纖維變性易感性il22ra2基因及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了纖維變性易感性基因座IL22RA2基因座的鑒定，所述基因座可用于纖維變性的易感性檢測、診斷和預(yù)后以及治療活性藥物的篩選。本發(fā)明還提供了用于確定患有病毒感染的患者對使用抗病毒劑和/或干擾素的治療做出響應(yīng)的可能性的方法，所述方法包括確定所述患者的生物樣品中IL22RA2基因座中、或IL22RA2表達(dá)或IL22RA2蛋白活性中的變化。
【專利說明】纖維變性易感性丨L22RA2基因及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總的來說涉及遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明公開了人類易感性基 因的鑒定，所述基因可用于對組織中可能引起纖維變性的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECMP)的異常沉 積進(jìn)行診斷或預(yù)后，或用于檢測在肝臟疾病、肝硬化、皮膚瘢痕瘤、肥胖癥和任何纖維變性 疾病以及在其他組織例如心、血管或腦的疾病中發(fā)生的這種異常ECMP沉積或纖維變性的 易感性。更具體來說，本發(fā)明公開了 6號染色體上IL22RA2基因的某些等位基因，其與纖 維變性的易感性相關(guān)并代表了用于篩選治療活性藥物的新靶點(diǎn)。更具體來說，本發(fā)明涉及 IL22RA2基因和表達(dá)產(chǎn)物中的特定突變，以及基于這些突變的診斷工具和試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積累可能具有有害效應(yīng)。組織中ECMP的異常沉積可能 引起組織纖維變性。
[0003] 纖維變性是器官、其任何部分或組織中，例如肝臟、其任何部分或組織中纖維狀結(jié) 締組織的過度生長，特別是對損傷做出響應(yīng)的過度生長。
[0004] 異常纖維變性發(fā)生在各種病因的慢性肝臟炎癥中，例如在肝炎病毒和血吸蟲感染 中。以前顯示，被血吸蟲感染的某些對象是慢性纖維變性患者，而其他對象是快速纖維變性 患者，并且這部分取決于位于Chr6q22_q23上的主要基因（Dessein等，1999 ;Mohamed_Ali 等，1999)。國際專利申請W02010/094740將CTGF (CCN2)鑒定為該區(qū)域中的纖維變性易感 性基因。
[0005] 血吸蟲病由在宿主的血管系統(tǒng)中發(fā)育并產(chǎn)卵的蠕蟲引起，某些卵被運(yùn)載到肝臟， 在那里它們在門靜脈周圍間隙中引發(fā)炎癥。由于蠕蟲在它們的人類宿主中生活多年，因此 在受感染對象中伴有大量組織破壞的慢性肝炎是常見的。組織修復(fù)需要在受損組織中沉積 ECMP，其在隨后被更新并被正常肝細(xì)胞替代。在某些患者中ECMP積累在門靜脈周圍間隙 中，形成纖維變性沉積物，其減少血液流動(dòng)，造成靜脈曲張、腹水。在慢性或重復(fù)損傷數(shù)月或 數(shù)年后，纖維變性變得永久且不可逆。對象死于纖維變性的結(jié)果。
[0006] 在南方國家，據(jù)估計(jì)3億5千萬受感染對象中的5至10%可能發(fā)生嚴(yán)重肝纖維變 性。沒有良好的標(biāo)志物允許在血吸蟲感染的對象中預(yù)測并追蹤肝纖維變性的進(jìn)展。
[0007] 肝纖維變性的診斷大多數(shù)基于肝臟活檢、彈性測量法和超聲分析。
[0008] 取決于臨床情況，活檢樣品通過經(jīng)皮、經(jīng)頸靜脈的放射照相引導(dǎo)的細(xì)針或腹腔鏡 途徑來獲得。組織病理學(xué)檢查能夠使臨床醫(yī)生對炎癥壞死的嚴(yán)重性分級并對纖維變性的程 度分期。Metavir評分系統(tǒng)使用如下所述的1-4的量表為纖維變性的階段指派分值：F0=無 纖維變性，F(xiàn)l=門靜脈纖維變性而沒有隔膜，F(xiàn)2=門靜脈纖維變性和少數(shù)隔膜，F(xiàn)3=大量隔膜 而沒有肝硬化，F(xiàn)4=肝硬化（Bedossa等，1996)。肝臟活檢是侵入性和昂貴的程序，并且僅對 肝臟的少部分取樣。因此，它不能提供肝纖維變性的全面評估，并且易受取樣變差和觀察者 間和觀察者內(nèi)誤差的影響。此外，肝臟活檢伴有3%的顯著發(fā)病率和0.03%的死亡率。潛在 的并發(fā)癥包括與活檢相關(guān)的局部血腫、感染和疼痛。
[0009] 非侵入性測試（即血清學(xué)標(biāo)志物、彈性測量法、超聲分析）也被使用，但是尚未準(zhǔn)備 好用于常規(guī)臨床使用。
[0010] 血液標(biāo)志物評估組已被測試，主要是在患有慢性丙型肝炎或由病毒性丙型肝炎造 成的肝硬化的患者中。這些研究揭示，血清標(biāo)志物可以在約35%的患者中判斷出或排除纖 維變性（Sebastiani等，2006)。然而，當(dāng)單個(gè)地看待患者時(shí)，這些標(biāo)志物不能可靠地區(qū)分纖 維變性的各個(gè)階段。更近的研究合并了三個(gè)血清標(biāo)志物評估組來設(shè)計(jì)提高診斷準(zhǔn)確性的算 法（Parkes等，2006)。所評估的3個(gè)評估組是APRI (天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與血小板比率指數(shù))、 Forns指數(shù)(血小板、Y -谷氨?；D(zhuǎn)肽酶、膽固醇)和Fibrotest(GGT、結(jié)合珠蛋白、膽紅素、 載脂蛋白A、a -2-巨球蛋白）。由APRI和隨后的Fibrotest構(gòu)成的算法將纖維變性的診斷 準(zhǔn)確性提高到高于90%。該研究組估計(jì)，使用這種算法能夠避免高達(dá)50%的肝臟活檢需要。 然而，使用這種算法不能辨別纖維變性的各個(gè)階段。這些血清標(biāo)志物的限制是當(dāng)存在高活 性肝臟炎癥時(shí)假陽性的可能性。
[0011] Fibroscan是對肝纖維變性進(jìn)行分期的另一種方法，其基于為肝組織平均剛度提 供快速測量的彈性成像術(shù)（Ziol等，2005)。使用探針將低頻低振幅的振動(dòng)傳送到肝臟中。 這種振動(dòng)波觸發(fā)彈性剪切波，其通過肝臟的速度與以千帕（kPa)為單位度量的組織剛度成 正比。與肝臟活檢相比，F(xiàn)ibroscan技術(shù)的靈敏度在79至95%的范圍內(nèi)，特異性在78至95% 的范圍內(nèi)。然而，這種技術(shù)的限制與彈性波在流體或脂肪組織中的衰減相關(guān)，所述衰減損害 患者中纖維變性的評估。此外，F(xiàn)ibroscan是極為昂貴的儀器。
[0012] 對于從肝臟根除HCV來說，目前的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)（SOC)由PEG化的I型干 擾素（PegIFN)和合成核苷利巴韋林（RBV)療法構(gòu)成（Fried MW等，N Engl J Med. 2002; 347 (13) :975-82 ;"EASL臨床實(shí)踐指南：丙肝病毒感染的管理"（EASL Clinical Practice Guideline:Management of Hepatitis C virus infection, J Hepatol), 2011;55:245-264)。然而，這種標(biāo)準(zhǔn)療法具有有限和不可預(yù)測的效能、常常導(dǎo)致治療中斷的 廣泛的毒性分布情況，并且非常昂貴。少于一半的基因型1和4的慢性HCV感染個(gè)體對標(biāo) 準(zhǔn)療法（PegIFN/RBV)的長期治療（48 周）有響應(yīng)（Testino G 等，Hepatogastroenterology 2011;58(106):536-8)。
[0013] 因此，為了優(yōu)化治療、避免對非響應(yīng)者的副作用和降低治療費(fèi)用，對選擇具有更好 的機(jī)會(huì)對治療做出響應(yīng)的患者的方法，存在著需求。
[0014] 總而言之，對于預(yù)測纖維變性的進(jìn)展和治療效率的有效方法，仍存在需求。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明的目的是提供用于纖維變性預(yù)后和治療的新的遺傳學(xué)方法?，F(xiàn)在，本發(fā)明 公開了另一個(gè)人類纖維變性易感性基因座IL22RA2基因座的鑒定，所述基因座可用于異常 ECMP沉積、特別是纖維變性、尤其是肝纖維變性的易感性檢測、診斷和預(yù)后，以及用于治療 活性藥物的篩選。具體來說，本發(fā)明涉及一種方法，所述方法包括檢測來自于所述對象的樣 品中IL22RA2基因座的變化的存在，所述變化的存在是異常ECMP沉積或纖維變性的存在或 易感性的指示。
[0017] 本發(fā)明的具體目的在于對象中發(fā)生異常ECMP沉積或纖維變性的易感性檢測或診 斷和/或預(yù)后的體外方法，所述方法包括檢測來自于所述對象的樣品中IL22RA2基因或多 肽的變化的存在，所述變化的存在是異常ECMP沉積或纖維變性的存在的指示、或?qū)Ξ惓?ECMP沉積或纖維變性的易感性的指示。本發(fā)明的具體目的在于用于評估(預(yù)測）異常ECMP 沉積或纖維變性的進(jìn)展的方法。
[0018] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述變化位于IL22RA2基因的起始密碼子上游的500kb之內(nèi)， 優(yōu)選地IOOkb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)，并位于IL22RA2基因的3 'UTR下游的500kb之內(nèi)，優(yōu) 選地IOOkb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)。優(yōu)選地，所述變化位于IL22RA2基因的起始密碼子上 游IOkb區(qū)域和非翻譯區(qū)（3' UTR)下游IOkb區(qū)域的周圍序列中。
[0019] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述變化是一個(gè)或多個(gè)堿基的突變、插入或缺失。在 更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述變化是與纖維變性相關(guān)的一個(gè)或數(shù)個(gè)單核苷酸多態(tài)性SNP或 SNP的單倍體型。優(yōu)選地，所述單核苷酸多態(tài)性是IL22RA2基因側(cè)翼的SNP，其是位置接近 IL22RA2基因的等位基因變體。
[0020] 本發(fā)明的方法允許對人類纖維變性疾病中發(fā)生的纖維變性進(jìn)行檢測和預(yù)后，所述 纖維變性疾病選自肝臟疾病纖維變性、肝硬化、皮膚瘢痕瘤、增生性瘢痕和肥胖癥、酗酒或 藥物性肝中毒。特別是，所述肝纖維變性可能由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒（HCV)、日本 血吸蟲（S. japonicum)或曼森氏血吸蟲（S. mansoni)感染引起。
[0021] 在特定實(shí)施方式中，所述方法包括對對象、優(yōu)選地被肝炎病毒或寄生蟲感染的對 象的生物樣品中IL22RA2基因座中的SNP進(jìn)行基因分型，其中在SNP rs6570136中存在基因 型GG，在SNP rs7774663中存在基因型TT，在SNP rslll54915中存在基因型TT、CT和/或 在SNPrs2064501中存在基因型CC，指示了在所述對象中發(fā)生異常ECMP沉積例如纖維變性 的風(fēng)險(xiǎn)，或指示了異常ECMP沉積例如纖維變性的發(fā)生，或指示了纖維變性的不良預(yù)后。所 述纖維變性更具體地是肝纖維變性。
[0022] 或者，所述方法可以包括對與本文中提到的SNP處于連鎖不平衡（LD)中的任何 SNP進(jìn)行基因分型。
[0023] 優(yōu)選地，所述IL22RA2基因座中的變化，通過進(jìn)行選擇性雜交測定法、測序測定 法、微量測序測定法和/或等位基因特異性擴(kuò)增測定法來確定。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，IL22RA2基因中的所述變化通過限制性酶消化來確定，檢測 到至少一個(gè)所述SNP是纖維變性的指示。
[0025] 本發(fā)明還涉及用于為患有異常ECMP沉積例如纖維變性或?qū)Πl(fā)生異常ECMP沉積例 如纖維變性易感的對象選擇治療性化合物的方法，所述方法包括將測試化合物與IL22RA2 多肽或基因或其片段相接觸，并確定所述測試化合物提高或降低與IL22RA2基因相關(guān)的途 徑的生物活性或功能的能力。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)主題是一種用于確定患有病毒感染的患者對使用抗病毒劑和/ 或干擾素的治療做出響應(yīng)的可能性的體外方法，所述方法包括確定所述患者的生物樣品中 IL22RA2基因座中、或IL22RA2蛋白表達(dá)或活性中的變化。
[0027] 在特定實(shí)施方式中，所述方法包括對對象的生物樣品中IL22RA2基因座中的SNP 進(jìn)行基因分型，其中對于SNP rslll54915來說TT基因型、對于SNP rs6570136來說AG或 GG基因型、對于SNP rs2064501來說CT基因型和/或?qū)τ赟NP rs 1543509來說AA基因型 的存在，有利于患者對所述治療的陽性響應(yīng)?；蛘?，所述方法可以包括對與本文中提到的 SNP處于連鎖不平衡（LD)中的任何SNP進(jìn)行基因分型。
[0028] 在特定實(shí)施方式中，所述治療包含抗病毒劑，并任選地連同干擾素。
[0029] 優(yōu)選地，所述抗病毒劑是病毒復(fù)制的抑制劑，例如利巴韋林。
[0030] 圖例說明
[0031] 圖IA和IB示出了來自于日本血吸蟲流行區(qū)對象的PMBC的培養(yǎng)物中的IL-22和 L-17水平。在來自于19個(gè)對照和70個(gè)流行區(qū)對象的經(jīng)過144小時(shí)靜置的培養(yǎng)物和被卵刺 激的培養(yǎng)物中獲得數(shù)據(jù)。圖IC示出了來自于流行區(qū)對象血液的IL22+細(xì)胞的FACS分析。 數(shù)據(jù)來自于20個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。
[0032] 圖2A示出了 PBMC培養(yǎng)物中的IL-22水平隨過去10年內(nèi)抗血吸蟲病治療的次數(shù) 而變。研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的HBV感染（HBS Ag-)。
[0033] 抗血吸蟲治療：對象在過去10年內(nèi)按照下列方案服用吡喹酮：從未，1至4次， 5-10 次，>10 次。
[0034] 對照是尚未暴露于日本血吸蟲并且從未用吡喹酮治療過的對象。星號：用日本血 吸蟲卵刺激的培養(yǎng)物；空心圓圈：靜置培養(yǎng)物；每個(gè)組的對象數(shù)目：對照（19)，處理：未治 療（9),1-4 (30),5-10 (23)，〈10 (8)。
[0035] 圖2B示出了 PBMC培養(yǎng)物中IL-22的水平隨肝纖維變性的程度而變。
[0036] 研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的HBV感染（HBS Ag-)。對照是 尚未暴露于日本血吸蟲的對象；星號：用日本血吸蟲卵刺激的培養(yǎng)物；空心圓圈：靜置培養(yǎng) 物。纖維變性等級如方法中所述進(jìn)行評估，并且大多數(shù)是中央纖維變性等級，外周纖維變性 只有在將具有輕度中央纖維變性的對象分成一個(gè)沒有或具有輕度外周纖維變性的組（CLL) 和一個(gè)具有輕度中央纖維變性并發(fā)展成嚴(yán)重（GNM，GNH)外周纖維變性的組（CLL，GNM)時(shí)才 考慮在內(nèi)。每個(gè)組的對象數(shù)目：對照（19)，CLL (23)，CLL GNM (27)，CLM (10)，CLH (7)， D、E、F (3)。
[0037] 圖2C示出了具有不同肝纖維變性等級并使用不同治療的對象中的IL-22水平。 研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的HBV感染（HBS Ag-)。對照是尚未暴露 于日本血吸蟲的對象。對象已被治療0至4次(空心圓圈)或超過5次至20次(實(shí)心圓圈）。 每個(gè)組的對象數(shù)目：治療組合并如下：〇至4次治療以及>5次治療，以便增加每個(gè)點(diǎn)的對象 數(shù)目
[0038] 對照：19 ;0_4次治療：39 ;>5次治療：對照：31。
[0039] 圖3A示出了抗血吸蟲治療對卵刺激的培養(yǎng)物中IL-22、IL-6、IL-I P或IL-23水 平的影響。研究對象超過30歲并小于65歲，并且沒有有活性的HBV感染（HBS Ag-)。對照是 尚未暴露于日本血吸蟲的對象。將來自于研究對象的PBMC用卵刺激，并在24小時(shí)（IL-lb、 IL-23、IL-6)和144小時(shí)（IL-22)時(shí)評估上清液中的細(xì)胞因子。將IL-6水平乘以0. 1。
[0040] 圖3B示出了在來自于對照和具有各種不同程度肝纖維變性的對象的卵刺激的 卩1^(：中11-22、11-6、11-10或11-23的水平。研究和每個(gè)組中的對象數(shù)目與圖24相同。
[0041] 圖4是在IL22RA2中定位SNP和關(guān)聯(lián)性區(qū)段（correlation bin)的圖譜。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] 本發(fā)明提供了在人類中用于在纖維變性、尤其是肝纖維變性中預(yù)測疾病進(jìn)展的有 價(jià)值的遺傳標(biāo)志物。
[0044] ECMP的異常積累或纖維變性的早期檢測，以及這樣的積累或纖維變性的定期監(jiān) 測，允許啟動(dòng)抗纖維變性療法，從而能夠中止并甚至逆轉(zhuǎn)這一過程。這將反過來防止發(fā)展為 人類纖維變性疾病例如肝纖維變性或肝硬化，以及這種病癥帶來的發(fā)病和死亡。這些各種 早期纖維變性檢測技術(shù)的開發(fā)對于肝病患者未來的護(hù)理是一個(gè)好的兆頭。
[0045] 現(xiàn)在，本發(fā)明發(fā)明人已鑒定出與人類纖維變性相關(guān)的基因。他們顯示，在分別被 日本血吸蟲和曼森氏血吸蟲感染的中國人、蘇丹人和巴西人組群中，纖維變性顯著依賴于 位于IL22RA2基因中的等位基因變體。IL22RA2 ("白介素-22受體a-2"）基因，也稱為 IL22R-BP，編碼IL-22受體的可溶形式，其競爭IL-22與其受體的結(jié)合。
[0046] 更具體來說，本發(fā)明發(fā)明人對全都生活在血吸蟲流行區(qū)的中國人(暴露于日本血 吸蟲)、蘇丹人和巴西人(暴露于曼森氏血吸蟲)的獨(dú)立樣品進(jìn)行了病例對照研究。由至少兩 位觀察者使用超聲回波描記術(shù)對每個(gè)樣品進(jìn)行肝纖維變性（HF)評估。測試了 IL22RA2中 的所有標(biāo)簽SNP (次要等位基因頻率>10%)。為了排除與相關(guān)SNP連鎖不平衡的SNP是否 能夠解釋觀察到的關(guān)聯(lián)性，發(fā)明人評估了在IL22RA2的3'和5'的500Kb區(qū)域內(nèi)的SNP。
[0047] 因此，本發(fā)明提供了在對象中確定發(fā)生肝纖維變性的風(fēng)險(xiǎn)或肝纖維變性的發(fā)生或 肝纖維變性的不良預(yù)后的方法，所述方法包括在來自于所述對象的樣品中檢測IL22RA2基 因座處風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP)等位基因的存在。
[0048] 更具體來說，本發(fā)明提供了確定發(fā)生肝纖維變性的風(fēng)險(xiǎn)或肝纖維變性的發(fā)生或肝 纖維變性的不良預(yù)后的方法，所述方法包括對來自于所述對象的樣品中IL22RA2基因座中 的SNP進(jìn)行基因分型。
[0049] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)測對病毒感染治療的響應(yīng)的遺傳學(xué)方法。本發(fā) 明現(xiàn)在公開了抗病毒治療響應(yīng)基因座、即IL22RA2基因座的鑒定，所述基因座可用于預(yù)測 患有病毒感染、尤其是HCV的患者對抗病毒治療的響應(yīng)。具體來說，本發(fā)明涉及一種方法， 所述方法包括在來自于對象的樣品中檢測IL22RA2基因座中的變化的存在，所述變化的存 在指示了對治療的響應(yīng)，即指示了患者不對治療做出響應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)水平。
[0050] 本發(fā)明的方法允許預(yù)測對治療的響應(yīng)，所述治療使用給藥于患有病毒感染、尤其 是丙型肝炎的患者的抗病毒劑例如利巴韋林和干擾素。
[0051] 本發(fā)明提供了尤其是在丙型肝炎中用于預(yù)測對抗病毒治療的響應(yīng)的有價(jià)值的標(biāo) 志物。
[0052] 對抗病毒治療有響應(yīng)和無響應(yīng)對象的早期鑒定，允許根據(jù)患者的基因型啟動(dòng)個(gè)體 化(個(gè)性化）治療。這將進(jìn)而幫助醫(yī)生做出更合理的決定，避免不需要的開支和不必要的副 作用。這些各種早期預(yù)測技術(shù)的開發(fā)對于患有病毒感染、尤其是丙型肝炎的患者未來的護(hù) 理是一個(gè)好的兆頭。
[0053] 現(xiàn)在，本發(fā)明發(fā)明人已鑒定出與對抗病毒治療的響應(yīng)相關(guān)的基因。他們已顯示，在 被HCV感染的各種組群中，對抗病毒治療利巴韋林-IFN的響應(yīng)取決于位于IL22RA2基因中 的等位基因變體。
[0054] 盡管取決于被測試的群體，由本發(fā)明發(fā)明人收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能證實(shí)某些等位基 因的關(guān)聯(lián)性，但本發(fā)明不限于被發(fā)現(xiàn)在所有被測試的群體中與纖維變性顯著相關(guān)的特定 SNP。事實(shí)上，有幾個(gè)原因可以解釋在某些群體中證實(shí)顯著關(guān)聯(lián)性的失敗，包括組群不足、混 雜變量的評估不完全、所述群體中SNP的頻率較低等。
[0055] 定義
[0056] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECMP)的異常沉積"是指可能在所 有類型的人類組織中積累的細(xì)胞外基質(zhì)組分(包括層粘連蛋白、纖連蛋白EIIIA、膠原蛋白 I和IV、前膠原蛋白III、彈性蛋白、腱生蛋白）。這樣的積累可能是有害的，例如當(dāng)它出現(xiàn)在 動(dòng)脈、心臟或腦中時(shí)。當(dāng)沉積巨大時(shí)，積累導(dǎo)致組織的纖維變性。
[0057] 在本發(fā)明的上下文中，"纖維變性"是指在所有人類纖維變性疾病例如肝病、肝硬 化、皮膚瘢痕瘤、增生性瘢痕、硬皮病、肥胖癥和任何纖維變性疾病中發(fā)生的所有類型的人 類纖維變性。
[0058] 在本發(fā)明的上下文中，"肝纖維變性"或"HF"是指在肝、其組織或其組織的任何部 分中發(fā)生的所有類型的纖維變性。肝纖維變性尤其是在對損傷做出響應(yīng)時(shí)發(fā)生。肝纖維變 性可以是對慢性肝損傷的常見響應(yīng)，最終引起肝硬化及其并發(fā)癥、門靜脈高壓、肝衰竭和肝 細(xì)胞癌。肝纖維變性是過分旺盛的傷口愈合，其中過量的結(jié)締組織在肝臟中堆積。細(xì)胞外 基質(zhì)被過量產(chǎn)生、不充分地降解或兩種情況皆有。觸發(fā)事件是慢性損傷，特別是如果存在炎 性組分的話。各種類型的慢性肝損傷可以引起纖維變性，例如化學(xué)性纖維變性（CCl 4)、細(xì)菌 性（即布魯氏菌病)、寄生蟲性（即由裂體吸蟲屬（Schistosoma)物種引起的裂體吸蟲病/血 吸蟲??；或包蟲病感染）或病毒性（即由甲肝病毒（HAV)、乙肝病毒（HBC)或丙肝病毒（HCV) 感染引起的肝炎）損傷。
[0059] 在本發(fā)明的上下文中，"皮膚瘢痕瘤"是皮膚上瘢痕組織的過度生長。更具體來說， 瘢痕瘤和增生性瘢痕（HSc)是人類特有的在創(chuàng)傷、炎癥、手術(shù)、燒傷后以及有時(shí)自發(fā)發(fā)生的 真皮纖維增殖性障礙。它們的特征在于膠原蛋白在真皮和皮下組織中的過度沉積。與正常 傷口修復(fù)的細(xì)紋瘢痕特征相反，瘢痕瘤和HSc的旺盛的瘢痕形成通常引起毀容、攣縮、瘙癢 和疼痛。瘢痕瘤在黑種人、西班牙人和東方人中發(fā)生在具有家族傾向性的個(gè)體中。與HSc不 同，瘢痕瘤的瘢痕擴(kuò)大并延伸到原始傷口的邊緣之外并很少減退。這些障礙代表了傷口愈 合的基礎(chǔ)過程的失常，所述過程包括細(xì)胞遷移和增殖、炎性、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM) 蛋白的合成和分泌增加以及新合成基質(zhì)的重塑。在生物學(xué)上，瘢痕瘤是纖維變性組織，其特 征在于過度沉積有細(xì)胞外基質(zhì)組分、尤其是膠原蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖的非 典型性成纖維細(xì)胞的集合。總的來說，瘢痕瘤含有相對無細(xì)胞的中心和濃密豐富的膠原蛋 白束，其在病變的真皮深層部分中形成結(jié)節(jié)。在愈合的炎性階段期間生長因子的釋放和活 化是瘢痕形成過程的先決條件，所述過程包括血管生成、表皮再生、成纖維細(xì)胞的募集和增 殖以及基質(zhì)沉積。然后，調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子包括IL22RA2的活性的異常產(chǎn)生，可能造成瘢痕瘤 的發(fā)生。
[0060] 在本發(fā)明的上下文中，"IL22RA2基因座"是指細(xì)胞或生物體中的所有序列或產(chǎn)物， 包括IL22RA2編碼序列、IL22RA2非編碼序列(例如內(nèi)含子)、控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的IL22RA2 調(diào)控序列（例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等)、所有相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物例如IL 2 2 RA 2 RNA (例如 mRNA)和IL22RA2多肽(例如前體蛋白和成熟蛋白）；以及IL22RA2基因的起始密碼子上游 500kb區(qū)域、優(yōu)選地100kb、優(yōu)選地20kb區(qū)域和非翻譯區(qū)（3, UTR)下游500kb區(qū)域、優(yōu)選地 100kb、優(yōu)選地20kb區(qū)域的周圍序列。例如，IL22RA2基因座包含含有表1的SNP的周圍序 列。
[0061] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"預(yù)后"包括在成年人、兒童和胎兒中，在包括早期、癥 狀出現(xiàn)前的階段和晚期階段的各個(gè)階段檢測、監(jiān)測、給藥、比較等。預(yù)后通常包括評估(預(yù) 測）纖維變性的進(jìn)展和確定對象特征以確定最適合的治療(藥物遺傳學(xué)）等。本發(fā)明提供了 用于確定由IL22RA2基因座中的突變或多態(tài)性引起的纖維變性或相關(guān)障礙的發(fā)展速度的 預(yù)后方法。
[0062] "樣品"可以是源自于患者或?qū)ο蟮暮泻怂峄蚨嚯牡娜魏紊飿悠?。這樣的樣品 的實(shí)例包括流體、組織、細(xì)胞樣品、器官、活檢樣品等。最優(yōu)選的樣品是血液、血漿、唾液、尿 液、精液等。樣品可以按照常規(guī)技術(shù)來收集并直接用于診斷或儲存。
[0063] "患者"可以是任何哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人類，無論其年齡或性別如何?；颊呖赡鼙?病毒感染，所述病毒包括選自下列病毒科的病毒：沙粒病毒科(例如拉沙病毒)，冠狀病毒科 (例如嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒)，黃病毒科(例如丙肝或乙肝病毒、登革病毒、西尼羅病毒、 黃熱病病毒、蝶傳腦炎病毒)，纖絲病毒科(例如埃博拉病毒、馬爾堡病毒)，皰疫病毒科(例 如單純性皰疫病毒、巨細(xì)胞病毒、Epstein-Barr病毒、水痘帶狀皰疫病毒)，正粘病毒科(例 如流感A和B病毒)，副粘病毒科(例如呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、PMV、麻疹病毒)，痘 病毒科(例如痘苗病毒、天花病毒)，彈狀病毒科(例如水皰性口炎病毒、病毒性出血性敗血 癥病毒、狂犬病病毒)，反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如HIV和其他反轉(zhuǎn)錄病毒)，披膜病毒科(例如基孔 肯亞病毒、辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒、羅斯河病毒、東部馬腦炎病毒)。在特定實(shí)施 方式中，患者被丙肝病毒例如基因型1的丙肝病毒感染。
[0064] 在用于確定患有病毒感染的患者對使用抗病毒劑和/或干擾素的治療做出響應(yīng) 的可能性的方法中，術(shù)語"病毒感染"是指可以用利巴韋林和/或IFN治療的所有類型的人 類病毒感染，例如丙型肝炎、乙型肝炎、呼吸道合胞體病毒（RSV)細(xì)支氣管炎、腺病毒病、流 感和用利巴韋林和/或IFN治療的任何人類病毒感染。
[0065] 在本發(fā)明的上下文中，"響應(yīng)者"是指對使用抗病毒劑、尤其是利巴韋林和/或IFN 的治療做出響應(yīng)的患者的表型，即病毒載量降低，其至少一種癥狀減輕，或疾病的發(fā)展停止 或減緩。
[0066] 在本發(fā)明的上下文中，"非響應(yīng)者"是指對使用抗病毒劑、尤其是利巴韋林和/或 IFN的治療沒有響應(yīng)，或者做出響應(yīng)但在1或2年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者的表型。對治療無響應(yīng)是指 病毒載量沒有顯著降低，患者癥狀沒有減輕或疾病繼續(xù)發(fā)展。復(fù)發(fā)患者對治療做出短期響 應(yīng)，但是它們的病毒載量和癥狀在治療結(jié)束后的1或2年內(nèi)再次增加。
[0067] 術(shù)語"治療"或"抗病毒治療"是指抗病毒劑和/或干擾素（IFN)的給藥。
[0068] 優(yōu)選地，干擾素是干擾素Y。然而也涵蓋其他干擾素，包括干擾素a 2B、PEG化的 干擾素a、復(fù)合干擾素、干擾素a 2A和類淋巴母細(xì)胞干擾素T。在優(yōu)選實(shí)施方式中，干擾 素是PEG化的干擾素，例如PEG化的干擾素Y。
[0069] "抗病毒劑"可以是干擾病毒進(jìn)入細(xì)胞或病毒復(fù)制或抑制病毒蛋白的活性的任何 化合物。例如，它可以是干擾RNA、反義RNA、咪奎莫特、利巴韋林、次黃苷5'-單磷酸脫氫酶 抑制劑、金剛烷胺或金剛乙胺。更通常地，它可以是病毒蛋白酶抑制劑。
[0070] 當(dāng)所述病毒是HCV病毒時(shí)，抗病毒劑可以是HCV金屬蛋白酶、HCV絲氨酸蛋白酶、 HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV進(jìn)入、HCV組裝、HCV排出或HCV NS5A蛋白的 抑制劑。
[0071] 在優(yōu)選情況下，干擾素是干擾素Y，例如PEG化的干擾素Y。在另一種優(yōu)選情況 下，干擾素是干擾素a，例如PEG化的干擾素a。在特定實(shí)施方式中，治療包括利巴韋林和 干擾素Y或a，優(yōu)選地PEG化的干擾素Y或a。
[0072] 變化
[0073] 變化可以在IL22RA2DNA、RNA或多肽的水平上確定。任選地，通過對IL22RA2基 因座的全部或一部分進(jìn)行測序，或者通過對IL22RA2基因座的全部或一部分進(jìn)行選擇性雜 交或擴(kuò)增，來進(jìn)行檢測。更優(yōu)選地，在變化鑒定步驟之前進(jìn)行IL22RA2基因座特異性擴(kuò)增。 IL22RA2基因座中的變化可以是基因座的編碼和/或非編碼區(qū)中的任何形式的突變、缺失、 重排和/或插入，其可以單獨(dú)地或以各種組合出現(xiàn)。更具體來說，突變包括點(diǎn)突變。缺失可 以涵蓋基因座的編碼或非編碼區(qū)中具有兩個(gè)或更多個(gè)殘基的任何區(qū)域，例如從2個(gè)殘基直 至整個(gè)基因或基因座。典型的缺失影響較小的區(qū)域，例如少于約50個(gè)連續(xù)堿基對的結(jié)構(gòu)域 (內(nèi)含子）或重復(fù)序列或片段，盡管較大的缺失也可能發(fā)生。插入可以涵蓋在基因座的編碼 或非編碼部分中添加一個(gè)或幾個(gè)殘基。插入通?？梢园诨蜃刑砑?至50個(gè)堿基 對。重排包括序列的倒置。IL22RA2基因座變化可以導(dǎo)致產(chǎn)生終止密碼子、移碼突變、氨基 酸替換、特定RNA拼接或加工、產(chǎn)物不穩(wěn)定性、產(chǎn)生截短的多肽等。變化可能導(dǎo)致產(chǎn)生具有 改變的功能、穩(wěn)定性、靶向或結(jié)構(gòu)的IL22RA2多肽。變化還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)的降低或所 述生產(chǎn)的增加。
[0074] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述變化是一個(gè)或多個(gè)堿基的突變、插入或缺失。在本發(fā)明方 法的特定實(shí)施方式中，IL22RA2基因座中的變化選自IL22RA2基因或相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物中的 點(diǎn)突變、缺失和插入，更優(yōu)選地為點(diǎn)突變和缺失。變化可以在IL22RA2DNA、RNA或多肽的水 平上確定。
[0075] 在最優(yōu)選實(shí)施方式中，方法包括對IL22RA2基因進(jìn)行基因分型，以確定在表IA中 指明的位置中的任意處SNP的存在。
[0076] 表IA :IL22RA2基因座中與纖維變性相關(guān)的SNP

【權(quán)利要求】
1. 對象中發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECMP)的異常沉積的易感性檢測或診斷和/或預(yù)后的 體外方法，所述方法包括檢測所述對象的生物樣品中IL22RA2基因座中變化的存在。
2. 權(quán)利要求1的方法，其用于纖維變性的易感性檢測或診斷和/或預(yù)后。
3. 權(quán)利要求2的方法，其用于評估纖維變性的進(jìn)展。
4. 權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中所述變化位于IL22RA2基因的起始密碼子上游 的500kb之內(nèi)，優(yōu)選地lOOkb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)，更優(yōu)選地10kb之內(nèi)，并位于IL22RA2 基因的3' UTR下游的500kb之內(nèi)，優(yōu)選地lOOkb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)，更優(yōu)選地10kb之 內(nèi)。
5. 權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述變化是一個(gè)或多個(gè)堿基的突變、插入或缺 失。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述變化是一個(gè)或數(shù)個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述SNP選自rs6570136、rs7774663、rslll54915和 rs2064501。
8. 權(quán)利要求7的方法，其包括對對象的生物樣品中IL22RA2基因座中的SNP進(jìn)行基因 分型，其中在SNP rs6570136中存在基因型GG，在SNP rs7774663中存在基因型TT，在SNP rslll54915中存在基因型TT、CT和/或在SNP rs2064501中存在基因型CC，指示了在所述 對象中發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECMP)的異常沉積或纖維變性的風(fēng)險(xiǎn)，或指示了細(xì)胞外基質(zhì)蛋 白（ECMP)的異常沉積或纖維變性的發(fā)生，或指示了纖維變性的不良預(yù)后。
9. 權(quán)利要求2至8任一項(xiàng)的方法，其中所述纖維變性發(fā)生在選自肝纖維變性、肝硬化、 皮膚瘢痕瘤、增生性瘢痕、硬皮病和肥胖癥的人類纖維變性疾病中。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述肝纖維變性由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、日本血 吸蟲或曼森氏血吸蟲感染引起。
11. 權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的方法，其中所述IL22RA2基因座中變化的存在，通過測 序、選擇性雜交和/或選擇性擴(kuò)增來檢測。
12. 權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)的方法，其中SNP的存在通過限制性酶消化來檢測，檢測到 至少一個(gè)所述SNP是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECMP)的異常沉積或纖維變性的指示。
13. -種為對象選擇治療性化合物的方法，所述對象患有或易于發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 (ECMP)的異常沉積或纖維變性，所述方法包括將測試化合物與IL22RA2多肽或基因或其片 段相接觸，并確定所述測試化合物提高或降低與IL22RA2基因座相關(guān)的途徑的生物活性或 功能的能力。
14. 一種用于確定患有病毒感染的患者對使用抗病毒劑和/或干擾素的治療做出響 應(yīng)的可能性的體外方法，所述方法包括確定所述患者的生物樣品中IL22RA2基因座中、或 IL22RA2表達(dá)或IL22RA2蛋白活性中的變化。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述變化位于IL22RA2基因的起始密碼子上游的500kb 之內(nèi)，優(yōu)選地lOOkb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)，更優(yōu)選地10kb之內(nèi)，并位于IL22RA2基因的 3' UTR下游的500kb之內(nèi)，優(yōu)選地lOOkb之內(nèi)，優(yōu)選地20kb之內(nèi)，更優(yōu)選地10kb之內(nèi)。
16. 權(quán)利要求14或15任一項(xiàng)的方法，其中所述變化是一個(gè)或多個(gè)堿基的突變、插入或 缺失。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述變化是一個(gè)或數(shù)個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP)。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述SNP選自rslll54915、rs6570136、rs2064501和 rsl543509〇
19. 權(quán)利要求19的方法，其包括對對象的生物樣品中IL22RA2基因座中的SNP進(jìn)行基 因分型，其中對于SNP rslll54915來說TT基因型、對于SNP rs6570136來說AG或GG基因 型、對于SNP rs2064501來說CT基因型和/或?qū)τ赟NP rsl543509來說AA基因型的存在， 有利于患者對所述治療的陽性響應(yīng)。
20. 權(quán)利要求14至19任一項(xiàng)的方法，其中所述治療包含抗病毒劑并任選地連同干擾 素。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述抗病毒劑是病毒復(fù)制的抑制劑。
22. 權(quán)利要求20的方法，其中所述抗病毒劑是利巴韋林。
23. 權(quán)利要求20的方法，其中所述抗病毒劑是病毒蛋白酶抑制劑。
24. 權(quán)利要求14至23任一項(xiàng)的方法，其中所述干擾素是干擾素 γ。
25. 權(quán)利要求14至23任一項(xiàng)的方法，其中所述干擾素是干擾素 α。
26. 權(quán)利要求24或25的方法，其中所述干擾素是PEG化的干擾素 γ或PEG化的干擾 素 α。
27. 權(quán)利要求14至26任一項(xiàng)的方法，其中所述治療包含利巴韋林和干擾素 γ或干擾 素 α，優(yōu)選PEG化的干擾素 γ或PEG化的干擾素 α。
28. 權(quán)利要求14至27任一項(xiàng)的方法，其中所述患者被選自下列的病毒感染：沙粒病 毒科(例如拉沙病毒)，冠狀病毒科(例如嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒)，黃病毒科(例如丙肝病 毒，登革病毒，西尼羅病毒，黃熱病病毒，蜱傳腦炎病毒)，纖絲病毒科(例如埃博拉病毒，馬 爾堡病毒)，皰疫病毒科(例如單純性皰疫病毒，巨細(xì)胞病毒，Epstein-Barr病毒，水痘帶狀 皰疹病毒)，正粘病毒科(例如流感病毒A和B)，副粘病毒科(例如呼吸道合胞體病毒，副流 感病毒，PMV，麻疹病毒)，痘病毒科(例如痘苗病毒，天花病毒)，彈狀病毒科(例如水皰性口 炎病毒，病毒性出血性敗血癥病毒，狂犬病病毒)，反轉(zhuǎn)錄病毒科(例如HIV和其他反轉(zhuǎn)錄病 毒)，披膜病毒科(例如基孔肯亞病毒，辛德畢斯病毒，西門利克森林病毒，羅斯河病毒，東部 馬腦炎病毒)。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述病毒是丙肝病毒。
30. 權(quán)利要求28的方法，其中所述病毒是乙肝病毒。
31. 權(quán)利要求14至30任一項(xiàng)的方法，其中所述IL22RA2基因座中變化的存在，通過測 序、選擇性雜交和/或選擇性擴(kuò)增來檢測。
32. 權(quán)利要求14至30任一項(xiàng)的方法，其中SNP的存在通過限制性酶消化來檢測，檢測 到至少一個(gè)所述SNP是纖維變性的指示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104302780SQ201280047401
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月5日
【發(fā)明者】阿萊恩·德賽因, 馬蒂厄·塞爾托里奧, 勞倫特·阿爾吉羅 申請人:艾克斯-馬賽大學(xué), 法國國家衛(wèi)生及研究醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)