專利名稱：一株高效轉(zhuǎn)化黃姜皂苷為薯蕷皂苷元的菌種及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及鞘氨醇單胞菌屬sp.) ST-O3及其高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法。
背景技術(shù)：
薯蕷皂苷苷元是生產(chǎn)留體激素類藥物的重要基礎(chǔ)原料。留體激素藥物是僅次于抗生素的第二類藥物，具有很強(qiáng)的抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克等藥理作用。近年來，甾體藥物在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，被廣泛用于治療風(fēng)濕病、心血管、膠原性病癥、淋巴白血病、人體器官移植、抗腫瘤、細(xì)菌性腦炎、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)、老年性疾病等。目前大概有超過一千種留體激素類藥物是由薯蕷皂苷元合成或者半合成的。國內(nèi)外薯蕷皂苷元的提取工藝主要是直接酸水解法和預(yù)發(fā)酵法，以及一些在此兩種方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)等方法，這些方法中均有酸水解這一工序，產(chǎn)生大量含酸廢液，對環(huán)境的污染比較嚴(yán)重。利用微生物進(jìn)行薯蕷皂苷元的轉(zhuǎn)化可以實(shí)現(xiàn)綠色高效的生產(chǎn)，能夠有效的克服化學(xué)合成方法的毒性大、專一性不強(qiáng)和轉(zhuǎn)化效率不高的弊端。

黃姜中的皂苷成分復(fù)雜，而且多數(shù)是脂溶性化合物，水溶性很低，因此轉(zhuǎn)化過程中底物投料濃度和轉(zhuǎn)化效率都非常低，相對于研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)木霉屬和曲霉屬的一些微生物，雖然將黃姜中的皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的條件溫和，環(huán)境友好，但是這些微生物的轉(zhuǎn)化效率低，副產(chǎn)物多，并不能真正的進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)。因此篩選一株高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的微生物具有非常重要的意義，而目前關(guān)于鞘氨醇單胞菌屬用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的研究未見報(bào)道，其生產(chǎn)薯蕷皂苷元的高收率更是工業(yè)生產(chǎn)的一大優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株高效轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯蕷皂苷元的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.) ST-03,以及利用該菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯菌阜苷元的方法,可達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求。本發(fā)明的發(fā)明人從實(shí)驗(yàn)室保存的真菌中篩選到一株轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯蕷皂苷元的微生物，該菌株為鞘氨醇單胞菌屬sp.)ST_03,保藏在位于北京市朝陽區(qū)大屯路的中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6836，分類命名為Sphingomonas sp.,保藏日期為2012年11月19日。應(yīng)用上述微生物轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，其步驟如下:
(1)米用保藏號為CGMCCN0.6836的鞘氨醇單胞菌屬sp.) ST-03為生產(chǎn)菌種，按照常規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到查氏培養(yǎng)基上；
(2)制備ST-03菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物:挑取步驟(I)的查氏固體培養(yǎng)基上的ST-03菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有30-50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為30-40°C，置搖床上以170-220 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24-28 h至對數(shù)生長中期，即得到ST-03菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(2)中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以3-7%(w/w)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為500 mL錐形瓶中裝60-90 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30_40°C，在170-210 r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24-28 h，獲得發(fā)酵液。(4)生物轉(zhuǎn)化:精確稱取適量黃姜皂苷，投入步驟(3)中的菌體發(fā)酵液，使其終濃度為3-5 g/L，在轉(zhuǎn)化溫度37°C，170-210 r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化140-170 h，即得轉(zhuǎn)化液。(5)產(chǎn)物檢測:將步驟(4)的轉(zhuǎn)化液在7000-11000 r/min下離心4-9 min，沉淀用與轉(zhuǎn)化液同體積的60 0C _90°C石油醚抽提3次，合并抽提液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋至有晶體出現(xiàn)，乙腈復(fù)溶晶體并通過0.22 μ m的有機(jī)膜過濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析薯菌阜苷兀的含量。其中步驟(I)中所述的查氏固體培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖30 g/L，硝酸鈉3g/L，磷酸氫二鉀I g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，七水硫酸鐵0.01 g/L，水1000 mL,自然pH。在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ;步驟(2)所述種子培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖18 8/1，硫酸銨1.5 g/L，硝酸鈉1.5 g/L，氯化鈉4 g/L，磷酸氫二鉀0.8 g/L，七水硫酸鎂0.4 g/L，氯化鉀0.4 g/L，七水硫酸鐵0.02 g/L，水1000 mL，自然pH，在121°C高壓蒸汽下滅菌20 min;步驟(3)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖18 g/L，硫酸銨1.5 g/L，硝酸鈉1.5 g/L，氯化鈉4 g/L，磷酸氫二鉀0.8 g/L，七水硫酸鎂0.4 g/L，氯化鉀0.4 8/1，七水硫酸鐵0.02 g/L，黃姜皂苷4 g/L，水1000 mL，自然pH，121°C高壓蒸汽下滅菌20 min。本發(fā)明所述的鞘氨醇單胞菌屬sp.)ST_03菌株首次發(fā)現(xiàn)可轉(zhuǎn)化生成薯蕷皂苷元，并且能達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求，是一株極具開發(fā)研究價(jià)值的生產(chǎn)菌株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1醇提法得到黃姜皂苷
將鮮黃姜切成0.5 Cm左右小塊，80 °C烘干，粉碎機(jī)粉碎。圓底燒瓶中加入1000 ml無水乙醇，再倒入100 g黃姜粉末，加熱至微沸，回流提取3次，每次4 h，過濾，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到醇溶皂苷。稱取圓底燒瓶和皂苷的重量a，加入150 mL去離子水，超聲使皂苷與水充分混溶，倒出皂苷，稱量圓底燒瓶的重量b，a-b即是醇溶皂苷的重量。實(shí)施例2酶解法得到黃姜皂苷
稱取100 g干黃姜粉，加入3000 mL水中，煮沸I h，冷卻，調(diào)整pH為6.0，加入中溫淀粉酶0.5 mL,65 °C溫育I h。冷卻后調(diào)整pH為6.5，加入耐高溫淀粉酶0.5 mL,80 °C溫育I h。冷卻，調(diào)整pH為5.5，加入液體糖化酶I mL，60 °C溫育8 h。冷卻，5000 rpm離心20min,取沉淀，60°C烘干至恒重，稱重。實(shí)施例3得到黃姜皂苷
稱取鮮黃姜312 g (約合100 g干黃姜)粉碎，磨漿。加去離子水150 mL洗滌，經(jīng)兩層紗布擠壓過濾。濾渣加150 mL去離子水洗滌，重復(fù)過濾。①濾液靜置5 h，物料分為3層，上層為清液(紅褐色)，中間層為黃姜懸濁液，下層為淀粉(白色)。吸取上清液，傾倒懸濁液，可得到下層的淀粉，60 °C烘干稱重。②濾渣，即纖維渣，重復(fù)水洗6次(每次用水150 mL)，得纖維素，105°C烘干，稱重。水洗液抽濾，濾渣與①所得懸濁液合并。調(diào)整懸濁液pH為6，加入耐高溫淀粉酶0.12mL和糖化酶1.8 mL, 60 °C酶解6 h。酶解結(jié)束后7000 rpm離心15 min，取沉淀60 °C干燥得皂苷，稱重。
實(shí)施例4利用鞘氨醇單胞菌屬sp.) ST_3轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯菌阜苷元
(I)制備鞘氨醇單胞菌屬sp.) ST-3菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物
挑取固體查氏培養(yǎng)基上的鞘氨醇單胞菌屬sp.)ST_3菌株一環(huán),接種在裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30°C下，置于搖床上以180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24-28 h至對數(shù)期，即制得鞘氨醇單胞菌屬sp.)ST_3菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比為:蔗糖18 8/1，硫酸銨1.5 g/L，硝酸鈉1.5 g/L，氯化鈉4 g/L，磷酸氫二鉀0.8 g/L，七水硫酸鎂0.4 g/L，氯化鉀0.4 g/L，七水硫酸鐵
0.02 g/L，水1000 mL，pH自然，121°C高壓蒸汽下滅菌20 min。(3)搖瓶發(fā)酵:將上述鞘氨醇單胞菌屬sp.)ST_3菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以3-7%(w/w)的接種量接種在裝有已滅菌的25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30-40°C條件下，置于搖床上以140-170 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵24-28 h，菌體進(jìn)入對數(shù)中后期。(4)生物轉(zhuǎn)化:精確稱取適量黃姜皂苷，投入步驟(3)中的菌體發(fā)酵液，使黃姜皂苷終濃度為5 g/L，在轉(zhuǎn)化溫度30°C，200-220 r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化140-170 h。實(shí)施例5石油醚提取轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的薯蕷皂苷元
7000-11000 r/min離心轉(zhuǎn)化液15 min,取沉淀,加入石油醚(沸點(diǎn)60 °C 90 °C ) 15mL超聲提取3次，每次4 h，合并提取液，80 °C濃縮至15 mL左右。所得即是薯蕷皂苷元的石油醚溶液。
權(quán)利要求
1.一株高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的菌株，該菌株為鞘氨醇單胞菌屬(.Sphingomonas sp.) ST-03,保藏在位于北京市朝陽區(qū)大屯路的中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6836，分類命名為Sphingomonas sp.,保藏日期為2012年11月19日。
2.利用鞘氨醇單胞菌屬sp.) ST-03 (保藏編號為CGMCC N0.6836)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，其特征為:500 mL三角瓶裝60-90 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量按體積比為3-7%，培養(yǎng)溫度30-40°C，搖床轉(zhuǎn)速170-210 r/min，培養(yǎng)26 h后投入一定量的底物黃姜皂苷，繼續(xù)轉(zhuǎn)144 h ;所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:葡萄糖18-40 g/L，NaNo3 0.2-1.9g/L, (NH4)2SO4 0.2-1.9 g/L，NaCl 1.5-4.5 g/L, K2HPO4 0.2-1.2 g/L, MgSO4 0.2-1.2 g/L,FeS04.7 H2O 0.02-0.12 g/L`, pH 6.0_7.5，121°C高壓蒸汽下滅菌 20 min。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)ST-03及其高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，能達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求，是一株極具開發(fā)研究價(jià)值的生產(chǎn)菌株。
文檔編號C12P33/20GK103103154SQ20131004061
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月3日
發(fā)明者李會(huì), 史勁松, 張佳佳, 許正宏, 馬洋, 謝婉玲, 張曉梅, 李恒 申請人:江南大學(xué)