106來自于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，利用植物乳桿菌LW106生產(chǎn)制備的γ-氨基丁酸不存在安全隱患，達(dá)到食品安全級別。
文檔編號C12R1/25GK103146599SQ201310045139
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者吳學(xué)良, 陳如楚, 徐娟, 吳慶其 申請人:浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司