專利名稱：一種用于降解纖維素的混合酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于畜牧業(yè)飼料加工領(lǐng)域，具體涉及一種用于降解纖維素的混合酶。
背景技術(shù)：
纖維素酶是我國(guó)畜禽日糧中應(yīng)用比較普遍的酶制劑種類之一，生產(chǎn)和銷售纖維素酶的企業(yè)有很多，如何對(duì)眾多的纖維素酶產(chǎn)品進(jìn)行篩選，為不同品種、不同生長(zhǎng)階段的豬選擇經(jīng)濟(jì)有效的纖維素酶，則顯得十分必要。我國(guó)地方品種豬通過(guò)長(zhǎng)期的選育與飼養(yǎng)，大多具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且在長(zhǎng)期飼喂過(guò) 程中形成了使用纖維性飼料的習(xí)慣。隨著對(duì)日糧纖維理化特性和營(yíng)養(yǎng)生理作用研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)一定水平的日糧纖維不僅能夠調(diào)節(jié)胃腸道的微生態(tài)平衡，而且還能夠增強(qiáng)豬的體質(zhì)。因此，日糧纖維在豬的生理代謝上有著重要作用，特別是在地方品種豬上這種作用尤為明顯。粗纖維雖然具有供能、調(diào)節(jié)腸道生態(tài)環(huán)境等正面營(yíng)養(yǎng)作用，但也具有適口性差、影響?zhàn)B分吸收、環(huán)境污染等負(fù)面營(yíng)養(yǎng)作用。因此，根據(jù)地方品種耐粗飼的特性，通過(guò)在高纖維水平日糧中添加能夠降解纖維素的酶來(lái)克服其負(fù)面營(yíng)養(yǎng)作用，利用其正面營(yíng)養(yǎng)作用來(lái)提高地方品種豬的生產(chǎn)性能，同時(shí)解決飼料資源短缺及環(huán)境污染等問(wèn)題就具有重要的意義。但目前用于豬飼料領(lǐng)域的纖維素酶酶系酶功能單一，不能充分滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。隨著生物工程技術(shù)以及基因克隆技術(shù)的發(fā)展，生產(chǎn)纖維素酶的菌株變得越來(lái)越多，產(chǎn)量也越來(lái)越大，這就使得纖維素酶的酶系越來(lái)越豐富。我們可以將不同菌株產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行配合來(lái)解決單一酶系酶功能不全的劣勢(shì)，這樣就使得我們可以更多地去選擇高纖維含量的飼料原料，來(lái)緩解人畜爭(zhēng)糧的矛盾。目前，市場(chǎng)上沒(méi)有一種產(chǎn)品是將不同纖維素酶配合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)纖維素酶的高效利用的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于降解纖維素的混合酶，即將三種纖維素酶混合制成復(fù)合酶，以克服單一酶系功能不全的劣勢(shì)。本發(fā)明的用于降解纖維素的混合酶，由纖維素C1酶、纖維素Cx酶和纖維素β 2葡萄糖苷酶組成，且纖維素C1酶、纖維素Cx酶和纖維素β 2葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為3 3 :2。為了增加混合酶降解纖維素的效果，在混合酶中加入了雙歧桿菌活菌，加入的雙歧桿菌活菌的濃度為I 5Χ 107_9CFU/g。本發(fā)明的混合酶作為添加劑應(yīng)用在豬飼料的制備中。本發(fā)明的復(fù)合纖維素酶克服了單一酶系功能不全的劣勢(shì)，能夠提高動(dòng)物生產(chǎn)的生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分消化率和動(dòng)物利用纖維素的能力，起到了一舉多得作用。復(fù)合纖維素酶所需的三種纖維素酶都是市場(chǎng)上常見的商業(yè)產(chǎn)品，有效含量高，價(jià)格低廉，是國(guó)家批準(zhǔn)飼用的飼料添加劑，不存在任何安全問(wèn)題。本發(fā)明的混合酶成本低，使用方便，易于在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證在飼料中添加復(fù)合纖維素酶能夠顯著提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能、氨基酸表觀消化率、料重比和常規(guī)養(yǎng)分消化率。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用到的纖維素C1酶為內(nèi)切葡聚糖酶，可作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4糖苷鍵，切斷長(zhǎng)鏈的纖維素分子，形成小分子的纖維素，分解出新的非還原性末端。第二種Cx酶為外切葡聚糖酶，與游離末端結(jié)合，作用于非還原端切下纖維二糖單位，分解出一個(gè)纖維二糖分子。第三種纖維素酶是β 2葡萄糖苷酶，作用是將纖維二糖水解形成動(dòng)物機(jī)體能夠吸收的葡萄糖分子。這三種纖維素酶可選用市售的產(chǎn)品，例如于上海晨易生物科技有限公司、蘇柯漢(濰坊)生物工程有限公司、和氏璧生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。本發(fā)明通過(guò)胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化法是來(lái)測(cè)定不同纖維素酶組合對(duì)飼料的干物質(zhì)、粗蛋白的消化率以及還原糖生成量，從中選出最優(yōu)組合的最佳比例，然后再以最優(yōu)酶組合的最佳比例和第三種酶進(jìn)行同樣的兩兩組合，最終來(lái)選出三種酶的最佳添加比例。本發(fā)明的復(fù)合纖維素酶具體制備方法如下將三種酶分別進(jìn)行兩兩組合，每種組合設(shè)定五種比例，分別為0:100,25:75,50:50,75:25,100:0ο每種組合稱取5份5. O g飼料樣品，分別放入300 ml的三角瓶中，分別按0:100、25:75、50:50、75:25、100:0五中比例 添加O. 5%個(gè)水平的兩種纖維素酶組合。每個(gè)樣品加入40 ml胃蛋白酶液(4 mg/ml，溶于O. 9%的生理鹽水中)，用O. 075 mol/1 HCl溶液將pH值調(diào)至2. 5，在溫度為40°C、振蕩速率為50 r/min的恒溫振蕩器上消化4 h,然后加入40 ml胰蛋白酶液(2 mg/ml,溶于O. 9%的生理鹽水中)，用O.1 mol/1 NaOH溶液將pH值調(diào)至7.0，在上述相同條件下再消化4 h。消化結(jié)束后，用已知質(zhì)量的濾紙抽濾消化物，并沖洗3 4次，未消化部分再在60°C下烘干，稱重并儲(chǔ)存。通過(guò)分析，最終確定維素C1酶、纖維素Cx酶和纖維素β 2葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為 3 :3 :2。本發(fā)明的混合酶在上述的配比下可以高效的發(fā)揮三種酶的配合效應(yīng)，比起其它的配比具有更好的纖維素降解率。本發(fā)明的復(fù)合物效果驗(yàn)證1.纖維素酶對(duì)不同品種生長(zhǎng)豬養(yǎng)分消化率及氮平衡的影響各選取5頭體重相近(25± I) kg、健康去勢(shì)的魯農(nóng)2號(hào)生長(zhǎng)豬，分別放入50X150cm規(guī)格的鍍鋅代謝籠中適應(yīng)I周后進(jìn)行試驗(yàn)。豬舍溫度保持在20±1 °C，相對(duì)濕度45% 55%。每天7 00和16 00定量喂料，總喂料量為體重的3% 4% ；自由飲水。采用玉米一豆柏型日糧，參考地方品種豬的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，以地瓜蔓為纖維來(lái)源，提高飼糧的纖維水平(ADF水平)，其它養(yǎng)分含量一致。本試驗(yàn)纖維素酶組合的添加水平分別為0%、0. 05%,O. 1%、0. 15%、O. 2%，S卩1、I1、II1、IV、V五組，其中0%為對(duì)照組。纖維素酶添加時(shí)采用逐級(jí)預(yù)混的原則，以保證纖維素酶混合均勻。試驗(yàn)采用5X5拉丁方設(shè)計(jì)。試驗(yàn)期每期7 d，前5 d為預(yù)試期，于第6、7 d連續(xù)收集48 h的糞樣，混合均勻，按糞樣重的10%、尿樣體積的10%加入10%的H2SO4固氮后于一 20 1的冰箱中保存。結(jié)果表明，在飼料中添加O. 15%的纖維素酶，粗蛋白的消化率比對(duì)照組提高了 4. 42%，酸性洗滌纖維的消化率提高了 4. 0%，氮總利用率提高了 7. 06%ο2.纖維素酶對(duì)魯農(nóng)2號(hào)生長(zhǎng)豬生產(chǎn)性能的影響選擇健康、初始體重(25 ±1. 5)kg相近的魯農(nóng)2號(hào)生長(zhǎng)豬120頭，公母各半。試驗(yàn)日糧配方采用5. 8%ADF水平的高纖維水平日糧。將復(fù)合纖維素酶添加量設(shè)定為0%、0. 05%、.O. 10%,O. 15%、0. 20%五個(gè)水平，設(shè)為1、I1、II1、IV、V五組。試驗(yàn)豬隨機(jī)分為5個(gè)處理，每個(gè)
處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)(圈)8頭豬。高床飼養(yǎng)，自由采食，自由飲水。30天試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算料重比和日增重。結(jié)果表明，在飼料中添加O. 15%的復(fù)合纖維素酶能夠有效的提高生產(chǎn)性能，并且能夠明顯的降低料重比。與對(duì)照組相比日增重提高了 4. 12%，料重比降低了 6. 9%。為了提高混合酶的效果，本發(fā)明在混合酶中加入了雙歧桿菌活菌粉。1.1雙歧桿菌活菌粉的制備將瘤胃雙歧桿菌菌種(來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC1. 2273，凍干保藏)接種到PTYG改良液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，培養(yǎng)基上再加入已滅菌的液體石蠟，用以隔絕氧氣，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，37 °C培養(yǎng)32 h ;取活化后的培養(yǎng)液接種到PTYG改良液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量為1:10，37 1恒溫培養(yǎng)32 h。取擴(kuò)大培養(yǎng)液加入無(wú)菌離心管中，4 °C、7000 r/min離心10 min收集菌體(菌泥)，無(wú)菌操作倒出上清液，向離心管中加入保護(hù)劑50 g/L的甘露醇溶液、增量賦形劑100 g/L的脫脂乳粉溶液，混勻，分裝，一 40 °C預(yù)凍1h，使之粘在管壁上，放入真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，至產(chǎn)品含水量為3 %左右即可。稱取O. 5 g左右凍干菌粉，加人一定量滅菌PBS緩沖液，室溫靜置20 min，然后進(jìn)行活菌記數(shù)。試驗(yàn)測(cè)得雙歧桿菌活菌粉中活菌數(shù)為8. 47 X IO9 CFU/g。在80g混合酶(維素C1酶、纖維素Cx酶和纖維素β 2葡萄糖苷酶的質(zhì)量分別為30g、30g和20g)中加入雙歧桿菌活菌粉10g，混合均勻完成制備。上述添加有雙歧桿菌活菌粉的復(fù)合酶能夠有效的提高纖維素酶的使用效果。在O. 15%纖維素組合酶組中加入雙歧桿菌活菌粉，試驗(yàn)結(jié)束后，與對(duì)照組相比，料重比降低了
11.2%，同時(shí)日增重提高了 8. 6%。而且，雙歧桿菌活菌粉能夠促進(jìn)養(yǎng)分消化率的提高，在纖維素酶對(duì)不同品種生長(zhǎng)豬養(yǎng)分消化率及氮平衡的影響試驗(yàn)中，添加了雙歧桿菌活菌的本發(fā)明的復(fù)合酶，與只添加本發(fā)明纖維素組合酶的對(duì)照組相比，粗蛋白的消化率提高了 5. 76%，酸性洗滌纖維的消化率提高了 4. 4%，氮總利用率提高了 5. 4%。上述結(jié)果證明添加雙歧桿菌可以有效的提高本發(fā)明復(fù)合酶的纖維素降解率。本發(fā)明的復(fù)合酶可以用作飼料添加劑添加在含有纖維素的豬飼料中。
權(quán)利要求
1.一種用于降解纖維素的混合酶，其特征在于，所述的混合酶由纖維素Cl酶、纖維素Cx酶和纖維素β 2葡萄糖苷酶組成，且纖維素Cl酶、纖維素Cx酶和纖維素β 2葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為3 3 :2。
2.權(quán)利要求1所述的混合酶，其特征在于，還加入了雙歧桿菌活菌。
3.如權(quán)利要求2所述的混合酶，其特征在于加入后的雙歧桿菌活菌的濃度為I 5X l(T9CFU/g。
4.權(quán)利要求1或2所述的混合酶作為豬飼料添加劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于降解纖維素的混合酶，由纖維素C1酶、纖維素Cx酶和纖維素β2葡萄糖苷酶組成，且纖維素C1酶、纖維素Cx酶和纖維素β2葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為332。為了增加混合酶降解纖維素的效果，在混合酶中加入了雙歧桿菌活菌粉。本發(fā)明的復(fù)合纖維素酶克服了單一酶系功能不全的劣勢(shì)，能夠提高動(dòng)物生產(chǎn)的生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分消化率和動(dòng)物利用纖維素的能力，起到了一舉多得作用。本發(fā)明的混合酶成本低，使用方便，易于在生產(chǎn)實(shí)踐中推廣。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證在飼料中添加復(fù)合纖維素酶能夠顯著提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能、氨基酸表觀消化率、料重比和常規(guī)養(yǎng)分消化率。
文檔編號(hào)C12N9/42GK103013959SQ20131001736
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者宋春陽(yáng), 姜建陽(yáng), 聶昌林, 倪良振, 遠(yuǎn)德龍 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)