專利名稱：添加高聚木糖提高纖維素酶生產效率的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，涉及在真菌纖維素酶發(fā)酵生產的過程中添加高聚木糖來提高纖維素酶酶活生產效率的方法。技術背景
纖維素是由葡萄糖通過β-l，4-糖苷鍵連接而成的高聚多糖分子。纖維素酶具備水解木質纖維素成糖的能力，這使得其具有廣泛的應用前景，廣泛地應用于造紙、食品、 紡織、飼料、生物能源等領域。纖維素酶為復合酶，由三類酶組成內切葡聚糖酶(EG，內切酶)、外切葡聚糖酶(CBH，外切酶)和β葡萄糖苷酶(BG，β酶)。EG作用于不溶性纖維素的表面，破壞其晶體結構，將內部的纖維素鏈暴露出來使其易于水解；CBH將暴露出來的纖維素鏈水解為2 4個單位的寡糖；BG最終將其降解為葡萄糖單糖。纖維素酶水解纖維素能力是通過多種酶的協(xié)同作用發(fā)揮的，因此纖維素酶整體酶的效果不僅取決于各個酶的自身酶活，同時取決于協(xié)同作用中酶的種類及酶之間的比例。在造紙行業(yè)，使用纖維素內切酶對漿料進行處理后制成的紙張的耐破指數(shù)、撕裂指數(shù)和抗張強度基本保持不變的情況下， 濾水性能得到大幅度改善，有利于造紙成型部的脫水，提高了車速，同時處理后漿料的結晶度得到提高。在纖維素酶的生產中，目前主要局限于利用傳統(tǒng)的方法來提高纖維素酶酶活， 包括利用基因改造和誘變手段得到高產菌株，優(yōu)化培養(yǎng)基配方等方法，在提高產率方面得到了一定的成果。但是還是有必要開發(fā)出新的方法來進一步提高纖維素酶的活力。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種添加高聚木糖提高纖維素酶生產效率的方法，方法簡單，操作容易，提高纖維素酶整體酶活，縮短纖維素內切酶生產時間。
本發(fā)明的技術解決方案是該提高纖維素生產效率的方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)基纖維素物質為碳源，包括稻草秸桿、小麥秸桿、玉米秸桿；纖維素物質 3(T60g/L，微晶纖維素T8g/L，其余營養(yǎng)物質蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 2 5 g/L,KH2PO4 2 g/ L, MgSO4 · 7H20 O. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，冷卻待接種；(2)種子液按培養(yǎng)基質量的5 10%接種，30°C搖床培養(yǎng)1-3天，轉速160rpm，得種子液；(3)發(fā)酵按培養(yǎng)基質量的5 10%接種種子液，發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵溫度30°C，溶氧量不低于20%，通氣量O. Γ0. 3vvm,發(fā)酵前期轉速為250rpm，中期為350rpm，后期為200rpm ;發(fā)酵前期加入高聚木糖，高聚木糖的添加量為2 10g/L。
其中，產纖維素酶真菌包括里氏木霉、斜臥青霉、黑曲霉。
其中，添加高聚木糖不僅是指高聚木糖純物質，還包括含有高聚木糖成分的物質。
本發(fā)明的特征效果是利用高聚木糖會抑制纖維素酶酶制劑的活力現(xiàn)象，在纖維素酶發(fā)酵中添加高聚木糖來刺激生物菌體更快更多的分泌纖維素內`切酶和纖維素酶，導致更高的纖維素酶酶活和更快的纖維素內切酶，高聚木糖的添加量少，纖維素酶整體酶活顯著提高，大幅縮短了纖維素內切酶的生產時間，實際操作簡便可行，經濟效益顯著；通過添加高聚木糖可以使里氏木霉產纖維素內切酶的時間縮短至傳統(tǒng)方法的發(fā)酵時間的15%左右，在保持傳統(tǒng)發(fā)酵時間的情況下纖維素酶整體酶活提高了約20%。


圖1為里氏木霉發(fā)酵產酶曲線圖。
具體實施方式
下面結合具體的實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。本領域技術人員應當理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
以下為纖維素酶整體酶活FPA的定義在50°C、pH 4. 8、每分鐘水解濾紙產生I Mmol葡萄糖所需的酶量定義為I個酶活單位(U);纖維素內切酶CMCA的定義在50°C、pH 4. 8、每分鐘水解羧甲基纖維素鈉(CMCNa)產生I Mmol葡萄糖所需的酶量定義為I個酶活單位(U)。
實施例1 :選用斜臥青霉為生產菌株，配制培養(yǎng)基微晶纖維素3g/L，玉米秸桿 60g/L，蛋白胨 10g/L，(MM)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 3g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 5mg/ L, ZnSO4 · 7Η201. 4mg/L, MnSO4 · 7Η201. 6mg/L,培養(yǎng)基于 50L 發(fā)酵罐裝液 30L, 121°C滅菌 20min，冷卻待接種；按105CFU/mL的孢子終濃度接至液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)3天，轉速160rpm,得種子液；以5%的接種量接種培養(yǎng)好的斜臥青霉的種子液3L,通氣量O.1vvm, 30°C發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵培養(yǎng)第3天時加入終濃度為10g/L的高聚木糖，發(fā)酵7天產酶結束； 測定FPA酶活為4. 2u/ml，其活力與傳統(tǒng)方法斜臥青霉產纖維素酶相比較，F(xiàn)PA提高了約 20%。
實施例2 :選用黑曲霉為生產菌株，配制培養(yǎng)基微晶纖維素3g/L，玉米秸桿40g/ L，蛋白胨 10g/L，(MM)2SO4 5 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 5mg/ L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L,培養(yǎng)基于 50L 發(fā)酵罐裝液量 30L, 121°C滅菌 20min，冷卻待接種；按105CFU/mL的孢子終濃度接至液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)I天，轉速160rpm,得種子液；以5%的接種量接種培養(yǎng)好的斜臥青霉的種子液3L,通氣量O. 3vvm, 30°C發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵培養(yǎng)第3天時加入終濃度為5g/L的高聚木糖，發(fā)酵7天產酶結束；測定FPA酶活為2. 8u/ml，其活力與傳統(tǒng)方法黑曲霉產纖維素酶相比較，F(xiàn)PA提高了約20%。
實施例3 :選用里氏木霉為生產菌株，配制培養(yǎng)基微晶纖維素8g/L，稻草秸桿 30g/L,蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 2 g/L,KH2PO4 2 g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 3g/L，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 5mg/ L, ZnSO4 · 7Η201. 4mg/L, MnSO4 · 7Η201. 6mg/L，培養(yǎng)基于 250mL 的搖瓶裝液量 50mL, 121。。 滅菌20min，冷卻待接種；按105CFU/mL的孢子終濃度接至液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)2 天，以5%的接種量接種培養(yǎng)好的里氏木霉的種子液2. 5mL, 30°C發(fā)酵培養(yǎng)；分別在第O天和第3天時加入終濃 度為2g/L的高聚木糖，發(fā)酵8天結束；發(fā)酵全程測定CMCA和FPA酶活， 最終FPA最高酶活為3. 8u/ml，與傳統(tǒng)方法里氏木霉產纖維素酶相比較，F(xiàn)PA提高了約20% ； CMCA在24小時就已經達到高峰，與傳統(tǒng)方法里氏木霉產纖維素內切酶相比較，發(fā)酵時間縮短至15%左右；具體產酶曲線如圖1所示。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯 而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.添加高聚木糖提高纖維素酶生產效率的方法，其特征是該提高纖維素酶生產效率的方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)基纖維素物質為碳源，包括稻草秸桿、小麥秸桿、玉米秸桿；纖維素物質 3(T60g/L，微晶纖維素T8g/L，其余營養(yǎng)物質蛋白胨 10g/L，(NH4)2SO4 2 5 g/L,KH2PO4 2 g/ L, MgSO4 · 7H20 O. 3g/L, FeSO4 · 7H20 5mg/L, ZnSO4 · 7H201. 4mg/L, MnSO4 · 7H201. 6mg/L 配制培養(yǎng)基，于121°C滅菌20min，冷卻待接種；(2)種子液按培養(yǎng)基質量的5 10%接種，30°C搖床培養(yǎng)1-3天，轉速160rpm，得種子液；(3)發(fā)酵按培養(yǎng)基質量的5 10%接種種子液，發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵溫度30°C，溶氧量不低于20%，通氣量O. Γ0. 3vvm,發(fā)酵前期轉速為250rpm，中期為350rpm，后期為200rpm ;發(fā)酵前期加入高聚木糖，高聚木糖的添加量為2 10g/L。
2.根據(jù)權利要求1所述的添加高聚木糖提高纖維素酶生產效率的方法，其特征是其中，產纖維素酶真菌包括里氏木霉、斜臥青霉、黑曲霉。
3.根據(jù)權利要求1所述的添加高聚木糖提高纖維素酶生產效率的方法，其特征是其中，添加聞聚木糖不僅是指聞聚木糖純物質，還包括含有聞聚木糖成分的物質。
全文摘要
本發(fā)明公開了添加高聚木糖提高纖維素酶生產效率的方法，通過在真菌纖維素酶發(fā)酵生產過程中添加高聚木糖的手段來快速縮短發(fā)酵纖維素內切酶的時間，提高纖維素酶的整體酶活。本發(fā)明方法簡單易行，提高纖維素酶整體酶活效果明顯，大幅度縮短產纖維素內切酶的發(fā)酵時間，適用范圍廣，可用于工業(yè)化發(fā)酵生產纖維素酶。
文檔編號C12R1/885GK103045569SQ201310014080
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月15日 優(yōu)先權日2013年1月15日
發(fā)明者熊鵬, 賀建龍, 周玉珍, 徐繼明 申請人:熊鵬