使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶鏈式反應(yīng)檢測系統(tǒng)的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在試驗系統(tǒng)中檢測核酸的方法和試劑盒。在一個方面，本發(fā)明涉及在存在缺少3’-5’核酸酶活性的聚合酶時減少引物延伸反應(yīng)中非特異性擴增和引物二聚體形成的方法。在另一個方面，本發(fā)明涉及檢測在存在缺少3’-5’外切核酸酶活性的聚合酶時產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的方法，包括提供能夠彼此雜交以形成熒光淬滅對的具有不同Tm的第一和第二單標記的寡核苷酸。在本發(fā)明的方法中，一條或更多條引物或寡核苷酸含有至少一個硫代磷酸酯基。【專利說明】使用包含硫代磯酸醒基的寡核音酸的聚合酶鏈式反應(yīng)檢測系統(tǒng)【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種在試驗系統(tǒng)中用于檢測核酸的方法和試劑盒。【
背景技術(shù)：
】[000引聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)是一種快速且指數(shù)式擴增目標核酸序列的有力方法。PCR促進了基因表征和分子克隆技術(shù)的發(fā)展，包括PCR擴增的DNA的直接測序、等位基因變異的測定W及傳染性和遺傳性疾病病癥的檢測。通過下述重復(fù)循環(huán)進行PCR;將含有目標序列的DNA模板熱變性、將反向引物與互補DNA鏈退火和使用DNA聚合酶將退火的引物延伸。多重PCR循環(huán)導(dǎo)致由側(cè)翼擴增引物圈定的核巧酸序列指數(shù)式擴增。在PCR方案中加入熱穩(wěn)定的DNA聚合酶避免了重復(fù)添加酶的需要并使退火和引物延伸的溫度提高，該溫度提高了引物；模板相關(guān)的特異性。因此，TaqDNA聚合酶可用于增加PCR的特異性和簡便性。[0003]在許多基于PCR的反應(yīng)中，采用信號生成系統(tǒng)，如用于檢測擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生。在基于PCR的反應(yīng)中所使用的信號生成系統(tǒng)之一是英光能量轉(zhuǎn)移（FRET)系統(tǒng)，其中核酸檢測物（detector)包括英光供體和受體基團。FRET標記系統(tǒng)具有許多優(yōu)于其它標記系統(tǒng)的優(yōu)勢，包括進行勻相試驗的能力，其中并不需要結(jié)合的與未結(jié)合的標記的核酸檢測器的分離步驟。許多現(xiàn)有技術(shù)的主要問題與雙標記的英光寡核巧酸的合成相關(guān)。歐洲專利申請EP1726664公開了一種解決該一問題的檢測系統(tǒng)，其使用具有不同解鏈溫度（Tm)的單標記的寡核巧酸序列，所述寡核巧酸序列在理想溶液（化eesolution)中彼此雜交W形成英光巧滅對，其通過將互補序列引入到一個或兩個序列上來生成可測量的信號，序列之一具有低于PCR過程的退火溫度（Ta)的時1。[0004]在使用標記的核酸檢測物的檢測系統(tǒng)中，高保真擴增是非常關(guān)鍵的。由于PCR過程和化qDNA聚合酶的性質(zhì)，此類方法可能遇到所需要聚合反應(yīng)之外的其它副反應(yīng)。例如，當(dāng)在環(huán)境溫度下進行反應(yīng)時，PCR可能遇到非特異性擴增。在亞PCR溫度下，Taq聚合酶保留部分活性，因此可W延伸非互補退火的引物，從而導(dǎo)致形成非預(yù)期產(chǎn)物。然后新合成的區(qū)域?qū)⒆鳛檫M一步引物延伸和非預(yù)期擴增產(chǎn)物合成的模板。然而，如果在聚合起始之前將反應(yīng)加熱至約5(TC或更高的溫度，該將增加引物退火的嚴謹性并避免或降低非預(yù)期PCR產(chǎn)物的合成。[0005]引物二聚體也是一種常見的影響PCR的副反應(yīng)。發(fā)生引物二聚體的積聚是因為引物相互之間的雜交和延伸。形成引物二聚體導(dǎo)致試劑損耗并因此整體降低PCR效率。[0006]熱啟動PCR是減少非特異性擴增的一種方法，并因此限制了引物二聚體的形成，且已開發(fā)了多種不同的方法來實現(xiàn)該一目的，參見例如Moretti,T.等人，EnhancementofPC民amplificationyieldandspecificityusingAmpliTaqGoldDNApolymerase.BioTechniques25,716-22(1998)矛口HotStartPC民withheat-activatableprimers:anovelapproachforimprovedPC民performanceNucleicAcids民es(2008)36(20):el31。然而，此類技術(shù)僅部分緩解了此類問題。由于序列中的任何錯誤、并非基于聚合的反應(yīng)或引物錯配（如引物二聚化）都可能導(dǎo)致產(chǎn)生弱信號或錯誤信號，尤其是在等位基因特異性PCR中，因此期望進一步改善該些弱的或不正確的信號。[0007]硫代磯酸醋（或S-oligos)是正常DNA的變體，其中非橋鍵氧原子中的一個被硫取代。磯酸二醋和硫代磯酸醋核巧酸間鍵的實例如下所示：[0008]【權(quán)利要求】1.一種減少模板依賴的引物延伸反應(yīng)中的非特異性擴增和/或引物二聚體形成的方法，其包括在缺少3'一5'核酸酶活性的聚合酶存在下進行引物延伸反應(yīng)，其中一個或多個引物包含至少一個硫代磷酸酯基團。2.-種檢測在缺少3'一5'外切酶活性的聚合酶存在下產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供至少兩個在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對并通過引入互補于一個或兩個序列的互補序列而產(chǎn)生可測量信號的單標記的寡核苷酸序列，其中寡核苷酸序列中的至少一個包含至少一個硫代磷酸酯基團；b)提供至少一個引物并起始引物延伸反應(yīng)，從而產(chǎn)生互補于單標記的寡核苷酸序列中的至少一個的序列；和c)測量所產(chǎn)生的可檢測信號。3.-種檢測在缺少3'一5'外切酶活性的聚合酶存在下產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的試劑盒，其包含至少兩個在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對并通過引入互補于一個或兩個序列的互補序列而產(chǎn)生可測量信號的單標記的寡核苷酸序列，其中寡核苷酸序列中的至少一個包含至少一個硫代磷酸酯基團。4.如權(quán)利要求2或3所述的方法或試劑盒，其中第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm。5.如權(quán)利要求4所述的方法或試劑盒，其中第一和第二寡核苷酸序列之一具有等于或低于引物延伸反應(yīng)的Ta的Tm。6.如權(quán)利要求4或5所述的方法或試劑盒，其中第一和第二寡核苷酸序列之一具有高于引物延伸反應(yīng)的Ta的Tm。7.-種檢測在缺少3'一5'外切酶活性的聚合酶存在下通過使用PCR產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供第一單標記的寡核苷酸序列和至少一種第二單標記的寡核苷酸序列和至少一種引物，第一和第二寡核苷酸序列具有不同的Tm，其中第一和第二寡核苷酸序列在理想溶液中相互雜交以形成熒光猝滅對，第一和第二寡核苷酸序列之一具有等于或低于PCR過程的Ta的Tm，其中寡核苷酸序列的至少一個包含至少一個硫代磷酸酯基團，所述至少一種引物包含至少一個未標記的加尾的引物，未標記的加尾的引物具有尾部區(qū)域，該尾部區(qū)域包含互補于第二單標記的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列的寡核苷酸序列，第一單標記的寡核苷酸序列是PCR過程中一旦產(chǎn)生互補于第一單標記的寡核苷酸序列的序列就可由其起始DNA合成的引物，因此第二單標記的寡核苷酸序列不再能夠與第一單標記的寡核苷酸序列雜交，從而產(chǎn)生可測量的信號；b)起始引物延伸反應(yīng)，從而產(chǎn)生互補于單標記的寡核苷酸序列中的至少一個的互補序列；和c)測量所產(chǎn)生的可檢測信號。8.如權(quán)利要求2至7任一項所述的方法或試劑盒，其中單標記的寡核苷酸之一比另一個短多于10個堿基。9.如權(quán)利要求2至6任一項所述的方法或試劑盒，其中在每個循環(huán)實時地監(jiān)測PCR過程，或者在通過降低反應(yīng)溫度以產(chǎn)生雜交而使反應(yīng)未產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物來產(chǎn)生可測量信號的情況下，在多個循環(huán)后實時地監(jiān)測PCR過程。10.如權(quán)利要求7至9任一項所述的方法或試劑盒，其中所述其它的單標記的寡核苷酸具有高于Ta的Tm。11.如權(quán)利要求2至10任一項所述的方法或試劑盒，其中所述單標記的寡核苷酸之一具有熒光猝滅對的猝滅劑標記。12.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中含有硫代磷酸酯基團的引物內(nèi)的堿基中的至少一個是硫代磷酸酯。13.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中含有硫代磷酸酯基團的引物的堿基的20-80%是硫代磷酸酯。14.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其用于基于等位基因特異性PCR的SNP基因分型。15.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其用于通過5'核酸酶試驗監(jiān)控擴增子的產(chǎn)生。16.如權(quán)利要求15所述的方法或試劑盒，其中所述5'核酸酶試驗用于進行等位基因區(qū)分反應(yīng)。17.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中通過僅使用雜交來監(jiān)測引物延伸產(chǎn)物。18.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中通過僅在PCR后使用雜交來監(jiān)測引物延伸產(chǎn)物。19.如權(quán)利要求2至18任一項所述的方法或試劑盒，其中熒光猝滅寡核苷酸對的范圍為6bp至100bp。20.如權(quán)利要求19所述的方法或試劑盒，其中熒光猝滅寡核苷酸對的范圍為6bp至100bp，但長度上不匹配。21.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中熒光團標記的引物的堿基中的至少一個包含至少一個硫代磷酸酯基團。22.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中熒光猝滅寡核苷酸對被標記，對中的一個具有熒光團，而另一個具有非熒光猝滅分子。23.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中修飾熒光猝滅寡核苷酸對以抵抗核酸酶降解。24.如前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中熒光猝滅寡核苷酸對用對距離敏感的分子標記。【文檔編號】C12Q1/68GK104379763SQ201280073407【公開日】2015年2月25日申請日期:2012年3月22日優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日【發(fā)明者】菲利普·史蒂文·魯賓遜,約翰·霍爾梅,尼沙·吉恩申請人:Lgc基因組學(xué)有限公司