改良型腈水合酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供催化活性提高了的改良型腈水合酶，并且提供編碼該改良型腈水合酶的DNA、包含該DNA的重組載體、包含該重組載體的轉(zhuǎn)化體、從該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提取的腈水合酶及其制造方法。還提供使用了該培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物的酰胺化合物的制造方法。一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為β亞基中包含序列號50(GX1X2X3X4DX5X6R)所示的氨基酸序列的腈水合酶；X4為選自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸所組成的組的氨基酸。
【專利說明】改良型腈水合酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及改良型(變異型)腈水合酶及其制造方法。進而涉及編碼該酶的基因DNA、包含該基因DNA的重組載體、和具有該重組載體的轉(zhuǎn)化體以及酰胺化合物的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年發(fā)現(xiàn)了酶腈水合酶、即具有將腈基水合并轉(zhuǎn)換為酰胺基的腈水合活性的酶，公開了使用該酶或含有該酶的微生物菌體等通過腈化合物而制造對應的酰胺化合物的方法。已知該制造方法與現(xiàn)有的化學合成法相比較，由腈化合物向?qū)孽０坊衔锏霓D(zhuǎn)化率和選擇率高。
[0003]作為生產(chǎn)腈水合酶的微生物，可列舉出例如:屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous) Jl株用于丙烯酰胺的工業(yè)生產(chǎn)中，其有用性已被證實。另外，編碼該菌株所產(chǎn)生的腈水合酶的基因也已明確(參照專利文獻I)。
[0004]另一方面，不僅利用由自然界中存在的微生物分離的腈水合酶、其基因，還出于改變腈水合酶的活性、底物特異性、Vmax、Km、熱穩(wěn)定性、對底物的穩(wěn)定性、對生成物的穩(wěn)定性等目的，嘗試了向腈水合酶中導入變異；嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶中，由立體結(jié)構(gòu)信息預測與底物特異性、熱穩(wěn)定性相關(guān)的區(qū)域，從中取得底物特異性變化了的變異酶(參照專利文獻2~4)。另外，本發(fā)明人等得到耐熱性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(參照專利文獻5~9)。
[0005]在利用酶法工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺方面，從催化劑成本等生產(chǎn)成本的觀點等出發(fā)，開發(fā)催化活性提高的腈水合酶是非 常有用的；從反應時的酶量的削減和成本削減等觀點出發(fā)，尤其期望開發(fā)而獲得活性提高了的酶。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本專利第3162091號公報
[0009]專利文獻2:國際公開第2004/056990號小冊子
[0010]專利文獻3:日本特開2004-194588號公報
[0011]專利文獻4:日本特開2005-16403號公報
[0012]專利文獻5:國際公開第2005/116206號小冊子
[0013]專利文獻6:日本特開2007-143409號公報
[0014]專利文獻7:日本特開2007-43910號公報
[0015]專利文獻8:日本特開2008-253182號公報
[0016]專利文獻9:日本特開2010-172295號公報
【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]發(fā)明要解決的問題
[0018]因此，本發(fā)明的目的在于，通過腈水合酶的改良提供催化活性提高了的改良型腈水合酶。另外，本發(fā)明的目的在于提供編碼該改良型腈水合酶的DNA、包含該DNA的重組載體、包含該重組載體的轉(zhuǎn)化體、從該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提取的腈水合酶及其制造方法。進一步，本發(fā)明的目的在于提供使用了該培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物的酰胺化合物的制造方法。
[0019]用于解決問題的方案
[0020]本發(fā)明人等為了解決上述問題進行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中將特定的氨基酸殘基置換為其他的氨基酸殘基而成的蛋白質(zhì)不僅具有腈水合酶活性，催化活性也提高了 ；至此完成本發(fā)明。
[0021]即，本發(fā)明如下。
[0022](I) 一種改良型腈水合酶，其具有選自下述(a)~(e)中的至少一種特征。
[0023](a) 一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為β亞基中包含序列號50所示的氨基酸序列的腈水合酶；
[0024]GX1X2X3X4DX5X6R (序列號 50)
[0025]G表示甘氨酸，D表示天冬氨酸，R表示精氨酸，W X3> X5> X6分別獨立地表示任意的氨基酸殘基；
[0026]X4為選自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸所組成的組的氨基酸。
[0027](b) 一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為β亞基中包含序列號81所示的氨基酸序列的腈水合酶；
[0028]WEX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18D (序列號 81)
[0029]W表示色氨酸，E表示谷氨酸，D表示天冬氨酸，X1~X6和X8~X18表示分別獨立的任意的氨基酸殘基；
[0030]X7為選自由丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸所組成的組的氨基酸。
[0031](c) 一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號119所示的氨基酸序列的腈水合酶；
[0032]AX1X2X3X4GX5X6GX7X8 (序列號 119)
[0033]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，X1~X7表示分別獨立的任意的氨基酸殘基；
[0034]X8為選自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸所組成的組的氨基酸。
[0035](d) 一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號132所示的氨基酸序列的腈水合酶；χ7被置換為不同于野生型的氨基酸；
[0036]AX1X2X3X4GX5X6GX7Q (序列號 132)
[0037]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X6表示分別獨立的任意的氨
基酸殘基；[0038](e) 一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號136所示的氨基酸序列的腈水合酶；χ9被置換為不同于野生型的氨基酸；
[0039]AX1X2X3X4GX5X6GX7QX8X9 (序列號 136)
[0040]A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X8表示分別獨立的任意的氨
基酸殘基。
[0041](2)根據(jù)(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號50的X2 SS(絲氨酸)。
[0042](3)根據(jù)⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號50的X1為1(異亮氨酸)，X2為S (絲氨酸)，X3為W (色氨酸)，X5為(K賴氨酸)，X6為S (絲氨酸)。
[0043](4)根據(jù)(I)~(3)的任一項所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號50所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號51所示的氨基酸序列。
[0044](5)根據(jù)⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號81的X14SG(甘氨酸)。
[0045](6)根據(jù)(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號81的&為6(甘氨酸)，父2為1?(精氨酸)，&為1'(蘇氨酸)，X4SU亮氨酸)，&為s(絲氨酸)，&為1(異亮氨酸)，^為儀蘇氨酸)，X9SW(色氨酸)，Xltl為M(甲硫氨酸)，XnSH(組氨酸)，\2為L(亮氨酸)，X13為K(賴氨酸)，X14為G(甘氨酸)。
[0046](7)根據(jù)(I)、(5)和(6)的任一項所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號81所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號82所示的氨基酸序列。
[0047](8)根據(jù)(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號119的X1為M(甲硫氨酸)，x2Sa(丙氨酸)，x3S s(絲氨酸)，x4Sl(亮氨酸)，x5Sy(酪氨酸)，x6Sa(丙氨酸)，x7為E(谷氨酸)。
[0048](9)根據(jù)⑴或⑶所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號119所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號120所示的氨基酸序列。
[0049](10)根據(jù)(I)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號132所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ7為選自由半胱氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、酪氨酸所組成的組的氨基酸。
[0050](11)根據(jù)⑴或(10)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號132的&為Μ(甲硫氨酸)，X2SA(丙氨酸)，&為s(絲氨酸)，x4SL(亮氨酸)，&為Υ(酪氨酸)，χ6為Α(丙氨酸)。
[0051](12)根據(jù)(I)、(10)和(11)的任一項所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號132所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號131所示的氨基酸序列。
[0052](13)根據(jù)⑴所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號136所示的氨基酸序列的腈水合酶，X9為選自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、酪氨酸所組成的組的氨基酸。
[0053](14)根據(jù)⑴或(13)所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號136的&為Μ(甲硫氨酸)，X2SA(丙氨酸)，&為s(絲氨酸)，x4SL(亮氨酸)，&為Υ(酪氨酸)，χ6為Α(丙氨酸)，X7為Ε(谷氨酸)，X8為Α(丙氨酸)。
[0054](15)根據(jù)(I)、(13)和(14)的任一項所述的改良型腈水合酶，包含前述序列號136所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號135所示的氨基酸序列。
[0055](16)根據(jù)⑴~(15)的任一項所述的改良型腈水合酶，前述腈水合酶來源于紅球菌屬細菌或諾卡氏菌屬細菌。
[0056](17) 一種DNA，其編碼⑴~(16)的任一項所述的改良型腈水合酶。
[0057](18) 一種DNA，其與(17)所述的DNA在嚴格的條件下雜交。
[0058](19) 一種重組載體，其包含(17)或(18)所述的DNA。
[0059](20) 一種轉(zhuǎn)化體，其包含(19)所述的重組載體。
[0060](21) 一種腈水合酶，為從培養(yǎng)(20)所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中提取的。
[0061](22) 一種腈水合酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)(20)所述的轉(zhuǎn)化體，由得到的培養(yǎng)物提取腈水合酶。
[0062](23) 一種酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使(I)~(16)的任一項所述的改良型腈水合酶或培養(yǎng)(20)所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物或者該培養(yǎng)物的處理物與腈化合物接觸。
_3] 發(fā)明的效果
[0064]本發(fā)明能夠提供催化活性提高了的、新型的改良型(變異型)腈水合酶。催化活性提高的改良型腈水合酶在酰胺化合物的制造上是非常有用的。
[0065]本發(fā)明進一步能夠提供編碼上述改良型腈水合酶的基因DNA、包含該基因DNA的重組載體、包含該重組載體的轉(zhuǎn)化體、從該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中提取的腈水合酶及其制造、以及使用了前述蛋白質(zhì)(改良型腈水合酶)或者使用了該培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物的酰胺化合物的 制造方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0066]圖1為質(zhì)粒pSJ034的結(jié)構(gòu)圖。
[0067]圖2-1為表示已知的腈水合酶的β亞基的比對結(jié)果的圖。
[0068]圖2-2為表示已知的腈水合酶的β亞基的比對結(jié)果的圖。
[0069]圖3為序列號51所示的、本發(fā)明的β亞基的氨基酸序列。
[0070]圖4為表示SDS-PAGE的結(jié)果的照片。
[0071]圖5為質(zhì)粒pER855A的結(jié)構(gòu)圖。
[0072]圖6-1為表示來源于各種微生物的野生型腈水合酶的β亞基的氨基酸序列(N末端側(cè)的一部分)的圖。
[0073]圖6-2為表示與圖6-1相同的氨基酸序列的圖，表示接著圖6-1的氨基酸序列的序列(C末端側(cè)的一部分)。
[0074]圖7為序列號82所示的、本發(fā)明的β亞基的氨基酸序列。
[0075]圖8-1為表示來源于各種微生物的腈水合酶的α亞基的氨基酸序列(N末端側(cè)的一部分)的圖。
[0076]圖8-2為表示與圖8-1相同的氨基酸序列的圖，表示接著圖8-1的氨基酸序列的序列。
[0077]圖9為序列號121所示的、本發(fā)明的α亞基的氨基酸序列。
[0078]圖10-1為表示來源于各種微生物的腈水合酶的α亞基的氨基酸序列(N末端側(cè)的一部分)的圖。
[0079]圖10-2為表示與圖2-1相同的氨基酸序列的圖，表示接著圖10-1的氨基酸序列的序列。
[0080]圖11為序列號131所示的、本發(fā)明的α亞基的氨基酸序列。
[0081]圖12-1為表示來源于各種微生物的腈水合酶的α亞基的氨基酸序列(N末端側(cè)的一部分)的圖。
[0082]圖12-2為表示與圖12-1相同的氨基酸序列的圖，表示接著圖12_1的氨基酸序列的序列。
[0083]圖13為序列號135所示的、本發(fā)明的α亞基的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0084]以下，詳細地說明本發(fā)明。
[0085]1.腈水合酶
[0086](a)已知的腈水合酶
[0087]本發(fā)明的改良型腈水合酶為已知的腈水合酶的改良型，對于其來源沒有特別地限定。只要是例如:美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI !National Center for BiotechnologyInformation)所提供的 Gen Bank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/entrez/query,fcgi ? CMD = search & DB = protein)中登錄的腈水合酶或公知文獻中記載的腈水合酶，就可以參考。可以例示例如專利文獻5~9(通過進行參照而引入本說明書中)所述的腈水合酶。專利文獻5~9的腈水合酶具有耐熱性、丙烯酰胺耐性，可以通過施加本發(fā)明的氨基酸置換而附加催化活性提高的性質(zhì)。具體而言，可列舉出具有序列號53~57的氨基酸序列的腈水合酶。
[0088]另外，對于編碼 上述氨基酸序列的基因，使用公知的方法導入變異，通過對具有所希望的性能的變異酶進行評價/選拔，能夠得到性能進一步提高的改良酶。具體而言，可列舉出具有序列號58~61的氨基酸序列的腈水合酶。
[0089]“腈水合酶”采取由α亞基和β亞基的結(jié)構(gòu)域締合而成的高級結(jié)構(gòu)，具有非血紅素鐵原子或非咕啉核鈷原子作為輔基。這些腈水合酶分別以鐵型腈水合酶和鈷型腈水合酶的稱呼加以區(qū)分。
[0090]作為鐵型腈水合酶，可列舉出來源于紅球菌屬Ν-771株的腈水合酶作為其代表例。通過進行X射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析，該鐵型腈水合酶的立體結(jié)構(gòu)變得明確。結(jié)果，該酶介由形成活性中心的α亞基的半胱氨酸簇(Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys)(序列號48)中的4個氨基酸殘基而與非血紅素鐵結(jié)合。
[0091]作為鈷型腈水合酶，可列舉出來源于玫瑰色紅球菌Jl株(以下有時稱為“J1菌”)的鈷型腈水合酶，或來源于嗜熱假諾卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的鈷型腈水合酶作為代表例。
[0092]來源于Jl菌的鈷型腈水合酶介由形成活性中心的α亞基的半胱氨酸簇(Cys-Thr-Leu-Cys-Ser-Cys)(序列號49)所示的區(qū)域而與鈷原子結(jié)合。需要說明的是，來源于嗜熱假諾卡氏菌的鈷型腈水合酶的半胱氨酸簇中，上述來源于Jl菌的半胱氨酸簇中的上游側(cè)(N末端側(cè))起第4位的半胱氨酸(Cys)為半胱亞磺酸(Csi),最下游側(cè)(C末端側(cè))的第6位的半胱氨酸(Cys)為半胱次磺酸(Cse)。
[0093]如上所述，輔基與α亞基中的半胱氨酸簇“C(S/T)LCSC”(序列號48、49)所示的區(qū)域結(jié)合。作為包含這樣的輔基結(jié)合區(qū)域的腈水合酶，可列舉出例如:具有來源于玫瑰色紅球菌 Jl (FERM BP-1478)、玫瑰色紅球菌M8 (SU1731814)、玫瑰色紅球菌M33 (VKM Ac_1515D)、玫瑰色紅球菌ATCC39484(日本特開2001-292772)、史密斯芽孢桿菌(Bacillus smithii)(日本特開平9-248188)、嗜熱假諾卡氏菌(日本特開平9-275978)或熱葡糖苷地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的氨基酸序列的腈水合酶以及來源于上述菌的基因序列所編碼的腈水合酶。
[0094]另一方面,認為β亞基的功能涉及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。
[0095]例如:來源于玫瑰色紅球菌Jl (FERM ΒΡ-1478)的α亞基的氨基酸序列如序列號4所不、喊基序列如序列號3所不。另外，β亞基的氣基酸序列如序列號2所不、喊基序列如序列號I所示、登錄號為“Ρ21220”。另外，來源于玫瑰色紅球菌M8(SU1731814)的α亞基的登錄號為“ΑΤΤ79340”，β亞基的登錄號為“ΑΑΤ79339”。來源于嗜吡啶紅球菌(Rhodococcus pyridinovorans)MW3的腈水合酶基因的登錄號為AJ582605、來源于嗜吡唳紅球菌S85-2的臆水合酶基因的登錄號為AJ582605、赤紅球菌RH (Rhodococcus ruber RH)(CGMCC N0.2380)的腈水合酶基因記載于CN101463358。進而，來源于諾卡氏菌.YS-2002的腈水合酶基因的登錄號為“X86737”，來源于諾卡氏菌屬JBRs的腈水合酶基因的登錄號為“AY141130”。
[0096](b-Ι)改良型腈水合酶(β 48)
[0097]將來源于各種微生物的已知的腈水合酶的β亞基的氨基酸(單字符號)序列的比對不于圖2_1和圖2_2中。需要說明的是，在圖2_1、2_2中，各氨基酸序列從上方起依次表不序列號2、5~12和42~47。
[0098]進而，本發(fā)明的改良型腈水合酶中還包括在除了序列號50所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸序列中缺失、置換和/或附加有I個或數(shù)個(例如I個~10個左右，優(yōu)選為I個~5個左右)的氨基酸殘基的改良型腈水合酶。
[0099]作為本發(fā)明的改良型 腈水合酶的一例，可列舉出:如圖3所示，β亞基具有序列號51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此處，從N末端開始數(shù)第44位~第52位存在有序列號50所示的氨基酸序列。
[0100]實施方式之一中，在具有序列號51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1^X2、X3、X5、X6分別獨立地表示任意的氨基酸殘基，X4為選自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸所組成的組的氨基酸。
[0101]另外，在其他的實施方式中，在具有序列號51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，XpXyXpX6分別獨立地表示任意的氨基酸殘基，X2為s(絲氨酸)，x4為選自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸所組成的組的氨基酸。
[0102]進一步，其他的實施方式中，具有序列號51所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1為I (異亮氨酸)，X2為S (絲氨酸)，X3為W (色氨酸)，X5為K (賴氨酸)，X6為S (絲氨酸)，χ4為選自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸所組成的組的氨基酸。
[0103]作為本發(fā)明的改良型腈水合酶的其他例，可列舉出:在序列號2所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，β亞基的第48位的氨基酸殘基(色氨酸)置換為半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸或蘇氨酸而成的腈水合酶。
[0104]作為這樣的氨基酸置換形式的標記例，可列舉出WP 48C、W0 48D、W0 48E、W0 48Η、 481, we 48K、we 48M、WP 48N、WP 48P、WP 48Q、WP 48S、WP 48T。需要說明的是，氨基
酸的字母標記可以用通常的單字表示，在表示置換位置為止的氨基酸殘基數(shù)的數(shù)字(例如“48”)的左側(cè)所表示的字母表示置換前的氨基酸的單字符號；右側(cè)所表示的字母表示置換后的氨基酸的單字符號。
[0105]具體而言，關(guān)于序列號2所表示的β亞基的氨基酸序列，標記為“Wi3 48C”的情況下，意味著β亞基的氨基酸序列(序列號2)中由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)(包含該N末端的氨基酸殘基數(shù)起)第48位的色氨酸(W)置換為半胱氨酸(C)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置換形式。
[0106]本發(fā)明的更優(yōu)選的改良型腈水合酶中的氨基酸置換形式可以分別用以下的I~12的標記表示。
[0107]1.W β 48C
[0108]2.ff^48D
[0109]3.ff^48E
[0110]4.W β 48Η
[0111]5.481
[0112]6.ff^48K
[0113]7.ff^48M
[0114]8.ff^48N
[0115]9.ff^48P
[0116]10.ff^48Q
[0117]11.W β 48S
[0118]12.ff^48T
[0119]作為用于產(chǎn)生上述氨基酸置換的堿基置換，優(yōu)選可列舉出以下的方式。
[0120]Wi348C:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為TGC(TGG — TGC)。
[0121]Wi348D:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為GAC (TGG — GAC)。
[0122]Wi348E:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為GAG(TGG — GAG)。
[0123]Wi348F:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為TTC (TGG — TTC)。
[0124]Wi348H:優(yōu)選將堿 基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為CAC (TGG — CAC)。
[0125]481:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為ATC (TGG — ATC)。[0126]Wi348K:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為AAG (TGG — AAG)。
[0127]Wi348M:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為ATG (TGG — ATG)。
[0128]Wi348N:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為AAC(TGG — AAC)。
[0129]Wi348P:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為CCG(TGG — CCG)。
[0130]Wi348Q:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為CAG(TGG — CAG)。
[0131]Wi348S:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為TCC(TGG — TCC)。
[0132]Wi348T:優(yōu)選將堿基序列TGG(位于序列號I中的第142~144位)置換為ACC(TGG — ACC)。
[0133](b-2)改良型腈水合酶(β 37)
[0134]將來源于各種微生物的已知的腈水合酶的β亞基的氨基酸(單字符號)序列的比對示于圖6-1和圖6-2中。需要說明的是，在圖6-1、6-2中，各氨基酸序列從上方起依次表不序列號2、5~12和42~49。
[0135]進而，本發(fā)明的改良型腈水合酶中還包括在除了序列號81所示的氨基酸序列以外的已知的腈水合酶的氨基酸 序列中缺失、置換和/或附加有I個或數(shù)個(例如I個~10個左右，優(yōu)選為I個~5個左右)的氨基酸殘基的改良型腈水合酶。
[0136]作為本發(fā)明的改良型腈水合酶的一例，可列舉出:如圖7所示，β亞基具有序列號82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶。此處，從N末端開始數(shù)第29位~第49位存在有序列號81所示的氨基酸序列。
[0137]實施方式之一中，在具有序列號82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1~X6和X8~X18表示分別獨立的任意的氨基酸殘基，X7為選自由丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸所組成的組的氨基酸。
[0138]另外，其他的實施方式中，在具有序列號82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X1~X6、X8~X13和X15~X18表示分別獨立的任意的氨基酸殘基，X14為G(甘氨酸)，X7為選自由丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸所組成的組的
氨基酸。
[0139]進一步，其他的實施方式中，在具有序列號82所示的氨基酸序列的改良型腈水合酶中，X15~X18表示分別獨立的任意的氨基酸殘基，X1為G(甘氨酸)，X2為R(精氨酸)，X3為T(蘇氨酸)，Χ4為L(亮氨酸)，X5為S(絲氨酸)，X6為I (異亮氨酸)，X8為T(蘇氨酸)，X9為W(色氨酸)，Xltl為M(甲硫氨酸)，X11為H(組氨酸)，X12為L(亮氨酸)，X13為K(賴氨酸)，X14為G(甘氨酸)，X7為選自由丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸所組成的組的氨基酸。
[0140]作為本發(fā)明的改良型腈水合酶的其他例，可列舉出:在序列號2所示的已知的腈水合酶的氨基酸序列中，β亞基的第37位的氨基酸殘基(亮氨酸)置換為丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸或甲硫氨酸而成的腈水合酶。
[0141]作為這樣的氨基酸置換形式的標記例，可列舉出:Li3 37A、L0 37D、L0 37F、L3 371、LP 37M、37T、37V。需要說明的是，氨基酸的字母標記可以用通常的單字表示，在表示置換位置為止的氨基酸殘基數(shù)的數(shù)字(例如“37”)的左側(cè)所表示的字母表示置換前的氨基酸的單字符號；右側(cè)所表示的字母表示置換后的氨基酸的單字符號。
[0142]具體而言，關(guān)于序列號2所表示的β亞基的氨基酸序列，標記為“Li3 37Α”的情況下，意味著β亞基的氨基酸序列(序列號2)中由N末端的氨基酸殘基開始數(shù)(包含該N末端的氨基酸殘基數(shù)起)第37位的亮氨酸(L)被置換為丙氨酸(A)而成的改良型腈水合酶的氨基酸置換形式。
[0143]本發(fā)明的更優(yōu)選的改良型腈水合酶中的氨基酸置換的形式可以分別用以下的I~7的標記表示。
[0144]1.37Α
[0145]2.L3 37D
[0146]3.L3 37F
[0147]4.L β 371
[0148]5.L3 37M
[0149]6.L3 37T
[0150]7.37V
[0151]作為用于產(chǎn)生上述 氨基酸置換的堿基置換，優(yōu)選可列舉出以下的表1所示的方式。
[0152][表 I]
[0153]
【權(quán)利要求】
1.一種改良型腈水合酶，其具有選自下述(a)~(e)中的至少一種特征: (a)一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為β亞基中包含序列號50所示的氨基酸序列的腈水合酶；
序列號 50 =GX1X2X3X4DX5X6R G表示甘氨酸，D表示天冬氨酸，R表示精氨酸，X1^ X2> X3、X5、X6分別獨立地表示任意的氣基酸殘基； X4為選自由半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸和蘇氨酸所組成的組的氨基酸； (b)一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為β亞基中包含序列號81所示的氨基酸序列的腈水合酶；
序列號 81 =WEX1X2X3X4X5X6X7X8X9XltlX11X12X13X14X15X16X17X18D W表不色氨酸，E表不谷氨酸，D表不天冬氨酸，X1~X6和X8~X18表不分別獨立的任意的氣基酸殘基； X7為選自由丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸所組成的組的氨基酸； (C) 一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號119所示的氨基酸序列的腈水合酶；
序列號 119 =AX1X2X3X4GX5X6GX7X8` A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，X1~X7表示分別獨立的任意的氨基酸殘基； X8為選自由丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸所組成的組的氨基酸； (d)一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號132所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ7被置換為不同于野生型的氨基酸；
序列號 132 =AX1X2X3X4GX5X6GX7Q A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X6表示分別獨立的任意的氨基酸殘基; (e)一種改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號136所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ9被置換為不同于野生型的氨基酸；
序列號 136 =AX1X2X3X4GX5X6GX7QX8X9 A表示丙氨酸，G表示甘氨酸，Q表示谷氨酰胺，X1~X8表示分別獨立的任意的氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號50的X2為S、即絲氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號50的X1為1、即異亮氨酸，X2為S、即絲氨酸，X3為W、即色氨酸，X5為K、即賴氨酸，X6為S、即絲氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列號50所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號51所示的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號81的X14SG、即甘氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號81的X1SG、即甘氨酸，X2為R、即精氨酸，X3為T、即蘇氨酸，X4為L、即亮氨酸，X5為S、即絲氨酸，X6為1、即異亮氨酸，X8為T、即蘇氨酸，X9為W、即色氨酸，X10為M、即甲硫氨酸，X11為H、即組氨酸，X12為L、即亮氨酸，X13為K、即賴氨酸，X14為G、即甘氨酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、5和6的任一項所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列號81所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號82所示的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號119的X1為1即甲硫氨酸，X2為A、即丙氨酸，X3為S、即絲氨酸，X4為L、即亮氨酸，X5為Y、即酪氨酸，X6為A、即丙氨酸，X7 SE、即谷氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列號119所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號120所示的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號132所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ7為選自由半胱氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、酪氨酸所組成的組的氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號132的X1為Μ、即甲硫氨酸，X2為Α、即丙氨酸，X3為S、即絲氨酸，X4為L、即亮氨酸，X5為Y、即酪氨酸，X6為Α、即丙氨酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1、10和11的任一項所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列號132所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號131所示的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改良型腈水合酶，其特征在于，其為α亞基中包含序列號136所示的氨基酸序列的腈水合酶；Χ9為選自由半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、酪氨酸所組成的組的氨基酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或13所述的改良型腈水合酶，其特征在于，序列號136的X1為Μ、即甲硫氨酸，X2為Α、即丙氨酸，X3為S、即絲氨酸，X4為L、即亮氨酸，X5為Y、即酪氨酸，X6為Α、即丙氨酸，X7為Ε、即谷氨酸，X8為Α、即丙氨酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、13和14的任一項所述的改良型腈水合酶，其中，包含所述序列號136所示的氨基酸序列的腈水合酶具有序列號135所示的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1~15的任一項所述的改良型腈水合酶，其中，所述腈水合酶來源于紅球菌屬(Rhodococcus)細菌或諾卡氏菌屬(nocardia)細菌。
17.—種DNA,其編碼權(quán)利要求1~16的任一項所述的改良型腈水合酶。
18.一種DNA，其與權(quán)利要求17所述的DNA在嚴格的條件下雜交。
19.一種重組載體，其包含權(quán)利要求17或18所述的DNA。
20.一種轉(zhuǎn)化體，其包含權(quán)利要求19所述的重組載體。
21.一種腈水合酶，是從培養(yǎng)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物中提取的。
22.—種腈水合酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)化體，由得到的培養(yǎng)物提取腈水合酶。
23.一種酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求1~16的任一項所述的改良型腈水合酶或培養(yǎng)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物或者該培養(yǎng)物的處理物與腈化合物接觸。
【文檔編號】C12N1/19GK103635574SQ201280028338
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月7日
【發(fā)明者】渡邊文昭, 原愛, 安保貴永, 北原彩 申請人:三菱麗陽株式會社