探針：反義探針組合物對高特異性dna或rna的檢測的制作方法
【專利摘要】相互作用并標(biāo)記的多核苷酸探針和反義探針和/或互補(bǔ)的靶探針，為我們提供了用于擴(kuò)增或檢測核酸的組合物及方法。這些組分的競爭性熱力相互作用導(dǎo)致顯示靶頻率的信號變化，并且可以提供促成單堿基識別錯誤的檢查功能。這些探針、反探針組合物能進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，終點(diǎn)檢測和微生物的微陣列檢測，耐藥突變和癌癥相關(guān)的變異。一些探針、反義探針在兩個引物之間作為內(nèi)部探針，一些作為引物探針。采用兩個探針：反義探針系統(tǒng)檢測同一模板的不同方面，以辨別或量化一些靶序列。還提供了增強(qiáng)靶擴(kuò)增和檢測特定單堿基變異的系統(tǒng)。探針也可通過引入一個堿基不匹配以增加相差一個堿基的正確與不正確的靶的熱力學(xué)識別力而修飾。
【專利說明】探針:反義探針組合物對高特異性DNA或RNA的檢測
[0001]交叉引用的相關(guān)申請
[0002]本申請要求于2011年9月15日提交的第61/534，925號、名稱為“探針:反義探針組合物對高特異性DNA或RNA的檢測”的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003]序列表
[0004]本發(fā)明包括其全部內(nèi)容通過引用并入本文的一個序列表。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及核酸探針【技術(shù)領(lǐng)域】和特異性的鑒定以及定量DNA或RNA序列的組合物和方法。本發(fā)明特別涉及基因擴(kuò)增期間或擴(kuò)增后靶向基因的標(biāo)記和檢測。
【背景技術(shù)】[0006]靶向多核苷酸序列的檢測通常是基于使得標(biāo)記DNA探針與感興趣的靶序列雜交的方法。為了有效地工作，該探針-靶雜交產(chǎn)物必須雜交后進(jìn)行洗滌以除去未結(jié)合的探針和被弱結(jié)合到非特異性靶的探針。然而，在實(shí)時PCR(美國專利4，965，188 ;美國專利5，210，015 ;美國專利5，487，972 ;美國專利5，538，848)的條件下，洗滌步驟是不可行的，因此，必須設(shè)計出當(dāng)它們被結(jié)合到匹配的靶上時選擇性地生成信號或者當(dāng)它們未被結(jié)合并在溶液中自由漂浮時已減弱或淬火信號的新的探針。為了達(dá)到這個目的，一直依賴于使用一個供體和受體分子間的熒光能量激發(fā)和轉(zhuǎn)移的探針，如兩個熒光團(tuán)之間或熒光團(tuán)和淬滅劑([Didenko V,(2001)Biotechniques31:1106-1116,1118,1120-1121 ；Chen et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA30:94:10756-10762)。供體的熒光發(fā)射光譜應(yīng)該與受體的吸收或激發(fā)光譜重疊。當(dāng)它們很靠近(10至100埃)時，所述熒光供體分子的激發(fā)態(tài)能量然后被轉(zhuǎn)移到受體分子上。然而，如果受體分子是熒光信號本身有熒光性的，它提供了一個較長波長的發(fā)射信號。如果受體分子是一種有效的淬滅劑，熒光信號會明顯地減少，而且可以基本上關(guān)閉。
[0007]TAQMAN.RTM和分子信標(biāo)探針都屬于這種實(shí)時PCR檢測的常用探針。在這兩種情況下，它們是作為內(nèi)部探針，其用于與一對感興趣的靶區(qū)域側(cè)翼的相對的引物相結(jié)合。引物擴(kuò)增靶片段，探針選擇性地結(jié)合到引物位點(diǎn)之間的識別序列，由此導(dǎo)致相對于靶頻率增加的熒光信號的增加。雖然這些檢測系統(tǒng)實(shí)際上是相似的，但它們采用不同的檢測機(jī)制。
[0008]一種TAQMAN.RTM探針包含與靶序列互補(bǔ)的約20至30個堿基的合成寡核苷酸，并且在相對的兩端將其標(biāo)記上熒光供體和受體(美國專利5，538，848)。通常地，5'端具有更短波長的熒光團(tuán)，例如熒光素，和3'端標(biāo)記有更長波長的發(fā)射熒光團(tuán)GnTAMRA.RTM)或非熒光淬滅劑如Black Hole Quencher.RTM。內(nèi)部淬滅劑也被使用。而TAQMAN:RTM專利已經(jīng)過期，這項(xiàng)技術(shù)仍然是用于實(shí)時PCR的主要探針系統(tǒng)。
[0009]分子信標(biāo)探針也可以使用熒光相互作用來檢測和量化PCR產(chǎn)物，每個探針通常具有5'熒光標(biāo)記端和Y淬滅劑標(biāo)記端(美國專利5,925,517 ;Tyagi et al.，(1996)Nat.Biotechnologyl4:303-308)。然而,分子信標(biāo)探針進(jìn)一步包括約5至7個互補(bǔ)的堿基的小片段，并在溶液中結(jié)合在一起，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中所述淬滅劑和熒光團(tuán)標(biāo)記端都被放在一起，且信號被抑制。
[0010]SCORPION.RTM探針還提供一種與分子信標(biāo)相似的莖-環(huán)檢測機(jī)制，除了該探針還具有一個作為擴(kuò)增引物(Whitcombe et al.，(1999)Nat.Biotechnol.17:804-807 ；USPat.6，326，145)的附加片段之外。這些探針使得莖-環(huán)結(jié)構(gòu)保持在熒光團(tuán)淬火的未雜交狀態(tài)。當(dāng)變性再次發(fā)生接著退火時，所述探針片段結(jié)合到模板中，從而打開了莖-環(huán)結(jié)構(gòu)并釋放突光。
[0011]類似SCORPION.RTM, SUNRISE.RTM探針包含在擴(kuò)增期間連接到被延伸的發(fā)夾探針的引物。這使得內(nèi)部淬滅劑標(biāo)記與5'末端的突光團(tuán)分離(Nazarenko et al., (1997)Nucl.Acids Res.25:2516-2521)。
[0012]傳統(tǒng)的雙標(biāo)記探針需要選擇性的設(shè)計和高昂的成本。它們的合成是困難的，而且需要手工合成后添加至少一種標(biāo)記，以及高壓液相色譜純化。TAQMAN.RTM和分子信標(biāo)探針還需要探針側(cè)翼的兩個相對的引物。要在退火步驟中有效地發(fā)揮作用，TAQMAN.RTM和分子信標(biāo)探針必須更長，并具有高于引物5到10°C的Tm(解鏈溫度)，因?yàn)樵撎结樤谘由熘氨仨毨卫谓Y(jié)合到靶上。這種要求使得很難設(shè)計或開發(fā)可以選擇性地檢測SNPs (單核苷酸多態(tài)性)或單堿基突變的雙標(biāo)記探針，因此，假陽性是一個常見的問題。[0013]FISH(熒光原位雜交)技術(shù)要求四個處理步驟:1)標(biāo)記探針的制備方法，2)探針雜交以固定變性靶，3)未結(jié)合的探針的洗滌，和4)熒光激發(fā)和檢測(Barch M.J，，編輯“ACT細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)指南”第二版，紐約=Raven出版社；1991)。小心的洗滌步驟是有效檢測的關(guān)鍵因素，因?yàn)樾旁氡雀叨纫蕾囉谙礈斓膰?yán)格性。過度洗滌可大大降低信號。
[0014]基因芯片檢測與FISH檢測類似。陣列通常根據(jù)與寡核苷酸cDNA探針結(jié)合的印刷玻璃或硅基板；應(yīng)用一定是被雜交到探針的熒光標(biāo)記的DNA或RNA靶；嚴(yán)格地洗滌陣列；然后檢測結(jié)合的祀，通常是通過激光掃描(Schena et al., (1995) Science270:467-470 ；Heller et al.，(1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A94:2150-2155)。像 FISH 探針，其洗滌步驟同樣復(fù)雜和費(fèi)時。然而，靶的制備和標(biāo)記是昂貴的，因?yàn)槊總€靶樣是唯一的，限制了其在常規(guī)的基于微陣列中的測定，特別是在臨床診斷中的用途。
[0015]發(fā)明概述
[0016]本發(fā)明包括一種適合于DNA或RNA序列的實(shí)時和終點(diǎn)檢測的探針系統(tǒng)，尤其是可以區(qū)分單堿基變異如SNP和點(diǎn)突變的探針。本發(fā)明特別是涉及提供適合于定量PCR(實(shí)時PCR)的探針，其中小的基因片段被指數(shù)擴(kuò)增和定量檢測。本發(fā)明提供了在結(jié)構(gòu)上和功能上相關(guān)的一系列探針系統(tǒng)，但在特異性或敏感性的相應(yīng)等級方面有偏差，并且其可以被組合在一起以提供新的診斷或量化功能。
[0017]本發(fā)明的一個主要方面是一種包含有能夠一起反應(yīng)的兩個標(biāo)記的寡核苷酸、一個探針和一個反義探針的探針:反義探針系統(tǒng)。該探針序列與預(yù)定的靶序列是互補(bǔ)的，并且該反義探針序列與該探針是互補(bǔ)的，除了在非末端位置包含的至少一個不匹配堿基以外。該反義探針被設(shè)計用于提供該探針的一種錯誤檢測機(jī)制。在一些實(shí)施例中，該探針通常標(biāo)記有熒光發(fā)射器，該反義探針通常標(biāo)記有熒光調(diào)制器，例如淬滅劑，雖然這樣的標(biāo)記可以翻轉(zhuǎn)，其它部件如第二熒光團(tuán)，可以作為熒光調(diào)制器。在這樣的實(shí)施例中，當(dāng)探針和反義探針結(jié)合在一起時，相互作用的標(biāo)記基團(tuán)是最近的，信號被減弱，但是，當(dāng)該探針結(jié)合到互補(bǔ)的靶上時，熒光信號被釋放。
[0018]所述探針:反義探針系統(tǒng)可以被配置，以識別只相差一個堿基的兩個靶序列。因此，探針和反義探針序列被設(shè)計為用于實(shí)現(xiàn)溶液中三個獨(dú)立的雜交親和水平:(i)該探針與預(yù)定的靶之間的第一高親和水平，(ii)該探針和該反義探針之間的第二中間親和水平，其中該反義探針是由設(shè)于該反義探針內(nèi)不匹配的類型和位置所確定(iii)該探針與相差至少一個堿基的不正確的靶之間的第三低親和水平。預(yù)期的雜交親和水平是通過計算預(yù)期的雙鏈的Tm和AG進(jìn)行評估。組分的長度、序列和不匹配位置被設(shè)計和配置，使得所述探針:預(yù)定的靶雙鏈的雜交親和力比探針的親和力比所述探針:反義探針雙鏈的雜交親和力高約4°C或更多的Tm值或約2千卡/摩爾或更多的Λ G值，并且使得所述探針:反義探針雙鏈的雜交親和力比所述探針:不正確的靶雙鏈的雜交親和力高約4°C或更多的Tm值或約2千卡/摩爾或更多的AG值。然而，所述探針:預(yù)定的靶雙鏈和所述探針:不正確的靶雙鏈之間的固有熱力學(xué)差異是有限的，探針也可通過故意不匹配進(jìn)行修飾，并方便地放置在與預(yù)期的單堿基變異相差約2個堿基的位置。此探針修飾削弱了探針和不正確的靶之間的雜交親和性，這是由于探針不匹配接近序列不匹配，不正確的靶上的SNP或感興趣的單堿基突變。有了這些不同的熱力學(xué)設(shè)計，探針:反義探針系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)單堿基變異的識別，并能保持這種識別在雜交條件和退火溫度的一定范圍內(nèi)-尤其是當(dāng)用于實(shí)時PCR時。
[0019]所述探針:反義探針系統(tǒng)進(jìn)一步包括，其中所述探針被設(shè)計成作為一個引物-探針組合物備用，它取代了一個引物，或其中所述探針與兩個側(cè)翼引物一起使用可作為內(nèi)部的探針。本發(fā)明還包括修飾探針:反義探針組合物，其中所述反義探針在結(jié)構(gòu)上與一個引物連接，而這種變化通過實(shí)時PCR產(chǎn)生隨S狀彎曲擴(kuò)增曲線變化的直線。
[0020]本發(fā)明的其他實(shí)施例提供了修飾的探針:反義探針組合物，用于檢測通過等溫方法(包括擴(kuò)增陣列基板的方法)擴(kuò)增的基因片段。本發(fā)明還描述了兩種或多種探針結(jié)合在一起的方法，以同時檢測不同的靶位點(diǎn)，或?yàn)榱朔謩e檢測同一靶的兩個方面。最后，本發(fā)明包含一種與未標(biāo)記的阻斷探針相結(jié)合的探針:反義探針系統(tǒng)，以提高稀有序列變異(例如，嵌入在正常組織中突變的癌細(xì)胞)的擴(kuò)增和檢測。
[0021]附圖簡要說明
[0022]圖1A示意性地例示了總的DDS探針結(jié)構(gòu)和機(jī)制。
[0023]圖1B示意性地例示了根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)部DDS(iDDS)系統(tǒng)。
[0024]圖1C示意性地例示了終止ZIPR DDS系統(tǒng)。
[0025]圖2A示意性地例示了 FLIP DDS系統(tǒng)。
[0026]圖2B示意性地例示了 ZIPR DDS:iDDS這兩種探針系統(tǒng)量化一種特殊變異的總擴(kuò)增及其比例。
[0027]圖2C示意性地例示了 G-Force DDS:1DDS這兩種探針系統(tǒng)量化一種特殊變異的總擴(kuò)增及其比例。
[0028]圖3A示意性地例示了本發(fā)明的兩步“野生終止子”(“WTx”)系統(tǒng)。
[0029]圖3B示意性地例示了本發(fā)明的一步“野生終止子”(“WTx”)系統(tǒng)。
[0030]圖4A示意性地例示了終止子DDS探針與ISAM等溫擴(kuò)增相結(jié)合。 [0031]圖4B示意性地例示了內(nèi)部DDS探針與ISAM等溫擴(kuò)增相結(jié)合。[0032]圖4C示意性地例示了芯片上ISAM擴(kuò)增的DDS探針。
[0033]圖5例示了交替的標(biāo)記結(jié)構(gòu)，以改善采用DDS探針:反義探針系統(tǒng):(左側(cè))其中該探針具有一個熒光發(fā)射器和一個熒光調(diào)制器，該反義探針具有一個熒光調(diào)制器，(中間)其中該探針具有一個熒光發(fā)射器和一個熒光調(diào)制器，該反義探針具有一個熒光發(fā)射器和一個熒光調(diào)制器，以及(右側(cè))其中該探針具有二個熒光發(fā)射器，該反義探針具有二個熒光調(diào)制器。
[0034]圖6例示了根據(jù)本發(fā)明的用于VKORCl (維生素K環(huán)氧化物還原酶基因)的野生型SNP變異的檢測的 iDDS探針:反義探針系統(tǒng)。由于定量PCR每個周期從變性的95°C下降至退火/檢測的約52-62°C，探針先結(jié)合到匹配的靶(頂部)，這是由于SNP位點(diǎn)(粗體G)的正確匹配，因此產(chǎn)生較高的熱力學(xué)親和力(由AG和Tm測得)。如果沒有匹配的靶是可用的，該探針將在較低的AG和Tm(中間)下隨后結(jié)合到反義探針，這是由于設(shè)計的反義探針不匹配使得Tm下降約5-6°C和AG下降約2-2.5千卡/摩爾。在這種情況下和大多數(shù)情況下，所述探針和所述具有非匹配的SNP(粗體A)的第二靶之間的熱力學(xué)親和力明顯比探針和反義探針之間的親和力低約5-6個。C的Tm值和2-2.5千卡/摩爾的AG值(底部)。因此，探針:反義探針系統(tǒng)選擇性地檢測到正確的靶，并抑制或防止不正確的靶的結(jié)合和檢測。
[0035]圖7A例示了包括被擴(kuò)增以檢測L858R SNP位點(diǎn)的癌癥標(biāo)記的堿基對位置2535至2616的EGFR基因的外顯子21的區(qū)域。該突變模板(頂部)及野生模板(下部)與可變的858SNP位點(diǎn)(以粗體表示)及共用引物序列(以粗體表示)一起顯示。
[0036]圖7B例示了通過qPCR檢測EGFR的突變的858R探針:反義探針組分，其中所述探針和反義探針被設(shè)計為使用不匹配堿基。插入反義探針(T-T)的不匹配使得相對于探針:突變靶雙鏈的探針:反義探針雙鏈的熱力學(xué)親和力降低。設(shè)計為探針(C-C)的輔助不匹配預(yù)計為具有與輔助不匹配相差兩個堿基的858L SNP變異體的野生靶。當(dāng)突變探針遇到這樣一個靶時，3堿基“雜交泡沫”如圖所示(CCG)發(fā)生，使得熱力學(xué)親和力下降，并防止假靶的檢測。采用有效的設(shè)計，這些熱力學(xué)相互作用導(dǎo)致三種不同的雜交水平，彼此具有約5-6°C的Tm差異和約2-2.5千卡/摩爾的AG差異。因此，當(dāng)在qPCR的退火步驟中溫度下降時，該突變探針與突變靶序列優(yōu)先雜交，如果存在的話，這是由于如圖所示(頂部)的雙鏈的較高Tm和AG。探針:反義探針雙鏈的Tm和AG明顯較低(中間)，但比突變探針:野生靶雙鏈(底部)的Tm和AG仍然高得多，這是由于以SNP不匹配(G-A)和輔助不匹配(C-C)共同產(chǎn)生一個多堿基“雜交泡沫”。計算的Tm和AG值被描繪于每個雜交水平和這些水平之間的差異的圖中，這是基于 DINAMelt Web Server (run at58degrees) [N.R.Markham&M.Zuker.DINAMelt Web Server for Nucleic Acid Melting Prediction.Nucleic Acids Res.33,W577-W581,2005]的雙態(tài)熔點(diǎn)(雜交)分析程序。應(yīng)當(dāng)指出的是，這個系統(tǒng)的Tm水平相對高于其它通常使用的Tm分析來源(例如，操縱子和IDT位點(diǎn))。
[0037]圖8A顯示了通過使用iDDS與特異于VKORCl的野生型SNP變異與野生型(W)和突變(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0038]圖8B顯示了通過使用iDDS與特異于VKORCl的SNP變異和野生型(W)和突變(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0039]圖9顯示了通過使用iDDS與特異于EGFR的突變858R SNP變異與野生型(W)和突變(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0040]圖1OA顯示了通過使用iDDS與特異于大腸桿菌0157:H7的突變SNP與野生型(W)和(兩種濃度)突變(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0041]圖1OB顯示了通過使用TaqManMGB與特異于大腸桿菌0157:H7的突變SNP與野生型(W)和突變(M)靶核苷酸序列的寡核苷酸探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0042]圖1lA顯示了通過使用特異于革蘭氏陽性(P)和革蘭氏陰性(N)細(xì)菌的寡核苷酸iDDS與革蘭氏陽性靶核苷酸序列的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0043]圖1lB顯示了通過使用特異于革蘭氏陽性(P)和革蘭氏陰性(N)細(xì)菌的寡核苷酸iDDS與革蘭氏陰性靶核苷酸序列的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0044]圖12顯示了通過使用ZIPR DDS和特異于H3流感病毒基因靶核苷酸序列的寡核苷酸探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0045]圖13A顯示了通過使用特異于與副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis)的同樣祀?yún)^(qū)域相差一個單堿基的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的16S基因內(nèi)的靶區(qū)域的FLIP DDS探針，四個濃度的結(jié)核分枝桿菌的靶核苷酸序列和副結(jié)核分枝桿菌對照的祀核苷酸序列的qPCR產(chǎn)生的突光信號的曲線圖。[0046]圖13B顯示了通過使用特異于與副結(jié)核分枝桿菌的同樣靶區(qū)域相差一個單堿基的結(jié)核分枝桿菌的16S基因內(nèi)的祀?yún)^(qū)域的TaqMan探針，四個濃度的結(jié)核分枝桿菌的祀核苷酸序列和副結(jié)核分枝桿菌對照的靶核苷酸序列的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0047]圖14顯示了通過使用兩步靶增強(qiáng)和特異于858R變異EGFR與0.2% 858R的靶核苷酸序列的混合樣品和99.8%野生型變異靶核苷酸序列的“野生終止子”阻斷探針和iDDS探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0048]圖15顯示了通過使用G-Force引物-探針與未在其引物的序列不同的任何結(jié)核分枝桿菌野生(W)或突變(M)的模板的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0049]圖16A顯示了通過使用特異于野生序列的無差別的G-Force探針和iDDS探針，以及結(jié)核分枝桿菌突變(M)模板的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0050]圖16B顯示了通過使用特異于野生序列的無差別的G-Force探針和野生型特異性iDDS探針，以及不同量的與突變(M)的模板相對的結(jié)核分枝桿菌野生(W)的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0051]圖17顯示了通過使用一步靶增強(qiáng)和特異于858R突變EGFR與2% 858R的靶核苷酸序列的混合樣品和98%野生型變異靶核苷酸序列的“野生終止子”阻斷探針和iDDS探針的qPCR產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0052]圖18顯示了 ZIPR和ISAM產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0053]圖19顯示了 iDDS和ISAM產(chǎn)生的熒光信號的曲線圖。
[0054]圖20顯示了 ISAM芯片、Cy3標(biāo)記點(diǎn)、FAM循環(huán)上的陣列檢測的數(shù)字圖像。
[0055]圖21顯示了 EGFR缺失-19突變與野生僅iDDS探針及非特異ZIPR探針的刪除曲線圖，其中所述曲線顯示的是與100%的野生模板平行的兩個信號，以及平的iDDS信號與100%的突變模板。
[0056]圖22顯示了 EGFR缺失-19突變與野生僅iDDS探針及非特異ZIPR探針的刪除曲線圖，其中所述曲線顯示的是和下級的iDDS信號平行的兩個信號與50/50野生/突變模板，以及平的iDDS信號與100%的突變模板。
[0057]圖23顯示了 EGFR缺失-19突變與野生僅iDDS探針及非特異ZIPR探針和100 %的突變模板和平的iDDS信號和100%的突變模板的刪除曲線圖。
[0058]圖24顯示了 EGFR缺失-19突變測定中的檢測方法。
[0059]以下詳細(xì)描述本發(fā)明的方法和系統(tǒng)的一些示例性實(shí)施例。根據(jù)以下說明書、附圖、實(shí)施例和權(quán)利要求的審查，其它特征、目的和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的。所有此類附加系統(tǒng)、方法、特征和優(yōu)點(diǎn)旨在被包括于本說明書與本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且由所附權(quán)利要求保護(hù)。
[0060]發(fā)明詳述
[0061]在本發(fā)明詳細(xì)介紹之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不限于所述的具體實(shí)施例，當(dāng)然，因此可能不同。也應(yīng)當(dāng)理解，此處所用的術(shù)語僅為了描述特定實(shí)施例，并且不旨在進(jìn)行限制，因?yàn)楸竟_內(nèi)容的范圍將僅由所附的權(quán)利要求來限定。
[0062]提供了值的范圍，應(yīng)當(dāng)理解的是，每個中間值，到下限單位的十分之一，除非上下文另有明確規(guī)定，該范圍的上限和下限之間以及所述范圍的任何其它所述或插入的值，都包括在本發(fā)明之內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可以獨(dú)立地包括在較小范圍內(nèi)并且也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但受到所述范圍內(nèi)的任何明確排除的界限的限制。當(dāng)所述范圍包括一個或兩個界限時，那些所包括的界限不包括其中一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明之內(nèi)。 [0063]除非另有定義，此處所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語在本文中具有相同的含義，通常被本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解。雖然類似或等同于此處描述的任何方法和材料也可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中使用，但現(xiàn)在介紹了優(yōu)選的方法和材料。
[0064]本說明書中引用的所有出版物和專利在此處通過引用的方式并入本文，如同每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠唧w地和單獨(dú)地通過引用的方式并入，以公開和介紹與引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。任何出版物的引用是其申請日之前的公開內(nèi)容，不應(yīng)被理解為，本發(fā)明無權(quán)憑借在先公開而先于這些出版物。另外，出版物中提供的日期可能與需要單獨(dú)確認(rèn)的實(shí)際
【公開日】期不同。
[0065]那些本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員閱讀本發(fā)明是顯而易見的，此處描述和示出的每一個單獨(dú)實(shí)施例具有分立的構(gòu)成和特點(diǎn)，在不背離本發(fā)明的范圍或精神下可以容易地與任何其它幾個實(shí)施例分開或者結(jié)合。任何所列舉方法可以按所列舉事件的順序或以邏輯上可能的任何其他順序進(jìn)行。
[0066]本發(fā)明的實(shí)施例將采用，除非另有說明，醫(yī)藥、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)等技術(shù)，這些都是本【技術(shù)領(lǐng)域】的范圍內(nèi)的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中充分說明。
[0067]但必須指出的是，如在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一”，“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確規(guī)定。在說明書和權(quán)利要求書中，所提及的一些術(shù)語，應(yīng)定義為具有以下含義，除非有相反的意思表示。
[0068]如此處所使用的，下列術(shù)語具有賦予它們的含義，除非另有規(guī)定。在本發(fā)明中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”等可以具有美國專利法賦予它們的含義，并且可以指“包括”、“包含”等；“基本上由……組成”或“基本組成為”或類似的，當(dāng)應(yīng)用到由本發(fā)明所包括的方法和組合物時，是指如同此處公開的那些組合物，但是其可以包含其他結(jié)構(gòu)基團(tuán)，組合物組分或方法步驟(或如上面所討論的類似物或其衍生物)。然而，這些附加的結(jié)構(gòu)基團(tuán)，組合物組分或方法步驟等，相比于那些相應(yīng)的組合物或此處所公開的方法，實(shí)質(zhì)上不影響該組
合物或方法的基礎(chǔ)和新穎性(S)?！盎旧嫌?.....組成”或“基本上組成為”或類似的，
當(dāng)應(yīng)用到由本發(fā)明所包括的方法和組合物時，具有美國專利法賦予的含義，該術(shù)語是開放式的，允許其超過了所列舉的存在，只要是所述的基礎(chǔ)或新穎性不被超過了所列舉的存在改變了，但不包括現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)施例。
[0069]在描述各種實(shí)施例之前，提供以下定義并應(yīng)該被使用，除非另有說明。
[0070]定義
[0071]此處所使用的術(shù)語和短語具有其本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，可以通過參考本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)教科書和期刊中找到。提供下列定義以闡明它們在本發(fā)明的上下文中的特定用途。
[0072]術(shù)語“互補(bǔ)”是指在寡核苷酸序列中足夠數(shù)量的相匹配的堿基對與被擴(kuò)增或檢測到的靶核酸序列發(fā)生特異性(雜交)的相互作用。在本領(lǐng)域中，雜交的特異性和靈敏度需要非常高度的互補(bǔ)， 雖然它不一定是100%。
[0073]術(shù)語“變性”是指互補(bǔ)的DNA鏈的伸展和分離，并可以通過熱或變性劑處理來完成。
[0074]此處所使用的術(shù)語“可檢測基團(tuán)”是指間接或直接并入寡核苷酸的標(biāo)記分子(同位素或非同位素)，以促進(jìn)檢測。標(biāo)記的寡核苷酸的合成可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一些方法來實(shí)現(xiàn)。各種熒光分子適合于探針標(biāo)記。
[0075]此處所使用的術(shù)語“可檢測標(biāo)記的”是指標(biāo)記有熒光團(tuán)或標(biāo)記有誘導(dǎo)出可通過眼睛或通過儀器觀察或檢測的物理或化學(xué)反應(yīng)的其他分子種類的寡核苷酸。此處所使用的，“標(biāo)記”或“標(biāo)簽”是指一種分子，當(dāng)被所附加時，例如，但不限于，共價結(jié)合或雜交，至另一種分子，例如，也沒有限制，多核苷酸或多核苷酸片段提供或增強(qiáng)了檢測其他分子的手段。
[0076]此處所使用的術(shù)語“DNA”是指以單鏈或雙鏈的狀態(tài)聚合的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)，并且包括線性或環(huán)狀DNA分子。在討論DNA分子時，序列僅可通過給出5'到3'方向的序列的約定進(jìn)行描述。
[0077]術(shù)語“DNA擴(kuò)增”和“擴(kuò)增”是指任何方法，通過酶促擴(kuò)增增加一個特定的DNA序列的復(fù)制。通常使用的過程是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。Mullis的PCR過程在美國專利4，683，195和4，683，202中有所描述。PCR包括使用一種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、引物和加熱循環(huán)，這能夠使DNA鏈分開，并指數(shù)擴(kuò)增感興趣的基因區(qū)域。任何類型的PCR，如定量PCR、RT-PCR、熱啟動PCR、LAPCR、多重PCR、降落式PCR等，也可使用。有利的是，實(shí)時PCR可使用。鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的延伸產(chǎn)物將是含有對應(yīng)于所使用的引物的末端的終端的不連續(xù)的核酸雙鏈。
[0078]此處所使用的術(shù)語“酶促擴(kuò)增”或“擴(kuò)增”是指DNA擴(kuò)增。目前最常用的方法是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。其它擴(kuò)增方法包括LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、鏈置換擴(kuò)增(SDA) ;Qi3復(fù)制酶擴(kuò)增(QPRA);自我持續(xù)復(fù)制(3SR);以及NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增)，其可以在RNA和DNA中進(jìn)行。
[0079]此處所使用的術(shù)語“側(cè)翼區(qū)”是指核苷酸序列的另一個區(qū)域即5'或3'端的序列中核苷酸的一種延伸。
[0080]此處所使用的術(shù)語“熒光團(tuán)”是指其存在可以通過其發(fā)光特性檢測的任何報告基團(tuán)。[0081]此處所使用的術(shù)語“熒光淬滅劑”或“淬滅劑”是指干擾或吸收由附近的熒光團(tuán)發(fā)出的熒光的分子。典型的淬滅劑包括，但不限于，無熒光芳族分子的DABSYL或Black holeQuencher.RTM。淬滅劑也可以是第二熒光分子，例如TAMRA(羧基四甲基羅丹明)，其在不同的波長發(fā)射。
[0082]此處所使用的術(shù)語“雜交”是指兩個核酸鏈結(jié)合的過程，以通過相對的鏈之間的穩(wěn)定氫鍵形成反平行雙鏈。術(shù)語“雜交”和“結(jié)合”可互換使用，并且是指兩個多核苷酸片段的核苷酸序列之間的互補(bǔ)的A-T和C-G堿基對的形成。雜交鏈被稱為“雙鏈”。
[0083]此處所使用的術(shù)語“雜交特異性地”和“特異性雜交”和“選擇性雜交”是指嚴(yán)格條件下結(jié)合，形成雙鏈，或核酸分子優(yōu)先地與特定的核苷酸序列進(jìn)行雜交。
[0084]此處所使用的術(shù)語“雜交親和性”是指寡核苷酸補(bǔ)充和雜交到另一核苷酸序列中的屬性，以形成核酸雙鏈。
[0085]此處所使用的術(shù)語“固定至載體”是指寡核苷酸在特定的位置連接到一個基片上，以便它可以經(jīng)受洗滌或其它物理或化學(xué)處理，而不移動。許多載體和固定化方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以在本發(fā)明的方法中使用。[0086]此處所使用的術(shù)語“鎖核酸(LNA) ”是指采用額外的橋連接2，氧和4'碳的修飾核苷酸。橋?qū)⒑颂恰版i定”在3'-內(nèi)切(North)的構(gòu)象，這往往是在A型雙鏈中發(fā)現(xiàn)的。LNA核苷酸可并入寡核苷酸，以增加核酸雙鏈的穩(wěn)定性。
[0087]此處所使用的術(shù)語“解鏈溫度”(Tm)是指雜交雙鏈解雜交并返回到它們的單鏈狀態(tài)的溫度。同樣地，雜交不會在兩鏈之間的溫度高于所得到的雙鏈的解鏈溫度下發(fā)生。有利的是，本發(fā)明的寡核苷酸片段雙鏈中的Tm的差異為約1°C至約10°C，以便容易檢測。
[0088]此處所使用的術(shù)語“不匹配堿基的位置”是指雙鏈核酸中，兩個相對的核苷酸堿基以互補(bǔ)的方式不配對。例如，腺嘌呤將與胸腺嘧啶正確地形成氫鍵，而胞嘧啶或胍將與腺嘌呤形成弱的或無氫鍵，由此造成不匹配?；蛘撸谝粋€雙鏈的核酸中，不匹配堿基的位置可能是由于一個相對的堿基中的互補(bǔ)對中一個堿基的添加或缺失，或者是由于含有非天然堿基、無堿基位點(diǎn)或間隔子的相對的堿基的互補(bǔ)對中一個堿基的取代。
[0089]此處所使用的術(shù)語“經(jīng)調(diào)制的檢測信號”是指由強(qiáng)度減小或以其它方式改變的標(biāo)記基團(tuán)發(fā)出的檢測信號，例如，但不限于，波長的變化，使得經(jīng)調(diào)制的信號可檢測地不同于未調(diào)制的信號。調(diào)制信號可以是，例如，一個淬火信號，其中未調(diào)制信號的部分或全部能量被第二標(biāo)記物所吸收，使得調(diào)制后的信號比原來的信號強(qiáng)度低。或者，例如，第一標(biāo)記基團(tuán)的第一信號可以是第二標(biāo)記基團(tuán)的刺激劑，以發(fā)射不同波長的信號。
[0090]此處所使用的術(shù)語“多堿非雜交區(qū)域”是指一個包括至少兩個，優(yōu)選為三個或四個不匹配的相對堿基的雙鏈核酸區(qū)域，從而形成一個非雙鏈堿基的“雜交泡沫”。
[0091]此處所使用的術(shù)語“核苷酸”是指核酸的一個子單元(無論DNA或RNA或其類似物)，其可以包括，但不限于，磷酸基、糖基、含氮基以及這些子單元的類似物。術(shù)語“核苷酸”和“核苷”包括不僅含有天然存在的嘌呤和嘧啶堿基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)或尿嘧啶(U)的那些基團(tuán)，而且要修飾或模擬本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的堿基。
[0092]此處所使用的術(shù)語“寡核苷酸”是指包含PCR反應(yīng)中使用的足夠數(shù)量的核苷酸堿基的一系列連接的核苷酸殘基。短的寡核苷酸序列可以是基于或由基因組或cDNA序列設(shè)計并用于擴(kuò)增、確定，或揭示特定的細(xì)胞或組織中相同、相似或互補(bǔ)的DNA或RNA的存在。寡核苷酸可以被化學(xué)合成，并且可以被用作引物或探針。此處所使用的術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”也可以是指修飾或未修飾的RNA或DNA。
[0093]術(shù)語“核酸”、“核酸序列”或“寡核苷酸”還包括多核苷酸?！岸嗪塑账帷笔侵敢粋€核苷的3,-羥基基團(tuán)和第二個核苷的5,-羥基基團(tuán)之間的磷酸二酯鍵連接的核苷酸直鏈，反過來通過第三核苷等的3'-羥基基團(tuán)連接到5'-羥基基團(tuán)形成包含通過磷酸二酯骨架相連的核苷的聚合物?！靶揎椀亩嗪塑账帷笔侵付嗪塑账?，其中天然核苷酸已被經(jīng)修飾的核苷酸部分取代。
[0094]術(shù)語“肽核酸(PNA) ”是一個類似DNA或RNA的非天然存在的聚合物，其中主鏈由通過肽鍵連接的重復(fù)的N- (2-氨基乙基)-甘氨酸單位組成。PNA/DNA鏈之間的結(jié)合比DNA/DNA鏈之間的強(qiáng)，因此，相比于在10°C變性的類似的DNA/DNA雙鏈，其6-堿基胸腺嘧啶的PNA/腺嘌呤的DNA雙鏈Tm( “解鏈”溫度)為31°C。
[0095]此處所使用的術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”是指一種熱循環(huán)的、聚合酶介導(dǎo)的DNA擴(kuò)增反應(yīng)，其使用與模板分子、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，以及脫氧核糖核苷酸互補(bǔ)的模板分子、寡核苷酸引物。而且它涉及三個重復(fù)過程(變性、雜交和引物延伸)，它們在不同的溫度和步驟下進(jìn)行。在許多實(shí)施例中，雜交和延伸過程可以同時進(jìn)行。待分析的核苷酸樣品可以由美國專利 6，569，672 ;6，569，627 ;6，562，298 ;6，556，940 ;6，569，672 ;6，569，627 ；6，562，298 ;6，556 ，940 ;6，489，112 ;6，482，615 ;6，472，156 ;6，413，766 ;6，387，621 ；6，300，124 ;6，270，723 ;6，245，514 ;6，232，079 ;6，228，634 ;6，218，193 ;6，210，882 ；6，197，520 ;6，174，670 ;6，132，996 ;6，126，899 ;6，124，138 ;6，074，868 ;6，036，923 ；5，985，651 ;5，958，763 ;5，942，432 ;5，935，522 ;5，897，842 ;5，882，918 ;5，840，573 ；5，795，784 ;5，795，547 ;5，785，926 ;5，783，439 ;5，736，106 ;5，720，923 ;5，720，406 ；5，675，700 ;5，616，301 ;5，576，218和5，455，175中描述的快速循環(huán)工藝提供的一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本發(fā)明。擴(kuò)增的其它方法包括，但不限于，NASBR、SDA、3SR、TSA和滾環(huán)式復(fù)制。
[0096]此處所使用的術(shù)語“聚合酶”是指將連續(xù)加入的單體單元催化為一種聚合物鏈的酶。在本發(fā)明的有利實(shí)施例中，“聚合酶”將通過加入其特性是由一個特定序列的互補(bǔ)模板確定的單體單元起作用。DNA聚合酶如DNA聚合酶I和Taq聚合酶以模板依賴的方式添加脫氧核糖核苷酸到多核苷酸鏈中的3'端，從而合成一個互補(bǔ)的核酸。聚合酶可能會延長引物一次，或使用兩個引物可以重復(fù)擴(kuò)增兩條互補(bǔ)鏈。
[0097]此處所使用的術(shù)語“引物”是指與被擴(kuò)增或復(fù)制的DNA片段互補(bǔ)的寡核苷酸。通常引物用于PCR。一種引物與模板DNA雜交(或“退火”)，并通過聚合酶作為復(fù)制/擴(kuò)增過程的起點(diǎn)被使用。通過“互補(bǔ)”是指該引物序列可與模板形成穩(wěn)定的氫鍵復(fù)合物。
[0098]此處的引物被選擇為“基本上”互補(bǔ)于靶DNA序列的不同鏈，但它們不必反映模板的確切序列。例如，非互補(bǔ)的核苷酸片段可連接到引物的5'端，引物的其余部分與鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。或者，非互補(bǔ)堿基可以穿插入引物，只要與靶雜交有足夠的互補(bǔ)性并引發(fā)延伸產(chǎn)物。
[0099]此處所使用的術(shù)語“探針”是指可變長度的核酸序列的寡核苷酸，適用于相同、相似或互補(bǔ)的核酸序列的雜交檢測。用作檢測探針的寡核苷酸序列可以標(biāo)記有可檢測的基團(tuán)。各種標(biāo)記基團(tuán)是本領(lǐng)域已知的，例如放射性的、熒光性的、化學(xué)發(fā)光的或電化學(xué)發(fā)光的化合物。
[0100]此處所使用的術(shù)語“探針:反義探針”是指具有幾乎或恰好數(shù)目相同的堿基位置的寡核苷酸對，并具有基本上互補(bǔ)的序列，使得在沒有第三核苷酸序列與反義探針或探針雜交時，所述寡核苷酸能夠形成雙鏈。探針和寡核苷酸反義探針作為單獨(dú)分子或連接為一個單一的分子實(shí)體區(qū)域在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0101]此處所使用的術(shù)語“淬火”或“淬火的”或“猝滅”或“猝滅的”是指減少由一個分子產(chǎn)生的信號。它包括，但不限于，降低產(chǎn)生的信號至零或低于檢測限。因此，一個給定的分子可以被另一個分子“猝滅”，盡管該信號被大大降低，仍產(chǎn)生檢測信號。
[0102]術(shù)語“定量PCR”是指實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)，也稱為被用于擴(kuò)增和同時進(jìn)行有針對性檢測靶DNA分子的量 的定量實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR/qPCR/qrt-PCR)。量可被表示為大量的復(fù)制或規(guī)范化為輸入DNA的相對量。檢測不像標(biāo)準(zhǔn)的PCR隨著反應(yīng)實(shí)時進(jìn)行,其中反應(yīng)產(chǎn)物是在其結(jié)束點(diǎn)進(jìn)行檢測。實(shí)時PCR中用于檢測產(chǎn)品的兩種常用方法有:(I)插入任何雙鏈DNA的非特異的熒光染料，和(2)標(biāo)記有熒光受體的序列特異的寡核苷酸和與互補(bǔ)的DNA靶雜交后的許可檢測。
[0103]此處所使用的術(shù)語“選擇性地檢測”是指本發(fā)明的寡核苷酸探針在相同或相似的雜交條件下通過選擇性地雜交到一個序列區(qū)分一個核苷酸序列和另一個核苷酸序列的能力，并且當(dāng)結(jié)合到一個序列而不是其它時，以提供顯示這種結(jié)合的檢測信號。
[0104]此處所使用的術(shù)語“間隔子”是指任何分子實(shí)體，例如，但不限于，多碳間隔子、至少一個人造無堿基核苷酸、肽或可以被連接到寡核苷酸端部或可將兩個寡核苷酸連接在一起的任何其它無堿基延伸部分，以提供阻止聚合酶在間隔子上前進(jìn)的手段。
[0105]此處所使用的術(shù)語“系統(tǒng)”是指至少兩個寡核苷酸的組合進(jìn)行協(xié)作以選擇性地雜交到靶核苷酸序列并產(chǎn)生指示所述靶序列存在的檢測信號。該系統(tǒng)還可以包括寡核苷酸引物，用于從模板核酸擴(kuò)增為核苷酸序列的聚合酶以形成擴(kuò)增的擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子包含被懷疑為靶序列的核苷酸序列。
[0106]此處所使用的術(shù)語“靶”和“靶核苷酸序列”是指期望檢測的寡核苷酸。用于公開方法的靶分析物可能是一個分離的寡核苷酸，固定在載體上或在自由溶液中的寡核苷酸。對于應(yīng)用到本發(fā)明的方法，“靶”可指來自植物、動物或人類個體、細(xì)菌、病毒或單細(xì)胞真核生物，或者是來自整個生物體，及其組織，或者是來自培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞的任何核酸。
[0107]此處所使用的術(shù)語“模板”是指與靶多核苷酸鏈，例如，但不限于，未修飾的天然存在的DNA鏈，其中聚合酶用作識別哪些核苷酸應(yīng)該下一個合并到一個不斷增長的鏈以聚合天然存在的鏈的互補(bǔ)鏈。模板可以是單鏈或雙鏈。在本發(fā)明要求聚合的重復(fù)循環(huán)的應(yīng)用中，例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，模板鏈本身可以經(jīng)修飾的核苷酸的并入而修飾，但仍作為聚合酶的模板來合成另外的多核苷酸。
[0108]此處所使用的術(shù)語“終止子”是指寡核苷酸互補(bǔ)于位于擴(kuò)增子中的核苷酸序列，其中所述“終止子”探針具有耐外切酶的修飾的5'端和阻斷聚合酶活性的修飾的3'端。“終止子探針”的序列可以被選擇或修飾，使得“終止子”探針與其互補(bǔ)的核酸序列的雜交親和性大于寡核苷酸探針與靶核酸序列的雜交親和性，等于寡核苷酸探針與互補(bǔ)的寡核苷酸反義探針的雜交親和性。
[0109]此處所使用的術(shù)語“熱循環(huán)反應(yīng)”是指多步反應(yīng)，其中至少兩個步驟是通過改變反應(yīng)溫度來實(shí)現(xiàn)。
[0110]此處所使用的術(shù)語“熱穩(wěn)定的聚合酶”是指可以承受極高溫度，例如接近100°C的DNA或RNA聚合酶。耐熱聚合酶的例子包括Taq、Tth、Pfu、Vent和deep vent。
[0111]除非另有定義，此處所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有分子生物學(xué)的領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然方法和類似或等同于本文描述的材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中使用，合適的方法和材料如本文所述。
[0112]縮略語
[0113]DDS, DNA檢測開關(guān)；iDDS，內(nèi)部的DNA檢測開關(guān)；EGFR，表皮生長因子受體；qPCR，定量PCR(實(shí)時PCR) ;LNA，鎖核酸；PNA，肽核酸；FISH，熒光原位雜交；Tm，熔融溫度；ISAM，等溫擴(kuò)增法；SNP，單核苷酸多態(tài)性；ZNA，Zip核酸。
[0114]說明書
[0115]本發(fā)明的探針系統(tǒng)、組合物和方法提供了 DNA或RNA靶序列的敏感性和特異性檢測，特別是評估通過實(shí)時PCR(定量PCR)擴(kuò)增和檢測的PCR產(chǎn)物。本發(fā)明的幾個實(shí)施例促進(jìn)了區(qū)分細(xì)菌和病毒病原體，癌癥和遺傳疾病的單堿基變異(單核苷酸多態(tài)性-SNPs)的識別力，其中包括抗藥性或藥物敏感的變異或突變，使得采用普通的實(shí)時PCR探針系統(tǒng)或基于雜交的基因芯片探針的檢測落空。其他實(shí)施例促進(jìn)了相同擴(kuò)增子，如普通的引物序列和可能是變異的內(nèi)部SNP的兩方面檢測，以確定樣品中這樣的變異序列的相對頻率。
[0116]根據(jù)本發(fā)明 的探針:反義探針系統(tǒng)的一個特別有用的應(yīng)用是特定的實(shí)施例，其選擇性增強(qiáng)了在不同于僅有一個不匹配堿基的靶的顯著較大比例存在的類似序列存在時特定靶序列的擴(kuò)增和檢測。例如，生物樣品可以來自患有癌癥的人或動物患者，其中活檢樣品中的所有細(xì)胞由比癌細(xì)胞更大的百分比的正常細(xì)胞組成。因此，提供對應(yīng)于少數(shù)癌細(xì)胞的可檢測信號的同時避免正常細(xì)胞中的假陽性是很重要的。重要的是，在這種情況下，癌細(xì)胞可通過單核苷酸多態(tài)性不同于正常細(xì)胞。因此，本發(fā)明的系統(tǒng)有選擇地從具有感興趣的單個堿基變化(例如，與癌癥相關(guān)的SNP和不占主導(dǎo)地位的正常(野生型)序列的少數(shù)細(xì)胞)擴(kuò)增和檢測靶核苷酸序列是有利的。本發(fā)明的系統(tǒng)中，例如，可以在約99.8%的非突變型靶類中檢測到含有單堿基突變的至少低至0.2%的靶類。
[0117]本發(fā)明包括探針:反義探針組合物的實(shí)施例，此處稱為DNA的檢測開關(guān)(DDS)探針，其中包括兩個標(biāo)記的寡核苷酸、一個寡核苷酸探針和一個寡核苷酸反義探針，即序列互補(bǔ)且長度相同，并且，在與寡核苷酸探針互補(bǔ)的靶核苷酸序列不存在時，相互作用以形成雙鏈。寡核苷酸探針包含與期望被檢測到的靶序列互補(bǔ)的一個序列，并且還包括與其連接的第一標(biāo)記基團(tuán)。本發(fā)明的系統(tǒng)的寡核苷酸反義探針包含互補(bǔ)于通常相同長度的寡核苷酸探針的核苷酸序列，以及與其連接的第二標(biāo)記基團(tuán)?？梢栽O(shè)想，反義探針的核苷酸序列將包括至少一個與寡核苷酸探針的堿基不匹配的堿基。還可以設(shè)想，雖然探針和反義探針的序列是互補(bǔ)的，也具有相同的長度，但其它核苷酸序列可以連接至任一探針或反義探針，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這些連接的序列，當(dāng)延伸至長度相同的探針或反義探針時，本身不雜交并與探針或反義探針相互作用，但優(yōu)選地被選擇為互補(bǔ)，例如，不同于寡核苷酸探針的靶序列的擴(kuò)增子區(qū)域。
[0118]本發(fā)明的系統(tǒng)將表現(xiàn)為:(i)已調(diào)信號狀態(tài)，當(dāng)該寡核苷酸探針結(jié)合到反義探針和其相互作用的標(biāo)記部分被帶到一起時，或(ii)可檢測地區(qū)分的信號狀態(tài)，當(dāng)寡核苷酸探針結(jié)合至靶核苷酸序列且標(biāo)記部分是分開的時。
[0119]在本發(fā)明的探針:反義探針系統(tǒng)的各種實(shí)施例中，特別是當(dāng)系統(tǒng)在實(shí)時PCR分析中使用時，寡核苷酸探針將具有5'端的一個第一標(biāo)記基團(tuán)，其中，所述標(biāo)記基團(tuán)可以是，例如，一個熒光體(熒光團(tuán))，以及相對的3'端被阻斷以防止通過5' -3'聚合酶延伸的寡核苷酸。在這些實(shí)施例中，反義探針可以連接到3'端，第二標(biāo)記基團(tuán)是一個熒光猝滅化合物。相應(yīng)地，如圖1、2、5_7的例子所示，在這些實(shí)施例中，當(dāng)寡核苷酸探針和寡核苷酸反義探針相聯(lián)系時，形成雙鏈核酸，所述第一標(biāo)記基團(tuán)，即，熒光團(tuán)，所述第二標(biāo)記基團(tuán)，即熒光猝滅化合物，被帶入靠近，隨后從所述熒光團(tuán)的熒光發(fā)射被調(diào)制，從而減少或消除任何可檢測的熒光。如果探針優(yōu)先結(jié)合于靶核苷酸序列而不是寡核苷酸反義探針，熒光猝滅化合物和所述熒光團(tuán)在空間上是分離的，熒光發(fā)射不再被猝滅，并且是可檢測的，因此，這表明靶核苷酸序列的存在。
[0120]在匹配靶序列的情況下，寡核苷酸探針更加牢固地結(jié)合到靶序列而不是反義探針序列，引發(fā)檢測信號，并且在一個不正確且不匹配的靶的情況下，探針將更加牢固地結(jié)合到反義探針，從而抑制或防止探針:不匹配的靶雙鏈形成和檢測，即使當(dāng)雜交溫度是未達(dá)最佳標(biāo)準(zhǔn)的。探針序列可以任選地包括被定位在與期望被檢測到的有針對性的變異堿基的位置相差約2個堿基的堿基不匹配的輔助者，這樣如果不同的堿基位點(diǎn)不會與寡核苷酸探針中的相應(yīng)堿基匹配，形成“雜交氣泡”，如圖7B所示，以提高單堿基的識別力，任何未標(biāo)記的3'端被任選地阻斷，以防止聚合酶延伸。[0121]在本發(fā)明系統(tǒng)的其它實(shí)施例中，所述寡核苷酸探針的第一標(biāo)記基團(tuán)可以是熒光猝滅化合物，并且寡核苷酸反義探針的第二標(biāo)記基團(tuán)可以是熒光團(tuán)。進(jìn)一步預(yù)期地，第一標(biāo)記基團(tuán)可以是在刺激時發(fā)射具有第一波長的熒光的第一熒光團(tuán)。探針和寡核苷酸反義探針很近，是由于其彼此雜交，第一標(biāo)記基團(tuán)發(fā)射的熒光可以作為第二標(biāo)記基團(tuán)同樣為熒光團(tuán)(即基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的系統(tǒng))的受激輻射。受激的第二標(biāo)記基團(tuán)，然后可以比所述第一熒光在更長的波長發(fā)射熒光。因此，(i)探針和反義探針結(jié)合時可檢測的熒光波長和(ii)隨著寡核苷酸與靶核苷酸序列復(fù)合，僅當(dāng)探針與反義探針解離時可檢測的探針標(biāo)記基團(tuán)的熒光波長之間是有差異的。
[0122]適當(dāng)選擇用于感興趣的特定靶的探針:反義探針系統(tǒng)的長度和序列，該系統(tǒng)包括熱力學(xué)上有利的兩個結(jié)合和檢測狀態(tài)中的一種固有誤差檢查的機(jī)制。當(dāng)靶核苷酸序列存在相匹配的寡核苷酸探針序列時，狀態(tài)一出現(xiàn)，其中寡核苷酸探針優(yōu)先地與互補(bǔ)的靶序列而不是寡核苷酸反義探針結(jié)合，從而觸發(fā)陽性檢測。當(dāng)沒有靶，或者含有寡核苷酸探針序列的具有至少一個堿基不匹配的靶存在時，狀態(tài)二出現(xiàn)，使得寡核苷酸探針優(yōu)先與寡核苷酸反義探針結(jié)合，從而阻斷或防止不匹配靶的檢測，即使在不理想的雜交或PCR退火溫度下。根據(jù)本發(fā)明的這種探針:反義探針系統(tǒng)的示例已在約52°C至約62°C之間的qPCR退火溫度下達(dá)到單堿基分辨，如圖所示，例如圖6-11。
[0123]另外還發(fā)現(xiàn)，這種分辨被保持，即使當(dāng)相同的測定在低得多的退火溫度(即低于50°C)下運(yùn)行時。該反義探針結(jié)合和阻斷機(jī)制，因此，提供了一個獨(dú)特的多溫機(jī)制，以防止或減少獲得假陽性結(jié)果的可能性。出現(xiàn)這種性能，是因?yàn)樘结?、反義探針和靶序列之間競爭結(jié)合的差異產(chǎn)生三種結(jié)合水平:1)基于探針和一個完全匹配的靶之間的高度互補(bǔ)性結(jié)合的第一高水平；2)基于由反義探針內(nèi)設(shè)計的至少一個不匹配堿基的位置之間造成的探針和反義探針之間的弱結(jié)合的第二中間水平；和3)基于通常發(fā)生在探針和一個不匹配的靶(圖6)之間的大大減少的熱力學(xué)結(jié)合的第三低水平。本發(fā)明的系統(tǒng)，因此，包括一個探針，其首先結(jié)合到一個完全匹配的靶如果這樣的靶是存在的，并且是其次結(jié)合到反義探針如果沒有正確的靶存在。探針結(jié)合到一個不正確的靶，因此，被有效地避免或阻止。
[0124]當(dāng)兩個潛在的靶核苷酸序列不會有兩個或更多個堿基的差異時，這種差異會造成寡核苷酸探針和正確的(匹配的)的靶序列之間熱力學(xué)結(jié)合相對于寡核苷酸探針和不正確的(即不匹配)的靶序列之間的很大差異。在這種情況下，幾乎插入反義探針的任何不匹配將導(dǎo)致探針與反義探針的結(jié)合是(a)探針與匹配的靶結(jié)合及(b)探針與不匹配的靶結(jié)合之間的熱力學(xué)中間物。
[0125]然而，當(dāng)靶是區(qū)別靶和另一個類似的序列之間的單堿基差異時，熱力學(xué)分析表明預(yù)期的變異將不會產(chǎn)生顯著的熱力學(xué)移動，通過包括寡核苷酸探針序列的輔助不匹配進(jìn)一步修飾探針:反義探針系統(tǒng)可能是必要的，該寡核苷酸探針序列通常在期望被檢測到的單堿基變異位點(diǎn)的兩個堿基之內(nèi)，使得探針與非匹配靶的結(jié)合打開一個強(qiáng)調(diào)熱力學(xué)差異(圖7B)的多堿基“雜交泡沫”。探針的修飾可以增加單個堿基的識別力，其中感興趣的不匹配的堿基變異體對TM或Λ G的影響有限。有時不匹配的堿基變異體的Tm僅僅下降約5°C或更低，且AG也可能下降僅2千卡/摩爾或更少。然而，當(dāng)一個輔助不匹配被引入時，相對于所述探針和所期望的靶之間的Tm和AG特性的結(jié)合，Tm可下降至少約10°C _15°C和/或至少約4~5千卡/摩爾對于Δ G0 [0126]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單個堿基分辨是可以被預(yù)料的，如果:(i)含有探針的反義探針不匹配被放置在相比于探針與匹配的靶結(jié)合Tm至少下降約5°C和/或AG至少下降2千卡/摩爾的位置，以及(ii)非匹配單個堿基突變或變異，相比于探針與反義探針的結(jié)合進(jìn)一步降低探針與不匹配的靶結(jié)合為至少約5°C或更多的Tm，或至少約2千卡/摩爾或更多的AG。這些熱力學(xué)參數(shù)通常是通過選擇位于該寡核苷酸探針各端的第二堿基和中央的2個或3個堿基之間的一個不匹配位點(diǎn)以及通過在另外包括A、T或C的位置插入一個不匹配堿基實(shí)現(xiàn)的，其中T堿基通常是插入到A位點(diǎn)，A堿基通常是插入到T位點(diǎn)，或T堿基插入到C位點(diǎn)(形成弱G-T不匹配)。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)在擴(kuò)增過程(如實(shí)時PCR)中被用作側(cè)翼引物之間的內(nèi)部探針時，探針或反義探針的任何未修飾的3'端還應(yīng)當(dāng)被阻止，以防止聚合酶延伸。
[0127]本發(fā)明還包括用于制作單堿基識別的探針:反義探針系統(tǒng)的組合物的方法實(shí)施例，所述方法包括以下步驟:(a)獲得(i) 一個互補(bǔ)于預(yù)定的靶核苷酸序列的寡核苷酸探針，及(ii) 一個與寡核苷酸探針具有相同數(shù)量的核苷酸位置的寡核苷酸反義探針，和互補(bǔ)于探針的一個序列，除了至少一個不匹配或缺失的堿基位置以外，并且其中所述探針和反義探針分別具有與其連接的標(biāo)記基團(tuán)，該標(biāo)記基團(tuán)被選定為當(dāng)探針結(jié)合到反義探針時，以提供經(jīng)調(diào)制的，即陰性的或減少的信號狀態(tài)，并且當(dāng)探針結(jié)合到靶核苷酸序列時提供了一種指示探針:靶雙鏈形成的信號狀態(tài)；(b)通過熱力學(xué)分析確定探針、反義探針和靶序列之間的雜交結(jié)合力；(C)測量探針序列與期望的靶序列，探針序列和反義探針序列，以及探針序列和不匹配的靶序列之間的結(jié)合力，其中結(jié)合力被定義為AG和/或Tm;(d)確定該探針與反義探針的結(jié)合力是否低于探針與匹配靶的結(jié)合力，其中至少約2千卡/摩爾的AG水平和/或至少約5°C的Tm水平的差異，表明該探針將優(yōu)先結(jié)合到匹配的靶序列而不是反義探針；(e)確定探針與非匹配的靶的結(jié)合力是否低于探針與反義探針的結(jié)合力，其中至少約2千卡/摩爾的AG水平和/或至少約5°C的Tm水平的差異，表明該探針將優(yōu)先結(jié)合到反義探針而不是非匹配的靶；(f)確定探針和匹配的靶之間的結(jié)合力相對于探針和反義探針相對于探針和非匹配靶是否存在差異，包括熱力學(xué)結(jié)合的遞減水平，從而使探針結(jié)合到一個正確的靶，如果有的話，其次結(jié)合到反義探針，由此探針結(jié)合到一個不正確的非匹配靶會被避免或防止；(g)任選在反義探針的一個或多個堿基位置對其進(jìn)行修飾，以增加或減少寡核苷酸探針和反義探針之間的結(jié)合力；(h)任選在探針的一個或多個堿基位置以及對應(yīng)于所述靶序列的單堿基多態(tài)性的兩個堿基位置中的一個堿基位置對其進(jìn)行修飾，從而提供一個“雜交泡沫”，當(dāng)探針雜交到具有SNP變異的靶序列的區(qū)域時，由此降低的寡核苷酸探針和不匹配的靶的結(jié)合力；(i)通過使用互補(bǔ)于具有靶而不是SNP的寡核苷酸探針的靶序列測試的探針:反義探針組合物進(jìn)行評估；及(j)重復(fù)步驟(c)-(i)中，由此得到一種從具有至少一種核苷酸差異的類似序列中鑒定靶核苷酸序列的探針:反義探針系統(tǒng)。
[0128]本發(fā)明的探針:反義探針系統(tǒng)的實(shí)施例可包括通過增加探針(通過增加互補(bǔ)結(jié)合具有其對應(yīng)的靶序列)的特異性的一個或多個成分修飾的寡核苷酸探針或反義探針，例如，但不限于核苷酸，而不是腺苷、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶，多個非天然核苷酸，包括但不限于，LNA (鎖核酸)或PNA (肽核酸)或BNA (橋接核酸)，或結(jié)構(gòu)上修飾的MGB (小溝結(jié)合物)，ZNA (Zip核酸)等。
[0129]探針的單個堿基的識別力，其中感興趣的不匹配的堿基變異體對Tm或AG的影響有限。有時不匹配修飾可以增加的堿基變異體的Tm僅僅下降約5°C或更低，且AG也可能下降僅2千卡/摩爾或更少。然而，當(dāng)一個輔助不匹配堿基和“雜交泡沫”被引入時，相對于所述探針和所期望的靶之間的Tm和AG特性的結(jié)合，Tm可下降至少約10°C _15°C和/或至少約4~5千卡/摩爾對于Δ G0 [0130]本發(fā)明的探針:反義探針系統(tǒng)可進(jìn)一步包括選自天然非互補(bǔ)堿基、通用堿基、人工堿基、額外的非匹配堿基、缺失堿基、無堿基位點(diǎn)、間隔子、連接基團(tuán)或能夠減少寡核苷酸探針和寡核苷酸反義探針之間或寡核苷酸探針與所期望的靶序列之間的互補(bǔ)結(jié)合的任何結(jié)構(gòu)方式的探針或反義探針中不匹配堿基的位置。
[0131]為了增強(qiáng)信號或淬火，探針:反義探針系統(tǒng)的實(shí)施例還可以包括兩端被標(biāo)記的寡核苷酸探針和/或寡核苷酸反義探針，其中，探針可包含熒光發(fā)射器和熒光調(diào)制器，和反義探針可以包括熒光調(diào)制器和任選的熒光發(fā)射器，或者，探針可以包括兩個熒光發(fā)射器，和反義探針可以包括兩個熒光調(diào)制器。如果寡核苷酸探針包含3'熒光發(fā)射器，該端部可任選地采用寡核苷酸探針和3'熒光團(tuán)之間的間隔子域進(jìn)行修飾。
[0132]本發(fā)明的實(shí)施例還包括將探針:反義探針系統(tǒng)并入實(shí)時PCR檢測的系統(tǒng)。這些實(shí)施例包括，但不一定限于:
[0133]1.1DDS探針:用于qPCR如圖1B所示，其中，所述寡核苷酸探針被選擇為位于二側(cè)翼的PCR引物之間且與靶序列互補(bǔ)的；并且其中所述寡核苷酸探針或反義探針的任何未標(biāo)記的3'端被封閉以防止聚合酶從此延伸。iDDS探針特別適合于在不同于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的期望序列的相關(guān)序列存在時檢測期望的靶核苷酸序列。
[0134]2.探針:反義探針組合物還可以包含標(biāo)記的探針和其末端連接到包含一種分子的反義探針組分，其中所述反義探針組分包括一個序列，該序列是缺乏互補(bǔ)結(jié)合到探針組分，相比于探針對靶核苷酸序列的親和力。
[0135]3.ZIPR探針:對于如圖1C所示的定量PCR的使用，標(biāo)記的探針，被稱為“ZIPR探針”，包括含有引物序列的寡核苷酸探針，由此允許PCR擴(kuò)增產(chǎn)物末端的靶段而不是位于PCR引物位點(diǎn)之間的內(nèi)部序列的擴(kuò)增和同時檢測，其中，所述寡核苷酸ZIPR探針的3'端沒有被阻斷，以防止聚合酶延伸。配對的寡核苷酸反義探針也有助于減少假靶檢測。兩個這樣的引物-探針可在待擴(kuò)增的靶的相對端被使用，其中它們可以包括相同的標(biāo)記，以提供雙重的信號?；蛘?，他們可以被各自不同標(biāo)記，以提供兩種顏色的信號。
[0136]4.FLIP探針:對于擴(kuò)增靶的高特異性實(shí)時檢測或終點(diǎn)檢測，如圖2A所示，探針:反義探針系統(tǒng)的反義探針組分可以包括通過無堿基連接基團(tuán)，如間隔子連接到寡核苷酸引物的5,端的標(biāo)記片段。該探針:反義探針結(jié)構(gòu)的這種修飾會改變引物的動力學(xué)，使得檢測信號呈現(xiàn)出線性擴(kuò)增曲線和正常S形的擴(kuò)增曲線，以便檢測與樣品的定量評估通過在擴(kuò)增過程中的實(shí)時監(jiān)控能夠準(zhǔn)確地在終點(diǎn)獲得，如圖所示，例如，在圖13A中。探針和反義探針的序列也可以是完全互補(bǔ)的，沒有不匹配，除了將探針制作得比反義探針序列略長一個或多個堿基。該探針:反義探針組合物產(chǎn)生的線性擴(kuò)增曲線可與LATE PCR產(chǎn)生的線性曲線相提并論。在LATE-PCR中，然而，線性擴(kuò)增是通過提供不相等的濃度的引物與一種導(dǎo)致不對稱擴(kuò)增(Sanchez et al.(2004) 101:1933-1938 ；ffangh et al.US Pat.N0.:7,632,642)的量的嚴(yán)重限制的引物。
[0137]5.G-Fo rce探針:對于在實(shí)時PCR中的使用，如圖2C所示，是一個引物-寡核苷酸探針，此處稱為“G-Force”探針，具有三個片段:標(biāo)記的探針片段，可以與探針片段一起折疊的反義探針片段，3'端的靶特異性引物片段。該探針片段是5,熒光團(tuán)標(biāo)記的，并包括約6至約9個堿基的富C序列。該反義探針片段是富G且與富C片段互補(bǔ)，并包括約6至約10個堿基。當(dāng)這些段折疊和雜交在一起時，由于它們的互補(bǔ)序列，反義探針片段中的鳥嘌呤作為猝滅劑，以吸收探針的熒光發(fā)射。探針和反義探針片段由無堿基連接基團(tuán)，例如間隔子連接，以方便這些片段折疊和結(jié)合在一起，并且可以防止探針片段的復(fù)制，當(dāng)引物-探針結(jié)合到擴(kuò)增子時。無堿基連接基團(tuán)可以通過一個或多個A或T堿基分開，以方便折疊及探針與反義探針的結(jié)合。
[0138]這種G-Force探針:反義探針系統(tǒng)具有兩個結(jié)構(gòu)和信號狀態(tài):(i)當(dāng)該引物-探針不與另一個雜交核酸結(jié)合時，折疊結(jié)構(gòu)和信號狀態(tài)出現(xiàn)，其中富胞嘧啶核苷片段折疊并結(jié)合到富含鳥嘌呤片段，使得熒光發(fā)光標(biāo)記緊接著熒光吸收的鳥嘌呤，及(ii)當(dāng)該引物-探針結(jié)合到擴(kuò)增的靶時，第二結(jié)構(gòu)和信令狀態(tài)出現(xiàn)，于是信號單元被展開和熒光發(fā)射被釋放。然而，第一個擴(kuò)增循環(huán)后，靶模板被永久地加入互補(bǔ)于富含鳥嘌呤反義探針片段的序列，從而方便了隨后的擴(kuò)增循環(huán)中的探針結(jié)合和信號。因此，擴(kuò)增的靶被標(biāo)記，并采用一熒光團(tuán)每擴(kuò)增子定量檢測。具有相同或不同標(biāo)記的類似的引物-探針可用于擴(kuò)增子的另一端，以提供雙重信號或兩種顏色的信號。
[0139]在本系統(tǒng)的一個優(yōu)選實(shí)施例中，G-Force的引物探針具有組成為FAM-CCCCTCCA-間隔子18_AGGAGGGGG并加上Y引物的Y _?>丨探針:反義探針結(jié)構(gòu)。由于反義探針段上的額外G，當(dāng)富C探針片段結(jié)合到富G反義探針段上時，熒光團(tuán)將在至少兩個G堿基的附近?；蛘?，所述探針可以具有包含探針區(qū)段的5’端附近的約兩個或多個C和反義探針區(qū)段的3'端附近的約兩個或多個G的互補(bǔ)序列。[0140]6.雙DDS探針:可以設(shè)想，根據(jù)本發(fā)明的兩個DDS探針系統(tǒng)可以同時被用來檢測相同的擴(kuò)增靶的不同部分，示意性圖見圖2B和2C。這種系統(tǒng)可以包括標(biāo)記的引物-探針，例如但不限于，ZIPR探針、G-Force探針、FLIP探針等，以檢測和定量擴(kuò)增靶，并結(jié)合被不同地標(biāo)記的內(nèi)部iDDS探針，以檢測和定量具有特定的內(nèi)部序列，如SNP變異的那些擴(kuò)增靶。
[0141]還可以預(yù)期的是，本發(fā)明的實(shí)施例可包含根據(jù)本發(fā)明的多個探針:反義探針系統(tǒng)，能夠選擇性地檢測多個靶序列，其中相對于第二探針的陰性或弱信號的第一探針的陽性信號證實(shí)了包含第一靶序列的變異或突變序列的存在。
[0142]一種用于本實(shí)施例中的合適的內(nèi)部探針可包含iDDS探針:反義探針系統(tǒng)。一個有用的，但不是限制性的，引物-探針可以是G-Force引物-探針，其中該引物-探針量化擴(kuò)增的靶,并且該內(nèi)部探針:反義探針組合物量化特定的內(nèi)部靶序列的頻率。兩種探針的使用允許感興趣的變異序列的相對頻率的測量。在實(shí)時PCR中，引物-探針可以顯示出陡升曲線，內(nèi)部探針顯示出具有較低的角度與突變或變異體的頻率成比例的曲線，如圖所示，例如，在圖16A和16B中。[0143]分子診斷的一個共同問題是所有可能對基因產(chǎn)物或基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)和功能有類似影響的不同的且密切相關(guān)的小突變的發(fā)生。例如，肺癌的診斷和治療可以通過在EGFR基因和或KRAS基因的幾個突變的生物標(biāo)記的分析來確定。然而，在一些重要的疾病特異性突變可以包括一個單堿基置換，如EGFR外顯子21突變L858R2573T > G，其它癌癥生物標(biāo)記是多變的，盡管它們被被限制在一個小的序列區(qū)域內(nèi)。臨床上，知道哪些特定缺失或堿基替換不是那么重要，因?yàn)橐幌盗羞@樣的突變中的任何一個的臨床結(jié)果實(shí)際上是相同的。而測序可以執(zhí)行以確定是否任何這樣的密切相關(guān)的突變存在，測序不是有效的，當(dāng)突變頻率小于約10%時。克服這個問題的方法之一是采用針對同樣模板的兩個探針，一個檢測野生序列是否存在，另一個為非特異性的，并檢測任何野生或突變序列，由此信號的差異可以指示突變的存在，而不是指定哪種突變是存在的。這兩種探針的方案可以與iDDS探針或特異于檢測同一靶區(qū)域內(nèi)的任何變異的野生型非特異性引物-探針的引物-探針一起應(yīng)用。
[0144]7.1DDS和終止子探針:本發(fā)明的另一個方面是，探針:反義探針系統(tǒng)可以適當(dāng)?shù)赜糜谶m合實(shí)時PCR或其它擴(kuò)增檢測方法的兩個探針靶增強(qiáng)系統(tǒng)，以選擇性地擴(kuò)增和檢測與密切相關(guān)的第二靶核苷酸序列相差一個或多個堿基的第一靶核苷酸序列。一般而言，所述第一靶序列是感興趣的突變和所述第二靶序列可以是野生型(“正?！?序列。這兩種探針系統(tǒng)包括第一標(biāo)記的內(nèi)部探針:反義探針系統(tǒng)諸如iDDS探針和第二非標(biāo)記的內(nèi)部“終止子”探針(稱為“野生終止子”如果特異于野生型核苷酸序列變異)，其具有的PCR聚合酶阻斷功能，如圖3A和3B所示。
[0145]第一探針包括第一靶序列或其互補(bǔ)，并具有只與第一個靶序列但不是第二靶序列匹配的至少一個堿基位置。終止子探針包含第二靶序列或其互補(bǔ)，并且包括存在于所述第二靶序列而不是第一靶序列中的至少一個堿基位置。終止子探針在5'端被進(jìn)一步修飾，以抑制或防止其5'核酸酶的消化，以及在3'端被修飾，以抑制或防止3'聚合酶從此處延伸。
[0146]終止子探針的長度和/或位置可以被選擇，使得所述終止子探針和所述第二靶序列的親合性大于所述第一探針和所述第一靶序列的親合性。優(yōu)選地，用于第二靶核苷酸序列的所述第一探針和所述終止子探針的親合性親和力可能會有至少約6°C的Tm差異和/或至少約4千卡/摩爾或更多的AG差異。另外，終止子探針可任選地被改性，以通過使用一個或多個人工核苷酸如LNA，化學(xué)修飾物如ZNA或MGB探針，或其組合進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)合其匹配靶序列。
[0147]因?yàn)閮蓚€探針之間的熱力學(xué)差異，終止子探針能夠強(qiáng)力結(jié)合第二靶序列，并會抑制或阻止所述第二靶序列的擴(kuò)增。它也將抑制或阻止所述第一探針與第二靶序列的結(jié)合。因此，該系統(tǒng)將選擇性擴(kuò)增和/或檢測所述第一靶序列，從而提供用于檢測稀有或低頻率的突變或變異體如在癌癥診斷、藥物抗性或產(chǎn)前遺傳篩查中的靶增強(qiáng)系統(tǒng)。
[0148]終止子探針可在其U端通過連接一個分子如生物素、ZNA、MGB、BHQ等，并入2' -O-甲基RNA堿基，連接一段隨機(jī)選擇的非互補(bǔ)堿基被修飾。終止子探針可以在其3'端通過連接一個阻斷分子(例如，磷酸鹽、間隔子、氨基等)，或一系列隨機(jī)選擇的非互補(bǔ)堿基被修飾。
[0149]因此，本發(fā)明的兩個探針靶增強(qiáng)系統(tǒng)可用于選擇性地擴(kuò)增和檢測與第二靶序列相差一個或多個堿基的第一靶序列的方法，雖然所述第二靶序列的量顯著地大于所述第一靶序列時。此方法的實(shí)施例， 因此，可以包括以下步驟:(a)獲得檢測探針:反義探針系統(tǒng)，未標(biāo)記的終止子探針，和一對側(cè)翼引物；其中:所述檢測探針:反義探針系統(tǒng)包括一個標(biāo)記的探針:反義探針系統(tǒng)，其中所述標(biāo)記的探針包含第一靶核苷酸序列或其互補(bǔ)；終止子探針，其特征為:(i)包括所述第二靶核苷酸序列或其互補(bǔ)，其中，所述第二靶序列的終止子探針的結(jié)合親和力大于所述第一靶序列的標(biāo)記探針的結(jié)合親和力，(ii)具有5'端修飾以抑制或防止5'核酸酶消化，(iii)具有3'端修飾以抑制或阻止3'聚合酶延伸，以及(iv)具有大于所述標(biāo)記探針的長度，并任選地包括內(nèi)部或末端修飾，以提高如LNA或BNA、ZNA或MGB的結(jié)合；(b)獲得疑似包含所述第一或第二靶序列，或其混合物的生物樣品；(c)預(yù)擴(kuò)增所述第一靶序列，同時阻止所述第二靶序列與終止子探針的擴(kuò)增；其中，該步驟任選地包括在在約48°C至約57°C低溫退火的約30至約75個PCR循環(huán)，并且其中每個變性、退火或延伸步驟被限制到約5秒或更少；(d)預(yù)擴(kuò)增樣品的小份或稀釋的小份與一對側(cè)翼引物及探針:反義探針系統(tǒng)的結(jié)合，所述小份為擴(kuò)增反應(yīng)的約5%或更少，并且稀釋的小份為至少約I: 100，并且通常在1: 300至約1: 1000的范圍內(nèi)；以及(e)通過實(shí)時PCR或其它手段擴(kuò)增和檢測第一靶序列的存在。
[0150]本發(fā)明的兩個探針靶增強(qiáng)系統(tǒng)提供懷疑含有低頻率的第一靶序列(通常，但不限于，所感興趣的突變序列)與相當(dāng)高頻率的第二靶序列(例如，但不限于野生型序列)的混合物的樣品的實(shí)時PCR分析。因?yàn)檫@兩個靶模板被相同的引物擴(kuò)增，PCR反應(yīng)組分(引物、酶等)將被更豐富的模板耗盡，在某種程度上第一靶序列的擴(kuò)增和檢測將被抑制或防止。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如，對約2%到約0.002%的含量范圍內(nèi)的低頻率突變進(jìn)行有效地檢測。此外，可以設(shè)想，該方法將用于篩選血液或遠(yuǎn)離來源的其它組織中的低頻率突變或變異。
[0151]該方法可通過提供上述步驟(e)中針對所述第二靶序列的另一個探針:反義探針組合物進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，以證實(shí)所述第二靶序列的抑制或阻斷。這個改進(jìn)的方法可產(chǎn)生兩種擴(kuò)增曲線:第一曲線，表明所述第一靶序列(通常是陽性和表示感興趣的突變)增強(qiáng)的存在，而第二曲線，表明所述第二靶序列的減少的存在(通常為陰性和表示感興趣的野生或正常序列)。
[0152]8.DDS的引物-探針和終止子探針:本發(fā)明的兩個探針靶增強(qiáng)系統(tǒng)可通過采用可以非特異性地擴(kuò)增和檢測終止子探針靶向的至少一部分序列區(qū)域的引物-探針組合物替換PCR引物進(jìn)行進(jìn)一步修飾。為了達(dá)到這個目的，引物-探針包括優(yōu)于終止子探針的全部或一部分靶區(qū)域的一個引物序列。由于引物-探針可以在該區(qū)域內(nèi)擴(kuò)增任何野生或突變序列，包括堿基替換、缺失或插入，并且如果野生序列已經(jīng)由終止子探針特定地阻斷，那么引物-探針的陽性信號表明一個突變序列存在于該靶區(qū)域內(nèi)。因此，一個測定系統(tǒng)可以檢測多個感興趣的序列變異體，并不需要多個序列特異性檢測。采用這個系統(tǒng)，引物-探針可以是ZIPR探針、G-Force探針、半通用探針、通用探針、SUNRISE.RTM探針或任何其它適合于實(shí)時PCR檢測的引物-探針。此系統(tǒng)可以與一個兩步或一步過程一起使用，如圖3A和3B所示。
[0153]為了證實(shí)非特異性突變的檢測，可以使用包括所述第二靶序列或其互補(bǔ)的第二探針:反義探針組合物。采用這種修飾，所述第二探針:反義探針的陰性或減弱的信號以及含有引物-探針的陽性信號可以確認(rèn)樣品中的變異或突變序列的存在。
[0154]本發(fā)明的探針:反義探針系統(tǒng)的任何探針可以被固定到基底上，優(yōu)選地通過共價連接基團(tuán)，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法，以及反義探針與未標(biāo)記的靶一起被加入到溶液中。當(dāng)使用一個共同的雜交溫度時，單堿基識別力可采用多個靶SNPs來實(shí)現(xiàn)，即使每個探針針對有點(diǎn)不同的雜交溫度可能已經(jīng)被優(yōu)化。當(dāng)檢測多種特異性高的靶，如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或單堿基突變時，此溫度耐受特性使設(shè)計更簡單，性能更可靠。9.DDS的探針和等溫擴(kuò)增方法(ISAM):本發(fā)明還提供了一種并入此處公開的探針:反義探針系統(tǒng)的等溫擴(kuò)增法(ISAM)，以指數(shù)擴(kuò)增DNA或RNA靶和實(shí)時或終點(diǎn)檢測產(chǎn)品，該方法包括以下步驟:(a)獲得含有RNA或DNA靶序列的樣品；(b)加入到所述樣品⑴可以等溫擴(kuò)增靶序列的一對寡核苷酸引物，其中任一個引物或兩個引物包含RNA聚合酶啟動子序列，(ii) 一個寡核苷酸引物-探針，其包含第一引物序列，和一個匹配的反義探針，或者包括RNA聚合酶啟動子序列和所述第一引物序列和與RNA聚合酶啟動子序列互補(bǔ)的反義探針的任選的兩個引物-探針段，(iii)包含RNA聚合酶啟動子序列和第二引物序列的修飾引物，或任選地，包含RNA聚合酶啟動子序列和第二引物序列和與RNA聚合酶啟動子序列互補(bǔ)的反義探針的兩段引物-探針，和(iv)包含反應(yīng)緩沖液、RNA聚合酶啟動子、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNase H的反應(yīng)混合物；(c)在等溫或接近等溫的條件下擴(kuò)增靶序列，所述條件包括在約35°C至約50°C范圍內(nèi)的單一溫度，任選地在約40°C到約42°C的范圍內(nèi)，或包含兩個交替的溫度，每個所述溫度在約35°C至約50度的范圍內(nèi)，任選地在約40°C和45°C之間交替變化；和(d)在擴(kuò)增期間或在定義的終點(diǎn)周期性地測定該熒光信號以確定擴(kuò)增靶序列的存在和頻率。
[0155]采用上述探針:反義探針組合物和擴(kuò)增的方法，一種RNA靶序列可以被直接擴(kuò)增，以產(chǎn)生一端或兩端附加有RNA聚合酶的啟動子序列和熒光供體標(biāo)記的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。DNA靶標(biāo)產(chǎn)品可以被類似地擴(kuò)增、修飾和標(biāo)記。采用這種方法，最大指數(shù)擴(kuò)增可以在大約20至30分鐘發(fā)生，速度比典型的PCR或?qū)崟rPCR的方法更快，其中每個步驟受所使用的循環(huán)條件(圖4A，18)的速率限制。雖然采用某些序列條件可能難以實(shí)現(xiàn)ISAM擴(kuò)增，ISAM靶擴(kuò)增是更加有效的(產(chǎn)生20~50%的產(chǎn)品)，當(dāng)這兩個引物都附加有RNA聚合酶的啟動子序列時。
[0156]在本發(fā)明這種方法的另一個實(shí)施例中，探針:反義探針組分可以針對引物位點(diǎn)之間的內(nèi)部序列。在本實(shí)施例中，探針可以包含熒光供體-受體對的第一標(biāo)記組分和引物序列內(nèi)部的序列。該反義探針可以包含熒光供體-受體對的第二標(biāo)記組分，和互補(bǔ)結(jié)合到探針時(圖4B，19)部分缺乏的序列。反義探針還可以包括在互補(bǔ)結(jié)合到探針時不匹配或缺乏的多個堿基位置。低溫等溫擴(kuò)增的條件需要此反義探針序列修飾的結(jié)構(gòu)。
[0157]在上述探針:反義探針組合物的另一個實(shí)施例中，再加上ISAM等溫擴(kuò)增方法，弓丨物或引物-探針的5'端可以被固定到陣列基板，最佳地通過共價連接基團(tuán)，并且該RNA或DNA靶是等溫擴(kuò)增而連接在芯片基板上。(圖4C，20)采用此方法，多個靶可以被檢測到，因?yàn)樗鼈兪菍?shí)時或終點(diǎn)擴(kuò)增的。而且洗滌步驟是必需的，以除去未結(jié)合的標(biāo)記的探針。
[0158]本發(fā)明的一方面，因此，包括一種用于選擇性地檢測靶核苷酸序列的系統(tǒng)的實(shí)施例，所述系統(tǒng)包括:至少一個探針:反義探針系統(tǒng)，其中包括:(a)包括與第一靶核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸探針，以及與其連接的標(biāo)記基團(tuán)；和(b)包括與寡核苷酸探針完全互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸反義探針，除了非終止位置的至少有一個不匹配堿基，而第二標(biāo)記基團(tuán)，其中，所述第二標(biāo)簽基團(tuán)連接到寡核苷酸反義探針或者是寡核苷酸反義探針的區(qū)域，其中:(i)該寡核苷酸探針被配置為對第一靶核苷酸序列的雜交親和力高于對寡核苷酸反義探針的雜交親和力；和寡核苷酸探針被配置為對寡核苷酸反義探針的雜交親和力高于所感興趣的第二靶核苷酸序列的雜交親和力；(ii)在第一靶核苷酸序列存在時，寡核苷酸探針和所述第一靶核苷酸序列形成雙雙鏈，由此所述第一和第二標(biāo)記基團(tuán)的不發(fā)生相互作用，從而提供了一個第一檢測信號；(iii)在所述第一靶核苷酸序列不存在時，該寡核苷酸探針和寡核苷酸反義探針形成雙鏈，從而使所述第一和第二標(biāo)記基團(tuán)發(fā)生相互作用以提供經(jīng)調(diào)制的檢測信號，其中所述第一信號和調(diào)制檢測信號是有區(qū)別的；及
(iv)在與所述第一靶序列相差至少一個堿基不匹配的不同的第二靶核苷酸序列存在時，寡核苷酸探針和寡核苷酸反義探針優(yōu)先形成雙鏈，由此從形成抑制寡核苷酸探針與第二靶核苷酸序列形成雙鏈。
[0159]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，寡核苷酸探針和所述第一靶核苷酸序列，寡核苷酸探針和寡核苷酸反義探針的雙鏈會有至少約2千卡/摩爾的AG差異和至少約4°C的Tm差異；并且其中所述寡核苷酸探針和所述第二靶核苷酸序列的雙鏈，并且所述寡核苷酸探針和所述第一靶核苷酸序列的雙鏈會有至少約4千卡/摩爾的AG差異以及至少約8°C的Tm差異。
[0160]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，寡核苷酸探針序列可以在與第二靶核苷酸序列與探針序列之間的預(yù)期不匹配差約兩個堿基的不匹配堿基的位置進(jìn)行配置；據(jù)此，兩個不匹配堿基產(chǎn)生一個寡核苷酸探針:第二靶核苷酸序列雙鏈的內(nèi)部兩個或三個堿基的未雜交區(qū)域，從而具有小于寡核苷酸探針:寡核苷酸反義探針雙鏈的AG和Tm。
[0161]在本發(fā)明的這一方面的實(shí)施例中，寡核苷酸探針可連接到固體基底上。
[0162]在本發(fā)明的這一方面的實(shí)施例中，一個標(biāo)記基團(tuán)可以是熒光發(fā)射器，另一標(biāo)記基團(tuán)可以包括選自以下組中的熒光調(diào)制器:淬滅劑化合物、熒光化合物、金屬顆粒以及富含鳥嘌呤的綴合物。
[0163]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，寡核苷酸探針可以包含一個熒光發(fā)射器以及一個熒光調(diào)制器或一個第二熒光發(fā)射器，并且其中所述寡核苷酸反義探針包含熒光調(diào)制器和任選地包含一個突光發(fā)射 器或第二突光調(diào)制器。
[0164]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，至少一個探針寡核苷酸探針和寡核苷酸反義探針可以包含至少一種:非天然核苷酸、小溝結(jié)合物(MGB)以及拉鏈核酸(ZNA)。
[0165]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)可以是一個iDDS探針，其中所述探針寡核苷酸的3'末端，以及任選的寡核苷酸反義探針，可以被阻斷，以防止聚合酶延伸；并且其中所述系統(tǒng)還可以包括一對被配置用于擴(kuò)增包含第一靶核苷酸序列的核酸區(qū)域的側(cè)翼引物。
[0166]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)可以是一個Flip探針，其中所述寡核苷酸反義探針可以進(jìn)一步包括，在3'端上，第一寡核苷酸引物和該系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括第二寡核苷酸引物，其中所述第一和第二寡核苷酸引物可以被配置用于擴(kuò)增包含第一靶核苷酸序列的核酸區(qū)域。
[0167]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，寡核苷酸反義探針與第一寡核苷酸引物可以通過無堿基的間隔子連接。
[0168]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)可以是一個包含引物-探針擴(kuò)增子檢測系統(tǒng)的ZIPR探針，其中所述寡核苷酸探針包含一個引物序列和被配置成與寡核苷酸引物進(jìn)行合作，以擴(kuò)增靶核苷酸序列，由此當(dāng)寡核苷酸探針被并入到擴(kuò)增子時，產(chǎn)生檢測信號。
[0169]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)還可以包括一個第二寡核苷酸探針，其中所述第一和第二寡核 苷酸探針選擇性地與核酸模板的不同靶核苷酸序列進(jìn)行雜交；并且其中兩個寡核苷酸探針可以具有連接到其上的標(biāo)記基團(tuán)，并且其中所述標(biāo)記基團(tuán)提供了兩種不同的檢測信號或相同的檢測信號。
[0170]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，第一寡核苷酸探針可以包含被配置為與一個寡核苷酸引物合作來擴(kuò)增第一擴(kuò)增子與第一標(biāo)記的引物-探針，從而提供了相對擴(kuò)增子頻率的信號，并且其中所述寡核苷酸探針是第二引物-探針或可以包含第二標(biāo)記和與靶序列互補(bǔ)的序列的內(nèi)部探針；其中所述靶序列可包含所述第一擴(kuò)增子的可變序列段，或在核酸模板別處的可變序列；因此，第一引物-探針和第二探針之間的信號差異提供了相對于所述第一擴(kuò)增子頻率的變異序列的頻率的指示。
[0171]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，至少一個探針系統(tǒng)以從以下組成的組中選擇:ZIPR引物-探針，內(nèi)部iDDS探針或內(nèi)部Flip探針。
[0172]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，引物-探針系統(tǒng)可選地包括一個G-Force引物-探針，其中包含:α)5'熒光標(biāo)記的探針片段，含有約7至9個堿基的富胞嘧啶序列，
(ii)無堿基間隔子團(tuán)，(iii)與富胞嘧啶序列區(qū)域互補(bǔ)的富含鳥嘌呤序列，以及(iv)的引物序列；因此，當(dāng)被標(biāo)記的寡核苷酸引物-探針被并入到所產(chǎn)生的擴(kuò)增子時，檢測信號被激活。
[0173]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，所述系統(tǒng)還包括適于擴(kuò)增并測定RNA或DNA靶序列的ISAM等溫擴(kuò)增系統(tǒng)，其中所述寡核苷酸引物-探針被配置成與側(cè)翼引物配合以擴(kuò)增靶序列；其中所述側(cè)翼引物進(jìn)一步包含5' RNA聚合酶啟動子序列；并且其中所述擴(kuò)增檢測系統(tǒng)還包括RNA聚合酶啟動子的酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNaseH酶；其中所述寡核苷酸引物-探針任選地包含5' RNA聚合酶啟動子序列；并且其中一個寡核苷酸反義探針任選地包含一個與RNA聚合酶啟動子序列互補(bǔ)的序列；并且其中所述寡核苷酸引物-探針被配置為包含一個或兩個引物；因此，信號傳遞和RNA轉(zhuǎn)錄是從擴(kuò)增子的一端或兩端提供的；以及任選地，一個引物被固定在固體基底上。[0174]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，所述系統(tǒng)還包括適于擴(kuò)增并測定RNA或DNA靶序列的一個ISAM等溫擴(kuò)增系統(tǒng)，其中，所述iDDS寡核苷酸探針互補(bǔ)于一個包含約20至約25個核苷酸長的內(nèi)部靶序列；并且其中，所述寡核苷酸反義探針包含約10至約15個核苷酸；并且其中一個或兩個側(cè)翼引物另外包含5' RNA聚合酶啟動子序列；和包括RNA聚合酶啟動子的酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNaseH酶的擴(kuò)增檢測系統(tǒng)；以及任選地，一個引物被固定在固體基底上。
[0175]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)被配置為檢測EGFR基因外顯子21的可變核苷酸堿基的位置，所述系統(tǒng)包括所述寡核苷酸SEQ ID NOS:7-12和39-41。
[0176]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)被配置為檢測EGFR基因外顯子19的密碼子746至753內(nèi)的可變多堿基缺失，所述系統(tǒng)包括至少一個未標(biāo)記的引物，和含有不同標(biāo)記的兩個探針:反義探針系統(tǒng)；其中，所述第一探針系統(tǒng)包括一個與非特異性的第一序列互補(bǔ)的引物-探針；其中，所述第二探針系統(tǒng)與外顯子19缺失位點(diǎn)的野生序列互補(bǔ)，并抑制或排除包含EGFR基因外顯子19的密碼子746至753內(nèi)多堿基缺失的靶模板的檢測；因此，外顯子19缺失的存在和頻率是通過比較兩個探針系統(tǒng)的相對信號進(jìn)行評估。
[0177]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，非特異性探針:反義探針-引物組是SEQ IDNOs.:56，57和53，或SEQ ID NOs.:79，80和12 ;并且其中，所述缺失-19野生型-僅探針:反義探針-引物組是SEQ ID NOs.:81，82，和53，或SEQ ID NOs:54，55和53，并且其中每個非特異性探針:反義探針-引物組和缺失-19野生型-僅探針:反義探針-引物組可任選地包括補(bǔ)充的引物SEQ ID N0.:78o
[0178]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，寡核苷酸反義探針與Taqman或分子信標(biāo)探針檢測相結(jié)合；其中寡核苷酸反義探針包含熒光調(diào)制器，并包含部分互補(bǔ)到Taqman或分子信標(biāo)探針的一個序列。
[0179]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，探針:反義探針系統(tǒng)被配置為檢測EGFR基因的外顯子19、20或21、VK0RC1基因、CYP2C9基因、大腸桿菌的uidA基因、革蘭氏陽性細(xì)菌的16S基因、革蘭氏陰性細(xì)菌的16S基因、分枝桿菌(mycobacterium)的inhA基因、分枝桿菌的rpoB基因、分枝桿菌的16S基因、流感病毒的血凝素(HA)基因、A型流感病毒的基質(zhì)(M)基因、B型流感病毒的非結(jié)構(gòu)(NS)基因、KRAS基因的核苷酸變異體。
[0180]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，探針:反義探針系統(tǒng)包括選自以下組中的核酸序列:SEQ ID NOS:1 和 2，SEQ ID NO:3 和 4，SEQ ID NO:7 中和 8，SEQ ID NO:9 和 10，SEQID NOS:13 和 14，SEQ ID NOS:17 和 18，SEQ ID NOS:19 和 20，SEQ ID NOS:23 和 24，SEQIDNOS:36和 37，SEQ ID NOS:54和 55，SEQ ID NOS:56和 57，SEQ ID NOS:64和 65，SEQ IDNOS:66 和 67，SEQ ID NO:70 和 71，SEQ ID NOS:72 和 73，SEQ ID NOS:79 和 80，SEQ IDNOS:81 和 82，SEQ ID NOS:85 和 86，SEQ ID NOS:88 和 89，和 SEQ IDNOS:91 和 92。
[0181]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括用于選擇性地抑制相對于第二個靶序列的第一靶序列的定量PCR擴(kuò)增和檢測的未標(biāo)記的阻斷終止子探針；其中所述終止子探針包含:(i)互補(bǔ)于所述第一靶核苷酸序列的寡核苷酸，(ii)5,端修飾的抗核酸外切酶消化，端修飾的抗聚合酶延伸，以及(iv)其中所述終止子探針進(jìn)一步配置有一個Tm和AG，其超出qPCR分析的引物和/或探針的Tm和AG至少約5千卡/摩爾的AG值和至少約5°C的Tm值。[0182]在本發(fā)明這一方面的實(shí)施例中，該系統(tǒng)，為了增強(qiáng)結(jié)合，終止子探針還包括至少一個非天然核苷酸、一個小溝結(jié)合物(MGB)以及一個Zip核酸(ZNA)。
[0183]本發(fā)明的另一方面包括qPCR靶增強(qiáng)系統(tǒng)的實(shí)施例，其中所述系統(tǒng)包括第一子系統(tǒng)和第二子系統(tǒng)，其特征在于，所述第一子系統(tǒng)包括:(i)互補(bǔ)于所述第一靶核苷酸序列的未標(biāo)記的寡核苷酸終止子探針，及(ii)被配置為擴(kuò)增包括第一和第二靶核苷酸序列的核酸區(qū)域的一個引物對；和第二子系統(tǒng)包括:(i)由所述第一預(yù)擴(kuò)增子系統(tǒng)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋小份，其中所述稀釋小份包含約0.05%或更少的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；(ii)互補(bǔ)于至少一種第二靶核苷酸序列的至少一種探針:反義探針系統(tǒng)，以及(iii)被配置為擴(kuò)增包括所述第一和第二靶核苷酸序列的核酸區(qū)域的至少一種引物；因此，所述第一子系統(tǒng)的預(yù)擴(kuò)增與所述第二子系統(tǒng)的再擴(kuò)增和檢測提供了選擇性擴(kuò)增和檢測第二靶核苷酸序列的手段，當(dāng)所述第一靶核苷酸序列的頻率超過所述第二靶核苷酸序列的頻率20: I或更高的比例時。
[0184]應(yīng)當(dāng)強(qiáng) 調(diào)的是，本發(fā)明的實(shí)施例，特別是任何“優(yōu)選的”實(shí)施例，僅僅是實(shí)施的可能示例，僅僅是為了更清晰地理解本發(fā)明的原理?？梢詫Ρ景l(fā)明的上述實(shí)施例作出許多變化和修飾，而基本上不脫離本發(fā)明的精神和原理。所有這些修飾和變化旨在被包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且本發(fā)明被以下的權(quán)利要求所保護(hù)。
[0185]以下的實(shí)施例被闡述，以便對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員提供如何實(shí)施方法和使用此處公開和要求保護(hù)的組合物和化合物的完整公開和描述。已作出努力，以確保數(shù)字(例如，量，溫度等)的準(zhǔn)確性，但一些誤差和偏差應(yīng)予以考慮。除非另有說明，份數(shù)是重量份數(shù)，溫度為。C，壓力為大氣壓或接近大氣壓。標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力定義為20°C和I個大氣壓。
[0186]實(shí)例
[0187]例I
[0188]循環(huán)條件:采用HotStart-1T探針在MX4000儀(Stratagene, Inc)中進(jìn)行實(shí)時PCR0 RTM定量PCR預(yù)混液(USB, Inc.) (2x)在20tl的反應(yīng)中補(bǔ)充有I μ I的25mM的MgCl20為了啟動熱啟動條件下，將管在95°C下加熱5分鐘，隨后40個循環(huán)的兩步PCR(變性:95°C，15秒；退火/延伸:58°C，I分鐘)。所使用的模板分別為包含有或沒有T > G顛換的靶向EGFR基因片段的ULTRAMER.RTM寡核苷酸(DNA整合技術(shù)，1wa, USA)。
[0189]例2
[0190]檢測VK0RC1SNP變異體的內(nèi)部DDS(iDDS)探針:反義探針組合物:一個與華法林劑量相關(guān)的重要的SNP變異體位于編碼維生素K環(huán)氧化物還原酶亞單位I的VKORCl基因內(nèi)，在其位點(diǎn)1639，其包括相對于野生型的突變的G > A的改變。通過實(shí)時PCR檢測這兩個SNP變異體，所述探針，反義探針及以下引物用于在以下終濃度:
[0191]VK-1639G-探針:5' -FAM-cgcacccggccaatg-Phos-3' (SEQ ID N0.:1)在 200nM時；
[0192]VK-1639G-反義探針:5' -catcggccgggtgcg-BHQl-3' (SEQ ID N0.:2)在 400nM時
[0193]VK-1639A 探針:5' -FAM-attggccaggtgcg-Phos-3' (SEQ ID N0.:3)在 200nM 時
[0194]VK-1639A-反義探針:5' -cgcacctggcctat-BHQl-3' (SEQ ID N0.:4)在 400nM時
[0195]VK-正向引物:5' -cctctgggaagtcaagcaag-31 (SEQ ID N0.:5)在 200nM 時[0196]VK-反向引物:5' -aaatgctaggattataggcgtga-3' (SEQ ID N0.:6)在 200nM 時
[0197]而在探針和反義探針包含VKORCl的靶向單堿基變異體，每個反義探針用一個不匹配堿基(野生反義探針位置4，突變反義探針位置12)進(jìn)行修飾，以減少相對于探針與正確相匹配的靶的結(jié)合的探針對反義探針的結(jié)合。在探針:反義探針結(jié)構(gòu)中的預(yù)期失配是為了獲得探針與反義探針之間的親和力，探針和正確的靶相對于探針和不正確的靶之間的親和力的中間物。
[0198]圖6顯示了如何使野生探針的序列相互作用:⑴與預(yù)期的野生靶序列，⑵與所選擇的反義探針的序列，和(3)與一個不正確的靶序列(在這種情況下的突變序列)以產(chǎn)生三個不同層次的由Tm和AG測量的熱力學(xué)親和力。這些探針，反義探針和靶，然后進(jìn)行實(shí)時PCR循環(huán)和檢測，其中溫度反復(fù)地從變性的95°C下降到約58°C的退火溫度，然后再返回到95 °C (在約72 °C有或沒有延伸步驟)
[0199]熒光信號是在每個退火步驟中進(jìn)行評估。探針與正確的靶的結(jié)合首先發(fā)生在超過退火溫度約5°C時，然后，探針與反義探針的結(jié)合其次發(fā)生在大約退火溫度時。正確的靶結(jié)合開啟信號而反義探針關(guān)閉信號。在熱力學(xué)上，探針與不正確的靶的結(jié)合只能發(fā)生在最后，或者根本沒有，因?yàn)樗荒茉诒忍结樑c反義探針的結(jié)合的溫度低約5°C時有效地發(fā)生。此外，由于提供了二比一的 過量反義探針，探針與不正確的靶的結(jié)合被有效地阻止。典型地，引物結(jié)合也被優(yōu)化為用于PCR的退火溫度。因?yàn)榛趇DDS探針:反義探針的分析的這些結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)特性，探針很少有或根本沒有機(jī)會結(jié)合到不同于預(yù)定靶的單個堿基的不正確的靶。
[0200]循環(huán)條件:采用HotStart-1T探針在MX4000儀(Stratagene, Inc)中進(jìn)行實(shí)時PCR0 RTM定量PCR預(yù)混液(USB, Inc.) (2x)在20 μ I的反應(yīng)中補(bǔ)充有I μ I的25mM的MgCl2。為了啟動熱啟動條件下，將管在95°C下加熱5分鐘，隨后40個循環(huán)的兩步PCR(變性:95°C，15秒；退火/延伸:58°C，I分鐘)。所使用的模板分別為通過包含有或沒有突變堿基和側(cè)翼引物位點(diǎn)的祀向基因片段的IDT合成的Ultramers。
[0201]圖8A和圖SB顯示了來自包含有1，000個復(fù)制的野生型或突變模板和使用野生型或突變探針的四個管的擴(kuò)增曲線。陽性(向上)的曲線反映的是突變模板與突變探針(圖SB)的檢測，或野生型模板與野生型探針(圖8A)的檢測。平緩曲線反映的是野生型探針與突變模板或突變探針與野生型模板。用于兩個相關(guān)的診斷SNPs、CYP2C9*2和CYP2C9*3的類似的野生型和突變iDDS探針:反義探針組，也被制作并采用類似的結(jié)果執(zhí)行。
[0202]CY2-W-探針:FAM-CATTGAGGACCGTGTTCAAGA-Phos (SEQ ID N0.:64)在 200nM 時；
[0203]CY2-W-反義探針:TCTTGAACACGGTCCTCTATG-BHQ1 (SEQ ID N0.:65)在 400nM 時
[0204]CY2-M 探針:FAM-CTCTTGAACACAGACCTCAATGC-Phos (SEQ ID N0.:66)在 200nM 時
[0205]CY2M-反義探針:GCATTGAGGACTGTGTTCATGAG-BHQ1 (SEQ ID N0.:67)在 400nM 時
[0206]CY2F-引物:AATTTTGGGATGGGGAAGAG(SEQ ID N0.:68)在 200nM 時
[0207]CY2R-物:GTTTTTCTCAACTCCTCCACAAGG(SEQ ID N0.:69)在 200nM 時
[0208]CY3W-探針:FAM-GAGAAGGTCAATGAATCTCTGGAC-Phos (SEQ ID N0.:70)在 200nM 時
[0209]CY3W-反義探針:GTCCTGAGATACATTGACCTTCTC-BHQ1 (SEQ ID N0.:71)在 400nM 時
[0210]CY3M-探針:FAM-AGAAGGTCAAGGAATCTCTGGAC-Phos (SEQ ID N0.:72)在 200nM 時
[0211]CY3M-反義探針:GTCCTGAGATACCTTGACCTTCT-BHQ1 (SEQ ID N0.:73)在 400nM 時[0212]CY3F-引物:CCACATGCCCTACACAGATG(SEQ ID N0.:74)在 200nM 時
[0213]CY3R-引物:CCTTGGGAATGAGATAGTTTCTGAA(SEQ ID N0.:75)在 200nM 時
[0214]例3
[0215]用于與肺癌診斷和治療相關(guān)的EGFR基因(外顯子21L858R突變)的單堿基變異的實(shí)時PCR檢測的內(nèi)部DDS(iDDS)探針:為了檢測懷疑存在于核酸樣品中的EGFR外顯子21突變密碼子L858R，以及可能在858L野生型(正常)的密碼子序列存在時，以下的寡核苷酸探針、反義探針和PCR引物被合成，并在指定的終濃度使用:
[0216]EGFR858R探針:FAM-cagattttggccgggccaaactg-phos (SEQ ID N0.:7)在 200nM時
[0217]EGFR858R反義探針:cagtttggcccgcccaatatctg-BHQl (SEQ ID N0.:8)在 400nM 時
[0218]EGFR858L 探針:CalRed610-cagattttgggctgaccaaactg-phos (SEQ ID N0.9)在200nM 時
[0219]EGFR858L 反義探針:cagtttggccagcccataatctg_BHQ2 (SEQ ID N0.:10)在 400nM時[0220]正向引物:gaaaacaccgcagcatgtC(SEQID N0.:11)在 200nM 時
[0221]反向引物:ctgcatggtattctttctcttcc(SEQ ID N0.:12)在 200nM 時
[0222]雖然上述探針和反義探針在密碼子858的位置含有針對性的單堿基變異，每個反義探針還包括相對于在突變858R反義探針位置18(5'末端)和降低反義探針與其匹配的探針的結(jié)合親和力(示于圖7B)的野生858L反義探針位置18(5'末端)的對應(yīng)探針序列的一個額外的不匹配堿基。
[0223]對于這些特定的靶，(i)該探針的結(jié)合和正確的靶以及(ii)該探針和不正確的靶之間的熱力學(xué)差異是很低的。該探針，因此，被各自設(shè)計成包括位于與期望被檢測到(分別在變異858R探針位置11，和野生858L探針位置15)的變異堿基位點(diǎn)相差兩個堿基的額外的輔助不匹配。在探針與不正確的靶雜交的情況下，形成三堿基“雜交泡沫”(CCG)，以防止形成的雙鏈，并有利于雜交到正確的靶序列，或其相應(yīng)的寡核苷酸反義探針。
[0224]圖9顯示了來自含有1，000個復(fù)制的突變模板的兩管的擴(kuò)增曲線。陽性(向上)曲線反映的是858R變異探針的單堿基突變的檢測。反映的平面曲線使用野生型探針，它不檢測突變模板。
[0225]例4
[0226]實(shí)時PCR使用IDDS探針代表致病0157的檢測:使用根據(jù)檢測uidA+93和與TaqMan-MGB探針比較的致病的0157:H7大腸桿菌的檢測的iDDS探針的實(shí)時PCR:采用以下的序列和標(biāo)記制作該探針、反義探針和引物，并在所指示的終濃度下使用:
[0227]突變型0157uidA 探針:FAM_caccaacgctgctcaattc-phos (SEQ ID N0.: 13)在200nM 時
[0228]突變型反義探針:gaattgagctgcgttggtg-BHQl (SEQ ID N0.:14)在 400nM 時
[0229]uidA-For.引物:cagtctggatcgcgaaaactg(SEQ ID N0.: 15)在 200nM 時
[0230]uidA-ReV.引物:accagacgttgcccacataatt (SEQ ID N0.: 16)在 200nM 時
[0231]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如實(shí)施例1所述進(jìn)行，除了定量PCR進(jìn)行60個循環(huán)，退火/延伸步驟在60°C下進(jìn)行I分鐘。
[0232]圖1OA顯示了使用0157突變探針檢測兩種濃度的大腸桿菌突變模板(50份至5份)(陽性曲線)和50至5份大腸桿菌陰性模板(平緩曲線)的四管的原料擴(kuò)增曲線。采用60個循環(huán)的野生模板沒有假陽性的檢測發(fā)現(xiàn)。
[0233]相比較而言，圖1OB顯示了使用特異于0157突變的市售的Taqman-MGB探針檢測50個復(fù)制的突變模板(日性(向上)的曲線)與50份對照模板(主要是平緩曲線)的兩管的擴(kuò)增曲線。對照模板，不具有病原體相關(guān)的多態(tài)性，在38個周期產(chǎn)生了 Taqman-MGB探針的一些假陽性結(jié)果(曲線斜向上)。
[0234]例5
[0235]使用實(shí)時熒光定量PCR的iDDS探針檢測相對于革蘭氏陽性(GP)細(xì)菌的革蘭陰性(GN):采用以下的序列制作和標(biāo)識探針、反義探針、引物，并在指定的終濃度時被使用:
[0236]GP 探針:FAM-aaggggcttgatgatttgacgt-phos (SEQ ID N0.: 17)在 200nM 時
[0237]GP 反義探針:acgtcaaatcttcatgcccctt-BHQl (SEQ ID N0.: 18)在 400nM 時
[0238]GN 探針:CalRed610_aagggccatgatgacttga-phos (SEQ ID N0.: 19)在 200nM 時
[0239]GN 反義探針:tcaagtcttcatggccctt_BHQ2 (SEQ ID N0.:20)在 400nM 時
[0240]正向引物 :tcccgcaacgagcgcaac(SEQ ID N0.:21)在 200nM 時
[0241]反向引物:cagccattgtagcacgtgtgt(SEQ ID N0.:22)在 200nM 時
[0242]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如實(shí)施例1所述在58°C下的退火/延伸步驟進(jìn)行I分鐘。兩個探針在同樣的管中一起使用，每個管中含有不同的模板..[0243]圖1lA顯示了革蘭氏陽性和革蘭氏陰性探針的一個管中的兩條曲線。陽性(向上)曲線表示檢測約1.3xl04個細(xì)胞的革蘭氏陽性模板的革蘭氏陽性探針，和平緩曲線反映了革蘭氏陰性探針采用相同的模板，無假陽性檢測顯示。
[0244]或者，圖1lB顯示了一個管中的兩條曲線，其中所述陽性曲線反映了檢測約2.6x10s個細(xì)胞的革蘭氏陰性模板的革蘭氏陰性特異性探針。平緩曲線反映了革蘭氏陽性探針采用那些相同的模板，無假陽性檢測顯示。
[0245]在另外的實(shí)驗(yàn)中，革蘭陰性探針(SEQ ID NO:19)在其5'端采用FAM熒光標(biāo)記和在其:V端采用BHQl猝滅劑標(biāo)記被修飾，和革蘭陰性反義探針(SEQ ID N0:20)在:V端標(biāo)記有BHQ1，并任選地在Y端標(biāo)記有FAM。這兩個修飾改進(jìn)了 qPCR檢測，產(chǎn)生更高水平的指數(shù)熒光信號和較低的背景水平。
[0246]例6
[0247]使用實(shí)時熒光定量PCR的ZIPR DDS探針檢測H3N2流感:該ZIPRH3N2探針針對H3N2流感基因組的血凝素(HA)段的位點(diǎn)，并且是FAM標(biāo)記的。所述探針包含靶特異性的引物序列。該反義探針是BHQl-標(biāo)記的，并且與探針是基本互補(bǔ)的。引物被用于與所述探針及反義探針結(jié)合，以擴(kuò)增并檢測H3N2樣品，它們在以下的終濃度下時被使用:
[0248]ZIPR H3 探針:FAM-ctggttcagagttcctcaaca(SEQ ID N0.:23)在 200nM 時
[0249]ZIPR H3 反義探針:tgttgatgaactctgaaccag-BHQl (SEQ ID N0.:24)在 400nM 時
[0250]H3$*:ccatcaaggatctgatgagga(SEQ ID N0.:25)在 200nM 時
[0251]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如例I所描述進(jìn)行。
[0252]圖12顯示了使用上述ZIPR H3探針的來自H3N2病毒感染的患者樣品的擴(kuò)增曲線。
[0253]例7
[0254]使用實(shí)時熒光定量PCR的FLIP DDS探針檢測相對于副結(jié)核分枝桿菌的16S基因的結(jié)核分枝桿菌的16S基因:以下用于特異性檢測結(jié)核分枝桿菌類的FLIP DDS探針針對與副結(jié)核分枝桿菌的16S基因相差一個堿基的16S基因的位點(diǎn)。所述探針是3' FAM標(biāo)記的，并且包含內(nèi)部靶序列。該反義探針組分是5' BHQl標(biāo)記的，并且與3'引物序列結(jié)合，在這個實(shí)例中與正向引物結(jié)合。
[0255]只有一個側(cè)翼引物被用于與FLIP探針組分一起使用。在靶擴(kuò)增期間，探針結(jié)合到靶序列，剩下反義探針，因?yàn)樗贿B接到被并入到擴(kuò)增產(chǎn)子的一個引物。因此，探針可向其靶位點(diǎn)翻轉(zhuǎn)，引發(fā)熒光檢測。該檢測使用不被反義探針阻斷的第二引物。使用正向和反向引物以及相同的測試樣品對同一靶位點(diǎn)的Taqman探針進(jìn)行比較。該引物和探針組分和終濃度如下:
[0256]FLIP 探針:taggaccacgggatgcatgtctt-FAM(SEQ ID N0.:26)在 125nM 時
[0257]FLIP 反義探針-引物:dT-BHQl_aagacatgcatcccgtggt-間隔子9-gggataagcctgggaaactg(SEQ ID N0.:27)在 200nM 時
[0258]Taqman 探針:FAM-catgtcttgtggtggaaagc-BHQl (SEQ ID N0.:28)在 IOOnM 時
[0259]正向引物:gggataagcctgggaaactg(SEQ ID N0.:29)在 200nM 時
[0260]反向引物:accccaccaacaagctgata(SEQID N0.:30 在 200nM 時 [0261]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如例I所描述進(jìn)行。
[0262]圖13A顯示了使用特異于結(jié)核分枝桿菌16S基因的FLIP DDS探針的五個管的擴(kuò)增曲線。四個陽性(向上)曲線反映了結(jié)核分枝桿菌連續(xù)稀釋10:1的四個樣品的檢測。陰性曲線反映了與探針區(qū)域相差一個堿基的副結(jié)核分枝桿菌是的樣品。
[0263]圖13B顯示了來自使用特異于結(jié)核分枝桿菌16S的Taqman探針在與圖13A所示的FLIP探針相同的靶區(qū)域的五個管的曲線。四個高陽性曲線來自如上所示的結(jié)核分枝桿菌相同的四個連續(xù)稀釋。重疊其它曲線的低陽性曲線來自圖13A所示的同一副結(jié)核分枝桿菌對照樣品。這說明用Taqman探針出現(xiàn)假陽性的檢測。FLIP探針更為嚴(yán)格，避免了這種假陽性的檢測。
[0264]例8
[0265]使用G-Force DDS探針的實(shí)時PCR對結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的檢測:用于結(jié)核分枝桿菌的G-Force DDS探針被設(shè)計成檢測包括密碼子526至533的rpoB基因的一個區(qū)域。通用探針:反義探針的信號單元被連接到一個引物，并連同其它側(cè)翼引物運(yùn)作，以擴(kuò)增并檢測靶位點(diǎn)。G-Force信號單元由包含一個FAM標(biāo)記的富胞嘧啶核苷探針片段，A’ s兩側(cè)的間隔子，以及一個富含鳥嘌呤反義探針片段(如SEQ ID NO:31)。
[0266]在靶序列不存在時，探針和反義探針片段在間隔子的中間折疊在一起，這是由于互補(bǔ)序列的結(jié)合。由于這使得熒光團(tuán)緊接著一系列鳥嘌呤，熒光顯著減少。但是當(dāng)引物/探針單元被結(jié)合到產(chǎn)品中時，反義探針片段被復(fù)制，從而防止探針片段從折疊接近反義探針段，因此信號被釋放。
[0267]G-Force探針和引物序列以及終濃度為:
[0268]GF 引物/探針:FAM-cccctcca_ 間隔子 18-aggaggggg-ccgctgtcggggttgac (SEQ IDN0.:31)在 IOOnM 時；反向引物:cacgctcatgtgacagacc(SEQ ID N0.:32)在 200nM 時
[0269]G-Force探針與兩個模板一起使用。一個在密碼子526 (tac)包含單個堿基突變；其它野生序列。G-Force探針沒有區(qū)分這兩個模板。[0270]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如例I所描述進(jìn)行。
[0271]圖15顯示了來自兩個野生和突變型模板的陽性曲線的探針的兩個管的結(jié)果。
[0272]例9
[0273]用于檢測結(jié)核分枝桿菌rpoB基因的單堿基突變的與iDDS探針結(jié)合的G-ForceDDS探針:上述例8的該G-Force DDS探針被用于結(jié)合靶向針對rpoB的526密碼子的野生序列的iDDS探針。iDDS探針的組分和濃度如下。該分析是為了檢測一個突變是否存在于密碼子526，利福平抗性突變的基本位點(diǎn)，而無需采用不同的iDDS探針檢測每一個特定的突變。因此，IDDS探針產(chǎn)生了一條526突變是否存在的平緩曲線，而G-Force探針仍產(chǎn)生了一條陽性曲線。這樣的陽性/陰性結(jié)果證實(shí)了 526密碼子本身的存在，然后表明，它含有一個突變堿基，無論哪個堿基突變是否存在。而這個陽性/陰性結(jié)果證實(shí)，只有一個抗性突變的存在，所述分析可以是不明確的，如果樣品中含有大量的野生和突變型模板，并檢測到兩個陽性曲線。
[0274]iDDS 探針:CalFluorRed610_cggggttgacccactagcg-phos (SEQ ID N0.:33)在200nM 時 [0275]反義探針:cgcttgtgggtctaccccg_BHQ2(SEQ ID N0.:34)在 400nM 時
[0276]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如例I所描述進(jìn)行。
[0277]圖16A顯示了采用上述兩個探針和526位點(diǎn)的突變模板的一個管。G-Force探針顯示了檢測526-533區(qū)域的陽性曲線，但更多的靶向針對526位點(diǎn)的野生iDDS探針并沒有顯示出陽性曲線，因?yàn)?26位點(diǎn)是突變的。從而此分析提供了 rpoB526突變狀況而沒有檢測特定突變的指標(biāo)。
[0278]G-Force探針可與iDDS探針結(jié)合，以量化樣品中的特定突變的頻率。G-Force探針檢測靶區(qū)域的所有的擴(kuò)增子，而iDDS探針只檢測那些含有突變序列的擴(kuò)增子。因此信號對野生或突變型的模板的G-Force探針是高度一致的，而iDDS探針的信號高度與相對于野生模板的突變模板的頻率是成比例的，并提供了相對于細(xì)胞群中突變細(xì)胞的野生細(xì)胞的相對比例的表示。同樣結(jié)果會是相反的，如果IDDS探針檢測到野生型而不是突變序列。
[0279]這種能力是采用下列探針和引物在一個共同的藥物抗性突變的位點(diǎn)將結(jié)核分枝桿菌的inhA基因與野生inhA序列的iDDS探針結(jié)合的G-Force探針顯示的:
[0280]正向引物:gctcgtggacataccgattt(SEQ ID N0.:35)在 200nM 時；inhA iDDS 探針:CalRed610-ccgacaacctatcgtctcgcc_Phos (SEQ ID N0.:36)在 200nM 時；inhA 反義探針:cgagacgataggttgtcgg_BHQ2 (SEQ ID N0.:37)在 400nM 時；InhA G-Force 引物探針:cccctcca-間隔子 18-aggagggggtccggtaaccaggactgaac (SEQ ID N0.:38)在 IOOnM 時
[0281]圖16B顯示了以75%野生:25%突變或25%野生:75%突變混合的野生型和突變的模板運(yùn)行的兩個試管的測試。而G-Force探針的曲線均的任一模板相同，該iDDS探針的曲線與存在的百分比野生模板成比例的高度不同。
[0282]例10
[0283]采用“野生終止子”的方法增強(qiáng)了基于iDDS探針的突變檢測:采用iDDS探針的突變檢測可以通過有選擇地擴(kuò)增靶突變型模板和阻斷野生模板擴(kuò)增的預(yù)擴(kuò)增步驟得到加強(qiáng)。在預(yù)擴(kuò)增步驟后，反應(yīng)產(chǎn)物被稀釋，小稀樣品被轉(zhuǎn)移到實(shí)時PCR反應(yīng)中。由于此過程，野生型模板幾乎消除，定量PCR反應(yīng)從突變型模板的擴(kuò)增量開始。其結(jié)果是，與低頻率的突變型模板的樣品可以通過定量PCR與iDDS探針被有效地檢測，即使原始樣品含有豐富的另外隱蔽突變檢測的野生模板。
[0284]預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)使用靶區(qū)域兩側(cè)的一組引物，且最終反應(yīng)使用部分或完全在外部引物之間的引物組。第一，預(yù)擴(kuò)增步驟，在一個標(biāo)準(zhǔn)PCR儀上運(yùn)行30~70短周期。第一反應(yīng)中的I微升通常被用100~500微升的水或緩沖液稀釋，然后I微升樣品被轉(zhuǎn)移到在實(shí)時PCR儀的第二反應(yīng)中。
[0285]在第一步驟中使用的野生終結(jié)者阻斷探針，包括未標(biāo)記的寡核苷酸是互補(bǔ)的野生序列和大約22至28個堿基長-約2~5個堿基比IDDS較長探針。的5'末端被修飾，以阻止5'-核酸酶消化一阻擋部分如一個生物素分子，ZNA，一個MGB，或者非互補(bǔ)堿基(約5-10)的任意字符串的連接。的:V -末端被修飾的分子使用，例如磷酸鹽，氨基，或一墊片，以防止延伸探針的。阻塞的Tm是探針通常為至少5°C的比IDDS更高探針，使任何野生模板將綁定到它強(qiáng)烈。
[0286]阻斷“野生終止子”探針，從而表現(xiàn)得像一個反義探針在反向，阻斷野生模板，同時允許突變序列的iDDS探針結(jié)合至突變的模板，并檢測。這個例子說明了使用在例2中描述的相同IDDS探針的EGFR外顯子21突變位點(diǎn)L858R(T > G)的增強(qiáng)檢測，但提供了相對于野生序列變異的突變序列的低頻率的混合模板(0.2% )。
[0287]用于以下模板和組分的第一預(yù)擴(kuò)增步驟:模板:10,000拷貝野生型EGFR外顯子21858L ；20 拷貝突 變 EGFR 外顯子 21858R(0.2% ).[0288]外部的正向引物:agccaggaacgtactggtga(SEQID N0.:39)在 IOOnM 時
[0289]外部的反向引物:tgcctccttctgcatggtat(SEQ ID N0.:40)在 IOOnM 時；
[0290]終止子阻斷探針:生物素-ctttcccaccaacgcagatcaattcca-phos(SEQ ID N0.:41)在200nM時
[0291]這第一步包括使用USB PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑(2x)的20 μ I反應(yīng)。反應(yīng)通過在95°C下加熱3分鐘開始，接著40個循環(huán)的PCR，在95°C持續(xù)2秒，50°C持續(xù)2秒，和72°C持續(xù)2秒。這一步抑制或阻止野生模板的擴(kuò)增，而突變的模板被擴(kuò)增。從第一步稀釋1/500，1μ1
被轉(zhuǎn)移到第二步。
[0292]第二定量PCR步驟使用以下的組分和條件:
[0293]內(nèi)部的正向引物:gaaaacaccgcagcatgtc (SEQ ID N0.:11)在 200nM 時
[0294]內(nèi)部的反向引物:ctgcatggtattctttctcttcc (SEQ ID N0.: 12)在 200nM 時；
[0295]突變探針858R:FAM_cagattttggcc gggccaaactg-Phos (SEQ ID N0.:7)在 200nM時；
[0296]突變反義探針:cagtttggcccgcccaatatctg_BHQl(SEQ ID N0.:8)在 400nM 時；
[0297]野生型探針858L:CalRed610_cagattttgggctgaccaaactg-Phos (SEQ ID N0.:9)在200nM時；
[0298]野生型反義探針:gcagtttggccagcccataatctg_BHQ2(SEQ ID N0.;10)在 400nM 時
[0299]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如例I所描述進(jìn)行，除了退火/延伸步驟是在52°C持續(xù)I分鐘。
[0300]圖14顯示了包含第一擴(kuò)增步驟的相同反應(yīng)產(chǎn)物(但用不同的探針，野生型和突變型，在每個管)的兩個管的定量PCR曲線。陽性(向上)曲線顯示了很早就從9個循環(huán)開始的指數(shù)擴(kuò)增的突變檢測。陰性曲線顯示了沒有檢測到原本很豐富的野生模板。
[0301]例11
[0302]檢測EGFR外顯子21突變的一步iDDS和“野生型終止子”的方法:“野生型終止子”探針和iDDS探針在一個單一的實(shí)時PCR反應(yīng)中一起使用，“野生型終止子”探針抑制或阻斷檢測突變模板的野生型模板和IDDS探針的擴(kuò)增。該過程只起作用，如果該突變頻率為約1%或更高。在這個例子中，突變模板的200個復(fù)制和野生模板的10，000個復(fù)制(2%的突變)一起使用。所有引物和探針均與上述實(shí)施例10相同，除了在400nM時使用的內(nèi)部引物?！耙吧徒K止子”探針在150nM時被使用，但在100或200nM采用“野生型終止子”探針得到類似的結(jié)果。
[0303]循環(huán)條件:實(shí)時PCR如例I所述采用在52°C持續(xù)I分鐘的退火/延伸步驟進(jìn)行。
[0304]圖17顯示了 EGFR中L858R位點(diǎn)的含有“野生終止子”探針和野生型和突變iDDS探針的一管的兩條曲線。
[0305]例12
[0306]采用ZIPR DDS探針的ISAM等溫擴(kuò)增和定量PCR檢測:DNA或RNA靶序列可被等溫擴(kuò)增，并被一端的DDS引物-探 針以及另一端為5' RNA聚合酶啟動子序列的引物檢測。在此例子中，T7RNA聚合酶啟動子序列被使用。此方法使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以產(chǎn)生添加到5'端的T7位點(diǎn)的所述靶區(qū)域的cDNA復(fù)制。然后ZIPR DDS引物-探針作為引物，以復(fù)制包括T7位點(diǎn)的該cDNA，從而產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物與T7啟動子的識別序列。RNA聚合酶，在這種情況下，T7RNA聚合酶，然后使得產(chǎn)物中的RNA復(fù)制作為進(jìn)一步擴(kuò)增循環(huán)的模板，產(chǎn)生DNA和RNA產(chǎn)物之間的交替。RNaseH通過降解RNA =DNA雜交中的RNA鏈促進(jìn)了這一過程。RNaseH可被單獨(dú)提供，或作為一個具有RNase功能的逆轉(zhuǎn)錄酶，以產(chǎn)生RNA產(chǎn)物的cDNA復(fù)制。
[0307]NUCLISENS.RTM基本試劑盒(BioMerieux，Inc)被使用。在擴(kuò)增過程中，所述熒光標(biāo)記ZIPR引物-探針被并入到DNA產(chǎn)物，并從任何可用的淬滅劑標(biāo)記的反義探針分離，從而提供了定量PCR檢測。由于低溫擴(kuò)增，該反義探針被做得更短。所述探針和引物組分被使用，如下所示:
[0308]GAPDH-Cy3FI:Cy3-gagtcaacggatttggtcgt (SEQ ID N0.:42)在 200nM 時；GAPDH-BHQ2:atccgttgactc-BHQ2 (SEQ ID N0.:43)在 400nM 時；GAPDH_T7R1:
[0309]aattctaatacgactcactatagggagaagggacaagcttcccgttctcag(SEQ ID N0.:44)200nM 時.[0310]這個測試以Ing的GAPDH RNA為起始模板進(jìn)行。初始反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在65°C下進(jìn)行5分鐘，然后41°C下持續(xù)5分鐘。然后，采用如定量PCR儀或37°C和45°C之間的水浴進(jìn)行指數(shù)ISAM，最典型地在40°C到42°C之間。在一個例子中，定量PCR步驟在兩個稍微不同的溫度下進(jìn)行，在42°C 30秒，和40°C 30秒之間來回地循環(huán)，運(yùn)行80個循環(huán)。熒光發(fā)射分別在每個循環(huán)的第二個步驟(40°C步驟)進(jìn)行評估。
[0311]在圖18中，陽性擴(kuò)增曲線顯示了采用ZIPR DDS的引物-探針的ISAM定量PCR DNA產(chǎn)物的檢測。未檢測到RNA產(chǎn)物。大多數(shù)的指數(shù)擴(kuò)增階段是前20分鐘內(nèi)完成。
[0312]例13
[0313]采用內(nèi)部DDS (IDDS)探針的ISAM等溫擴(kuò)增:ISAM擴(kuò)增和定量PCR檢測，可以如上述實(shí)施例12所進(jìn)行，但使用內(nèi)部DDS探針代替終止子引物-探針。此外，正向和反向引物可以具有一個附加的T7序列，修飾增加約20%到50%的產(chǎn)量。然而，由于所使用的低溫，DDS探針和反義探針通過使用長探針(24bp)改性和較短的反義探針(15bp)被修飾。
[0314]GAPDH-T7F1:aattctaatacgactcactatagggagaagggagtcaacggatttggtcgt(SEQ IDN0.:45)在 300nM 時；GAPDH_R1:
[0315]aattctaatacgactcactatagggagaagggacaagcttcccgttctcag(SEQ ID N0.:46)300nM 時；GDH iDDS 探針:FAM_ccttcattgacctcaactacatgg_ 氨基(SEQ ID N0.:47)在150nM 時；(?Η iDDS 反義探針:tgaggtcaatgaagg_BHQl (SEQ ID N0.:48)在 300nM 時
[0316]測試模板是GAPDH RNA和HIV RNA。RT-PCR和定量PCR的步驟如例13所述進(jìn)行，進(jìn)行與不同之處在于定量PCR循環(huán)為60個I分鐘周期在一個溫度，41°C，用熒光檢測評估每個周期實(shí)施例13中所述。在圖19，積極的擴(kuò)增曲線顯示的ISAM定量PCR檢測GAPDH DNA的產(chǎn)品，其內(nèi)部的DDS探頭和反義探針的。平曲線是從艾滋病防治的模板。與內(nèi)部的DDS探頭，檢測更嚴(yán)格，因此擴(kuò)增曲線上升逐漸多了。
[0317]例14
[0318]芯片上的ISAM等溫擴(kuò)增和熒光檢測:芯片陣列在CODELINK.RTM幻燈片(GEHealthcare)上被采用含有GAPDH基因或Rab9基因的引物的多斑點(diǎn)進(jìn)行手工印刷。這些引物包括從5'端:氨基修飾、間隔子、T7啟動序列和基因特異性反向引物序列。根據(jù)CODELINK.RTM協(xié)議，弓丨物通過其5/氨基修飾被共價地結(jié)合到印刷的幻燈片上。然后，他們被處理以阻斷非特異性結(jié)合，洗滌和干燥。這些斑點(diǎn)被以GAPDH和Rab9引物斑點(diǎn)之間的半棋盤格局交替排列。ISAM反應(yīng)在芯片上完成，各加入150ng的GAPDH RNA和Rab9RNA，加上包含有正向引物序列的Cy3標(biāo)記的GAPDH探針和包含有T7序列與正向引物序列的FAM標(biāo)記的Rab9探針。
[0319]該反應(yīng)在蓋玻片上運(yùn)行，但在密封室中，并在41°C的水浴中保持至少2小時。芯片，然后采用:2xSSC/0.1% SDS,.lxSSC/0.1% SDS，1XSSC，之后 0.01xSSC 清洗芯片，然后旋轉(zhuǎn)干燥。采用Perkin Elmer公司的微陣列掃描儀進(jìn)行檢測。⑶H和Rab9特異性引物和探針為:
[0320]GDH-Rls:氛基-間隔子 18-atttctaatacgactcactatagggagaagggacaagcttcccgttctcag(SEQ ID N0.49) ;Rab9_Rls:氨基-間隔子 18-atttctaatacgactcactatagggagaaggaaatggtgtcctcaggcttc(SEQ ID N0.50) ；GDHCy3Fl:Cy3-gagtcaacggatttggtcgt(SEQ IDN0.51)在 900nM 時；Rab9_FAM_T7Fl:FAM_aattctaatacgactcactatagggagaaggcaatggcaggaaaatc (SEQ ID N0.52)在 900nM 時
[0321]在圖20中，芯片的ISAM基因特異性擴(kuò)增的陣列上的綠色和藍(lán)色的斑點(diǎn)圖案被觀察到，并可以采用連接到芯片上的引物進(jìn)行檢測。由于黑色背景和藍(lán)色FAM標(biāo)記的Rab9特定點(diǎn)之間的低著色的差異，這些基因特異性熒光點(diǎn)被表示為黑/白圖形中所示的白色圓圈。綠色Cy3標(biāo)記的GAPDH特異性點(diǎn)可以在黑色/白色圖如實(shí)心白點(diǎn)或具有灰色中心的白點(diǎn)被更容易地看出。擴(kuò)增和檢測是每個基因獨(dú)有的。
[0322]例15
[0323] 采用同樣的擴(kuò)增子上的兩個探針:反義探針組合物檢測EGFR外顯子19的可變的缺失突變:在肺癌和相關(guān)疾病中，可變的缺失突變通常發(fā)生在包括含有密碼子746至753的區(qū)域內(nèi)的9至24個堿基缺失的EGFR基因的外顯子19上，這種缺失是響應(yīng)絡(luò)氨酸激酶抑制劑的最普通的生物標(biāo)記。外顯子19(被認(rèn)為是缺失-19)上的這些診斷缺失通常通過測序法檢測。Dahse等.2008已進(jìn)行了 PCR和采用特別的引物橋接和擴(kuò)增最普通的15bp缺失-19突變的凝膠試驗(yàn)，然而，這種試驗(yàn)不能用其它的外顯子19缺失突變進(jìn)行。此處報道的例子克服了采用定量PCR試驗(yàn)中的一對探針:反義探針組合物檢測EGFR外顯子19擴(kuò)增子的兩方面的限制。含有一個標(biāo)記的引物-探針被用來擴(kuò)增和檢測有或沒有缺失-19突變的靶片段的所有擴(kuò)增子的終端，含有不同標(biāo)記的第二 iDDS探針將檢測包含有密碼子746至753的內(nèi)部片段，如果野生型序列是存在的。通過消除，這兩種探針系統(tǒng)區(qū)別缺失-19突變和野生型的相對比例。所使用的引物-探針是還作為正向引物的ZIPR探針:反義探針。
[0324]CalRed610-TCTGGATCCCAGAAGGTGAG (SEQ ID NO:56)在 200nM 時；CTCACCTTCTGGGTTCCAGA-BHQ2(SEQ ID NO:57)在 400nM 時
[0325]內(nèi)部iDDS 探針:反義探針包含:Fam-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-Phos (SEQ IDNO:81)在 200nM 時；GATGTTGCCTCTCTTAATTCCTTG-BHQI (SEQ ID NO:82)在 400nM 時
[0326]側(cè)翼反向引物包含:cgtaggcttcatcgaggatt(SEQ ID NO:53)在 200nM 時
[0327]有時少量(~IOOnM)的未標(biāo)記的正向引物(tctggatcccagaaggtgag,SEQ ID NO:78)也被提供，以降低強(qiáng)的ZIPR信號，并使得其與iDDS信號達(dá)到平衡，便于缺失-19突變頻率的診斷翻譯。
[0328]如例I所 述采用有或沒有9bp或15bp缺失的人工基因祀或有或沒有已知的缺失-19突變的病人樣品進(jìn)行實(shí)時PCR。如果所有的模板是野生型的，iDDS信號應(yīng)該相當(dāng)?shù)氐葍r于ZIPR探針信號，但是如果缺失-19突變是存在的，相比于ZIPR探針信號的iDDS信號應(yīng)該相對于突變頻率明顯地下降。這種預(yù)期的結(jié)果在所測試的模板和樣品中被觀察到。
[0329]圖21顯示了采用含有100%野生模板的上述兩個探針的一個管的曲線。該ZIPR探針顯示了檢測靶擴(kuò)增子的陽性曲線，iDDS探針顯示了等效的陽性曲線，因?yàn)樗心０宥际且吧?。圖。圖22顯示了相對于ZIPR探針曲線的減弱的IDDS曲線，因?yàn)槟０迨?0%的突變。圖23顯示了陽性ZIPR探針曲線和平緩的iDDS曲線，因?yàn)橐吧蛄性谌笔19靶位點(diǎn)上是不存在的。此法從而提供了缺失-19突變頻率的指標(biāo)，而沒有檢測特定的突變序列。該ZIPR信號與野生或突變的模板是高度一致的，而IDDS探針的信號高度隨著野生型及突變型模板的頻率成比例地變化，而不管該突變存在的大小或序列。
[0330]例16
[0331]檢測與癌癥治療的酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性相關(guān)的密碼子790上的EGFR外顯子20的單堿基突變的iDDS探針:反義探針:
[0332]由于EGFR外顯子20中的突變T790M，一年后患有非小細(xì)胞肺癌的病人通常對酪氨酸激酶抑制劑有復(fù)發(fā)反應(yīng)。這種突變是由于C到T的堿基對在密碼子790上第二個字母的變化，導(dǎo)致蘇氨酸到蛋氨酸的錯義替換(ACG > ATG)。檢測這種單堿基突變，從而提供了用于治療變化的診斷指標(biāo)。在這個例子中，定量PCR分析采用iDDS探針:反義探針檢測EGFR擴(kuò)增模板中790M突變序列的存在。引物和探針包含:
[0333]F-引物:gcatctgcctcacctccac (SEQ ID NO:83)在 200nM 時；R-引物:gtctttgtgttcccggacat(SEQ ID NO:84)在 200nM 時
[0334]探針:FAM-tgagctccatgatgagttgcacg-Phos(SEQ ID NO:85)在 200nM 時
[0335]反義探針:cgtgcaactcttcatgcagctca-BHQl(SEQ ID NO:86)在 400nM 時[0336]循環(huán)條件:實(shí)時PCR方法如例I所述進(jìn)行。陽性曲線表明790M序列是存在的。
[0337]例17
[0338]檢測基于兩種ZIPR探針:反義探針組合物的A型流感或B型流感的多重測定:
[0339]這種測定采用具有不同的熒光標(biāo)記的兩種ZIPR探針來檢測樣品中的A型流感或B型流感，其中包括:
[0340]F-引物:cttctaaccgaggtcgaaacgta(SEQ ID NO:87)在 200nM 時
[0341]A-探針:Fam-gctttgagggggcctga (SEQ ID NO:88)在 200nM 時
[0342]A-反義探針:Tcagcccccctcaaagc-BHQ-l (SEQ ID NO:89)在 400nM 時
[0343]R-引物:CTAATTGTCTCCCTCTTCTGGTGA(SEQ ID NO:90)在 200nM 時
[0344]B-探針:CalRed610-CCCAATTTGGTCAAGAGCAC(SEQ ID NO:91)在 200nM 時
[0345]B-反義探針:GTGCTgaTGACCAAATTGGG-BHQ-2 (SEQ ID NO:92)在 400nM 時 [0346]循環(huán)條件:實(shí)時PCR方法如例I所述進(jìn)行。FAM-陽性曲線表明A型流感是存在的。CalRed610陽性曲線表明B型流感是存在的。
[0347]例18
[0348]檢測與肺癌和結(jié)腸癌患者中EGFR靶向治療的反應(yīng)降低相關(guān)的KRAS基因的外顯子1、密碼子12和13中的可變突變的多重試驗(yàn)。該試驗(yàn)是類似于缺失-19檢測方案，并采用了 HEX熒光標(biāo)記的非特異性ZIPR探針系統(tǒng)和FAM標(biāo)記的野生型探針I(yè)DDS系統(tǒng)。iDDS探針包括:
[0349]FAM-CCTACGCCACCAGCTC-Phos(SEQ ID N0.93)在 200nM 時
[0350]GAGGTGGTGGCGTAGG-BHQI(SEQ ID N0.94)在 400nM 時
[0351]ZIPR探針包含:
[0352]HEX-TGGATCATATTCGTCCACAAAA (SEQ ID N0.95)在 200nM 時
[0353]TTTTGAGGACGAATATGATCCA-BHQI(SEQ ID N0.96)在 400nM 時
[0354]側(cè)翼引物為:CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAA(SEQID N0.97)在 200nM 時。
【權(quán)利要求】
1.一種選擇性地檢測靶核苷酸序列的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括至少一種探針:反義探針系統(tǒng)，其包括: (a)包括與第一靶核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的探針寡核苷酸，以及與其連接的第一標(biāo)記部分；和 (b)包括除了在非末端位置至少一個不匹配的堿基外與所述探針寡核苷酸完全互補(bǔ)的核苷酸序列的反義探針寡核苷酸，和第二標(biāo)記部分，其中，所述第二標(biāo)記部分連接到所述反義探針寡核苷酸或者是所述反義探針寡核苷酸的區(qū)域，其中: (i)該探針寡核苷酸被配置為對第一靶核苷酸序列的雜交親和力高于對所述反義探針寡核苷酸的雜交親和力；所述反義探針寡核苷酸被配置為對所述探針寡核苷酸的雜交親和力高于對感興趣的第二靶核苷酸序列的雜交親和力； (?)在第一靶核苷酸序列存在時，所述探針寡核苷酸和所述第一靶核苷酸序列形成雙鏈，由此所述第一和第二標(biāo)記部分不發(fā)生相互作用，從而提供了第一可檢測信號； (iii)在所述第一靶核苷酸序列不存在時，該探針寡核苷酸和反義探針寡核苷酸形成雙鏈，從而允許所述第一和第二標(biāo)記部分發(fā)生相互作用以提供經(jīng)調(diào)制的可檢測信號，其中所述第一可檢測信號和所述經(jīng)調(diào)制的可檢測信號是可區(qū)分的；及 (iv)在與所述第一靶 序列相差至少一個堿基不匹配的第二靶核苷酸序列存在時，探針寡核苷酸和反義探針寡核苷酸優(yōu)先形成雙鏈，由此抑制所述探針寡核苷酸與第二靶核苷酸序列形成雙鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述探針寡核苷酸和第一靶核苷酸序列的雙鏈，以及所述探針寡核苷酸和反義探針寡核苷酸的雙鏈，相差至少約2千卡/摩爾的AG和至少約4°C的Tm ;并且其中所述探針寡核苷酸和第二靶核苷酸序列的雙鏈，以及所述探針寡核苷酸和第一靶核苷酸序列的雙鏈，相差至少約4千卡/摩爾的Λ G和至少約8°C的Tm。
3.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述探針寡核苷酸序列配置有不匹配的堿基位置，該位置離所述第二靶核苷酸序列與所述探針序列之間預(yù)期的不匹配約兩個堿基；由此，所述兩個不匹配堿基產(chǎn)生探針寡核苷酸:第二靶核苷酸序列雙鏈的內(nèi)部兩個或三個堿基的未雜交區(qū)域，所述雙鏈從而具有的AG和Tm小于探針寡核苷酸:反義探針寡核苷酸雙鏈的AG 和 Tm。
4.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述探針寡核苷酸連接到固體基底。
5.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中一個標(biāo)記部分是突光發(fā)射器，并且另一個標(biāo)記部分包含熒光調(diào)制器；其中所述熒光調(diào)制器選自由以下組成的組:淬滅劑化合物、熒光化合物、金屬顆粒以及富含鳥嘌呤的綴合物。
6.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述探針寡核苷酸包含熒光發(fā)射器并且包含熒光調(diào)制器或第二熒光發(fā)射器，并且其中所述反義探針寡核苷酸包含熒光調(diào)制器并且任選地包含熒光發(fā)射器或第二熒光調(diào)制器。
7.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述探針寡核苷酸和所述反義探針寡核苷酸中的至少一個包含以下各項(xiàng)中的至少一個:非天然核苷酸、小溝結(jié)合物(MGB)，以及Zip核酸(ZNA)。
8.如權(quán)利要求1所述的內(nèi)部探針:反義探針系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是iDDS探針，其中所述探針寡核苷酸和任選地反義探針寡核苷酸的3'端被阻斷，以防止聚合酶延伸；并且其中所述系統(tǒng)還包括為擴(kuò)增包含第一靶核苷酸序列的核酸區(qū)域而配置的一對側(cè)翼引物。
9.如 權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是Flip探針，其中所述反義探針寡核苷酸進(jìn)一步在其3,端包括第一引物寡核苷酸和所述系統(tǒng)還包括第二引物寡核苷酸，其中所述第一和第二引物寡核苷酸被配置用于擴(kuò)增包括所述第一靶核苷酸序列的核酸區(qū)域。
10.如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中所述反義探針寡核苷酸和第一引物寡核苷酸通過無堿基間隔子區(qū)相連。
11.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是包含引物-探針擴(kuò)增子檢測系統(tǒng)的ZIPR探針，其中所述探針寡核苷酸包括引物序列并且被配置成與引物寡核苷酸配合以擴(kuò)增靶核苷酸序列，由此，當(dāng)所述探針寡核苷酸被引入到擴(kuò)增子中時，生成可檢測信號。
12.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包含第二探針寡核苷酸，其中所述第一和第二探針寡核苷酸選擇性地與核酸模板的不同靶核苷酸序列雜交；并且其中所述兩個探針寡核苷酸各具有與其連接的標(biāo)記部分，并且其中所述標(biāo)記部分提供了兩種不同的可檢測信號或提供相同的可檢測信號。
13.如權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其中所述第一探針寡核苷酸包含引物-探針，所述引物-探針被配置為與引物寡核苷酸配合以擴(kuò)增具有第一標(biāo)記的第一擴(kuò)增子，從而提供與擴(kuò)增子頻率相關(guān)的信號，并且其中，所述第二探針寡核苷酸是第二引物-探針或內(nèi)部探針，其包含第二標(biāo)記和與靶序列互補(bǔ)的序列；其中所述靶序列包含所述第一擴(kuò)增子的可變序列段或在核酸模板別處的可變序列；由此第一引物-探針和所述第二探針之間的信號傳遞差異提供相對于所述第一擴(kuò)增子頻率的所述變體序列頻率的指示。
14.如權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，其中至少一個探針系統(tǒng)選自由ZIPR引物-探針、內(nèi)部iDDS探針或內(nèi)部Flip探針組成的組。
15.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中所述引物-探針系統(tǒng)備選地包含G-Force引物-探針，所述G-Force引物-探針包括:(i)5’突光標(biāo)記的探針片段,其包括約7-9個堿基的富含胞嘧啶的序列，(ii)無堿基的間隔子，(iii)與所述富含胞嘧啶的序列區(qū)互補(bǔ)的富含鳥嘌呤的反義探針序列，以及(iv)引物序列；由此，當(dāng)被標(biāo)記的引物-探針寡核苷酸被引入到所產(chǎn)生的擴(kuò)增子中時，能夠產(chǎn)生可檢測的信號。
16.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)還包括適于擴(kuò)增和檢測RNA或DNA靶序列的ISAM等溫擴(kuò)增系統(tǒng)，其中所述引物-探針寡核苷酸被配置成與側(cè)翼引物配合以擴(kuò)增所述靶序列；其中所述側(cè)翼引物進(jìn)一步包含5' RNA聚合酶啟動子序列；并且其中所述擴(kuò)增檢測系統(tǒng)還包括RNA聚合酶啟動子酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNaseH酶；其中所述引物-探針寡核苷酸任選地包含5' RNA聚合酶啟動子序列；并且其中反義探針寡核苷酸任選地包含與RNA聚合酶啟動子序列互補(bǔ)的序列；并且其中所述引物-探針寡核苷酸被配置為包含一個或兩個引物；由此，信號傳遞和RNA轉(zhuǎn)錄從所述擴(kuò)增子的一端或兩端提供；以及任選地，引物被固定在固體基底上。
17.如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)還包括適于擴(kuò)增和測定RNA或DNA靶序列的ISAM等溫擴(kuò)增系統(tǒng)，其中，所述iDDS探針寡核苷酸互補(bǔ)于包含約20至約25個核苷酸長的內(nèi)部靶序列；并且其中，所述反義探針寡核苷酸包含約10至約15個核苷酸的長度；并且其中一個或兩個側(cè)翼引物另外包含5' RNA聚合酶啟動子序列；和包括RNA聚合酶啟動子酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNaseH酶的擴(kuò)增檢測系統(tǒng)；以及任選地，引物被固定在固體基底上。
18.如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)被配置為檢測EGFR基因外顯子21的可變核苷酸堿基位置，所述系統(tǒng)包括寡核苷酸SEQ ID NOs:7-12和39-41。
19.如權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)被配置為檢測EGFR基因外顯子19的密碼子746至753內(nèi)的可變多堿基缺失，所述系統(tǒng)包括至少一個未標(biāo)記的引物，和具有不同標(biāo)記的兩個探針:反義探針系統(tǒng)；其中，所述第一探針系統(tǒng)包括與非特異性的第一序列互補(bǔ)的引物-探針；其中，所述第二探針系統(tǒng)與外顯子19缺失位點(diǎn)的野生型序列互補(bǔ)，并抑制或排除包含EGFR基因外顯子19的密碼子746至753內(nèi)多堿基缺失的靶模板的檢測；由此，外顯子19缺失的存在和頻率通過比較兩個探針系統(tǒng)的相對信號傳遞進(jìn)行評估。
20.如權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中所述非特異性探針:反義探針-引物組是SEQIDNOs.:56，57和53，或SEQ ID NOs.:79，80和12 ;并且其中，所述缺失-19僅野生型探針:反義探針-引物組是SEQ ID NOs.:81，82，和53，或SEQ ID NOs:54，55和53，并且其中每個非特異性探針:反義探針-引物組和缺失-19僅野生型-探針:反義探針-引物組可任選地包括補(bǔ)充的引物SEQ ID N0.:78o
21.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述反義探針寡核苷酸與Taqman或MolecularBeacon探針測定相結(jié)合；其中反義探針寡核苷酸包含熒光調(diào)制器，并包含部分互補(bǔ)于Taqman 或 Molecular Beacon 探針的序列。
22.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述探針:反義探針系統(tǒng)被配置為檢測EGFR基因的外顯子19，20或21、VK0RC1基因、CYP2C9基因、大腸桿菌(E.coli)的uidA基因、革蘭氏陽性細(xì)菌的16s基因、革蘭氏陰性細(xì)菌的16s基因、分枝桿菌(mycobacterium)的inhA基因、分枝桿菌的rpoB基因、分枝桿菌的16S基因、流感病毒的血凝素(HA)基因、A型流感病毒的基質(zhì)(M)基因、B型流感病毒的非結(jié)構(gòu)(NS)基因和KRAS基因的核苷酸變體。
23.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述探針:反義探針系統(tǒng)包括選自以下組成的組的核酸序列:SEQ ID NOs:1 和 2，SEQ ID NO:3 和 4，SEQ ID NO:7 和 8，SEQ ID NO:9 和 10，SEQ ID NOs:13 和 14，SEQ ID NOs:17 和 18，SEQ ID NOs:19 和 20，SEQ ID NOs:23 和 24，SEQ IDNOs:36 和 37，SEQ ID NOs:54 和 55，SEQ ID NOs:56 和 57，SEQ ID NOs:64 和 65，SEQ ID NOs:66 和 67，SEQ ID NO:70 和 71，SEQ ID NOs:72 和 73，SEQ ID NOs:79 和 80，SEQ ID NOs:81 和 82，SEQ ID NOs:85 和 86，SEQ ID NOs:88 和 89，和 SEQ ID NOs:91 和92。
24.如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括未標(biāo)記的阻斷終止子探針，用于選擇性抑制第一靶序列相對于第二個靶序列的qPCR擴(kuò)增和檢測； 其中所述終止子探針包括:(i)互補(bǔ)于所述第一靶核苷酸序列的寡核苷酸，(ii)被修飾以抵抗核酸外切酶消化的5'端，(iii)被修飾以抵抗聚合酶延伸的3'端,和(iv)其中所述終止子探針進(jìn)一步配置有Tm和AG，所述Tm和ΛG超出qPCR測定的引物和/或探針的Tm和AG至少約5千卡/摩爾的ΛG和至少約5°C的Tm。
25.如權(quán)利要求24所述的系統(tǒng)，用于增強(qiáng)結(jié)合，其中所述終止子探針還包括非天然核苷酸、小溝結(jié)合物(MGB)以及Zip核酸(ZNA)中的至少一個。
26.一種用于qPCR靶增強(qiáng)的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括第一子系統(tǒng)和第二子系統(tǒng)，所述第一子系統(tǒng)包括:(i)互補(bǔ)于第一靶核苷酸序列的未標(biāo)記的終止子探針寡核苷酸，及(ii)被配置為擴(kuò)增包括第一和第二靶核苷酸序列的核酸區(qū)域的引物對；和第二子系統(tǒng)包括:(i)由所述第一預(yù)擴(kuò)增子系統(tǒng)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋小份，其中所述稀釋小份包含約.0.05%或更少的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；(ii)互補(bǔ)于至少第二靶核苷酸序列的至少一種探針:反義探針系統(tǒng)，以及(iii)被配置為擴(kuò)增包括所述第一和第二靶核苷酸序列的核酸區(qū)域的至少一種引物；由此，當(dāng)所述第一靶核苷酸序列的頻率超過所述第二靶核苷酸序列的頻率20: I或更高的比例時，通過所述第一子系統(tǒng)的預(yù)擴(kuò)增與通過所述第二子系統(tǒng)的再擴(kuò)增和檢測提供選擇性擴(kuò)增 和檢測所述第二靶核苷酸序列的手段。
【文檔編號】C12Q1/68GK103946398SQ201280056114
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月15日
【發(fā)明者】戴維·A·謝弗 申請人:戴維·A·謝弗