專利名稱：保持或提高腈水合酶活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保持或提高生產(chǎn)丙烯酰胺等工業(yè)中使用的腈水合酶的活性的方法。此處所說的‘活性’是用實施例中記載方法測定的腈水合活性。
背景技術(shù)：
腈水合酶的腈水合活性很不穩(wěn)定，很容易隨著時間延長而降低。作為防止這種腈水合酶的腈水合活性隨時間延長而降低、保持其活性的方法，現(xiàn)已公開了一種方法(例如，參照專利文獻1、專利文獻2)，即，在含有腈水合酶的微生物菌體或菌體處理物的懸濁液或溶液中，添加選自腈類、酰胺類、和有機酸或其鹽類中的至少一種化合物，作為穩(wěn)定劑。
另外，還公開了一種保存方法(例如，參照專利文獻3)，即，在將微生物菌體或菌體處理物懸濁于水性介質(zhì)中的狀態(tài)下，該水性介質(zhì)是中性乃至弱堿性且是100mM乃至飽和濃度的無機鹽類。然而，上述任何一種方法，僅僅具有只保持腈水合酶活性的效果，對于進一步提高腈水合酶活性的效果，至今還沒有任何報導(dǎo)。
特公平5-43351號公報[專利文獻2]特公平4-48435號公報[專利文獻3]特開平8-112089號公報另一方面，作為在利用培養(yǎng)而制造含有腈水合酶的微生物菌體后、通過對所得到的菌體或菌體處理物進行某種處理而提高腈水合活性的方法來說，例如公開了一種方法(例如，參照專利文獻4)，即，對所得到的具有腈水合酶活性的革蘭染色性呈陽性的微生物菌體照射光。然而，這種方法僅僅具有只提高利用培養(yǎng)得到的微生物菌體的腈水合酶活性的效果，卻不能提高腈水合酶活性一旦降低了的微生物菌體的活性。并且與保持腈水合酶活性無關(guān)。
特公平2-35號公報還有報導(dǎo)(例如，參照專利文獻5)，即，在培養(yǎng)含有腈水合酶的微生物菌體時，需要氧，并且將培養(yǎng)中的溶解氧濃度保持在1ppm至飽和濃度，就能提高菌體的繁殖，并且能獲得腈水合酶活性高的菌體。然而，該方法只報導(dǎo)了在培養(yǎng)時，即在含有腈水合酶的菌體增殖的條件下，在腈水合酶活性的表達中，培養(yǎng)液中的溶解氧濃度存在有最佳值，而對于含有腈水合酶菌體不增殖的條件，即培養(yǎng)結(jié)束以后的腈水合酶活性的保持及活性的提高，卻沒有任何記載。
特開2002-17339號公報雖然對腈水合酶的活性的表達以及活性的降低的詳細機理仍不清楚，但是，例如記載了(例如，參照非專利文獻1)源自紅球菌屬(Rhodococcus)sp.N-771的鐵型腈水合酶的腈水合活性的降低，是由于空氣中的氧，把與作為中心金屬的非血紅素鐵(III)配位的半胱胺次磺酸氧化成半胱胺亞磺酸的緣故。
或者，還記載了(例如，參照非專利文獻2)例如源自紅球菌屬(Rhodococcus)sp.N-771的鐵型腈水合酶，利用被稱為‘2-氰基-2-丙羥基過氧化物’的過氧化物，將作為中心金屬的三價鐵還原成二價鐵，并且，將半胱氨次磺酸氧化成半胱氨亞磺酸，由此，失去了活性。
或者，還記載了(例如，參照非專利文獻3)雖然還未確定源自紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1的中心金屬為鈷的腈水合酶的構(gòu)造，但可以預(yù)測其類似于鐵型腈水合酶。
M.Odaka，M.Tsujishima and I.EndoRIKENReview，No.41，p58～60(2001)[非專利文獻2]尾高雅文，辻村昌也，遠藤勲；有機化學(xué)反応の新展開，No.3，p17～20(2001)[非專利文獻3]P.K.Mascharak，Coordination Chemistry ReviewsNo.225，p201～214(2002)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種使含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物不僅在不伴有細胞增殖的條件下保持腈水合酶活性，而且也能提高一旦降低了的腈水合酶活性的方法。
本發(fā)明人等，為了達到上述目的，經(jīng)過深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物，在不伴有細胞增殖的條件下，通過與氧化劑的接觸，不僅能保持腈水合酶活性，而且，即使是腈水合酶活性一旦降低了的細胞或該細胞的處理物，通過使它們在反應(yīng)開始前或反應(yīng)過程中與氧化劑接觸，就能提高腈水合酶的活性。至此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供如下方法(1)一種保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，在不伴有細胞增殖的條件下，將含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物與氧化劑接觸。
(2)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，在結(jié)束培養(yǎng)后或停止培養(yǎng)后，在實質(zhì)上不伴有細胞增殖的條件下，將含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物與氧化劑接觸。
(3)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，使用標準電極電位相對于標準氫電極在0.1～2.1V范圍的氧化劑。
(4)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，氧化劑是選自氧、過氧化氫、鐵氰化鉀和過硫酸銨中的至少一種。
(5)根據(jù)(4)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，以含有氧的氣體的方式供給作為氧化劑的氧。
(6)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，氧化劑的濃度在1重量ppm～10重量％的范圍內(nèi)。
(7)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，與氧化劑接觸時的溫度是0～60℃。
(8)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，與氧化劑接觸時的pH值是5～10。
(9)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，腈水合酶是分子內(nèi)含有鈷的腈水合酶。
(10)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，在不伴有細胞增殖的條件下，將利用基因轉(zhuǎn)換在分子內(nèi)表達有含鈷腈水合酶的細胞或該細胞的處理物，與氧化劑接觸。
(11)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，細胞是含有腈水合酶的微生物菌體或該微生物菌體的處理物。
(12)根據(jù)(11)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，微生物菌體是基因轉(zhuǎn)換微生物。
(13)根據(jù)(12)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，基因轉(zhuǎn)換微生物是基因轉(zhuǎn)換大腸菌。
(14)根據(jù)(13)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，基因轉(zhuǎn)換大腸菌的宿主是源自Escherichia coli K-12的W3110株(ATCC27325)、HB101株(ATCC33694)、JM109株(ATCC53223)或WA802株(ATCC33526)。
(15)根據(jù)(1)所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其中，含有腈水合酶的細胞或該細胞處理物用于由腈化合物制造酰胺化合物的方法中。
(16)一種使用含有利用(1)～(15)中任一項所述的方法獲得的腈水合酶的細胞或該細胞處理物由腈化合物制造酰胺化合物的方法。
具體實施例方式
以下對本發(fā)明作詳細說明本發(fā)明中所說的‘腈水合酶’是指具有將腈化合物的腈基進行水合從而生成對應(yīng)的酰胺化合物的能力的酶。本發(fā)明中所說的‘細胞’可以是微生物、植物細胞、動物細胞中的任何一種。作為含有腈水合酶的微生物來說，只要是能產(chǎn)生出將腈化合物的腈基進行水合從而生成對應(yīng)的酰胺化合物的能力的微生物就可以，沒有特殊限制。作為具體例來說，可以舉出嗜熱類諾卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)JCM3095、Achromobacter xerosis IFO12668、紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1等。
并且也包括在任意宿主中表達有從該微生物克隆的腈水合酶基因的轉(zhuǎn)化物質(zhì)。作為在此所說的任意宿主來說，除了大腸菌(Escherichiacoli)外，還有枯草菌(Bacillus subtilis)等桿菌屬細菌、酵母和放線菌、絲狀菌等。作為基因轉(zhuǎn)換大腸菌的宿主來說，例如可以舉出源自Escherichia coli K-12的W3110株(ATCC27325)、HB101株(ATCC33694)、JM109株(ATCC53223)、WA802株(ATCC33526)。作為這種菌株的具體例，可以舉出MT-10822(本菌株，以保藏號FERMBP-5785，1996年2月7日保藏于日本國通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)中，茨城縣筑波市東1丁目1番3號(茨城県つくば巿東1丁目1番3號)，是基于專利程序上微生物保藏國際承認的布達佩斯條約進行保藏的)。
另外，通過使用轉(zhuǎn)換DNA技術(shù)利用其它的氨基酸置換、缺失、削除或插入該酶的1個或2個以上的結(jié)構(gòu)氨基酸、表達有進一步提高耐藥性、耐溫度性等的變異型腈水合酶的轉(zhuǎn)化物質(zhì)也包括在本發(fā)明的微生物中。
本發(fā)明的微生物通常利用在分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、基因工程學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的一般方法進行調(diào)制。例如，將該微生物植入到LB培養(yǎng)基或M9培養(yǎng)基等通常液體培養(yǎng)基后，在適當?shù)呐囵B(yǎng)溫度(一般來說是20～50℃，但在嗜熱菌的情況下可以是50℃以上)下進行繁殖，接著，利用離心分離等從培養(yǎng)液中分離出該微生物。
本發(fā)明中的細胞處理物是指上述菌體的提取物或磨碎物、將該提取物或磨碎物的腈水合酶活性部分進行分離精制所得到的后分離物、使用適當?shù)妮d體對該細胞或該細胞的提取物、磨碎物、后分離物進行固定的固定化物等，只要是它們具有腈水合酶活性，就是相當于本發(fā)明的細胞處理物。它們當中，既可以單獨使用一種，也可將2種以上不同形態(tài)的同時或交互使用。
作為本發(fā)明中的細胞不增殖的條件來說，例如可以舉出將該細胞或該細胞的處理物溶解或懸濁在水、生理食鹽水、或者以適當濃度溶解了磷酸鹽等緩沖劑、硫酸鹽或碳酸鹽等無機鹽、堿金屬的氫氧化物、酰胺化合物等的水溶液等中的條件。還可以舉出使用該細胞或該細胞處理物由腈化合物制造酰胺化合物時的反應(yīng)液。或者，也包括在利用培養(yǎng)來繁殖該微生物時微生物增殖中的靜止期以后或停止培養(yǎng)的培養(yǎng)液?；蛘哌€包括利用藥劑或加熱進行殺菌的培養(yǎng)液。
本發(fā)明中使用的氧化劑，是相對于標準氫電極，標準電極電位處于0.1～2.1V范圍的有機物質(zhì)和無機物質(zhì)。由于小于0.1V的物質(zhì)，作為氧化劑的能力很弱，所以缺乏保持腈水合酶活性及活性化的效果。另外，在大于2.1V的物質(zhì)的情況下，由于作為氧化劑的能力過強，所以腈水合酶會發(fā)生很大的變質(zhì)，反而降低了腈水合酶的活性，不可取。作為這樣的物質(zhì)的例子來說，在《化學(xué)便覧》(日本化學(xué)會編)中記載有一系列物質(zhì)，可以使用其中的1種物質(zhì)，也可以同時或交互使用2種以上的物質(zhì)。例如，可以舉出氧、過氧化氧、鐵氰化鉀、過流酸鹽、過錳酸鹽、過碘酸鹽、過氯酸及過氯酸鹽、硝酸及硝酸鹽、鈰(IV)鹽等。優(yōu)選為，使用氧、過氧化氫、鐵氰化鉀、過流酸銨作為氧化劑。更優(yōu)選為純氧或者以空氣的方式供給氧。
本發(fā)明中使用的氧化劑，可以一次性地與該細胞或該細胞的處理物接觸，也可逐次地接觸。
在與作為氧化劑的氧接觸的情況下，可供給含有氧的氣體。供給源可以供給空氣、純氧、以一定比率混合了空氣和氮或其他氣體的氣體、以一定比率混合了氧和氮或其他氣體的氣體中的任一種。在此所說的‘其他氣體’，可以使用氮、氬、氦等1種，也可以混合2種以上的氣體來使用，只要是不阻礙反應(yīng)的氣體就可以，沒有特殊限制。例如，在攪拌槽內(nèi)將細胞或該細胞的處理物懸濁在水性介質(zhì)中的情況下，將氣體供給至攪拌槽的氣相部，通過邊凈化邊攪拌，可以使氧溶解并進行供給?；蛘?，也可以使氣體進行噴霧分散而使氣體擴散、進一步通過攪拌增加氣液接觸面積從而進行供給。就此處供給的氣體來說，為了防止雜菌混入懸濁液中產(chǎn)生腐敗，優(yōu)選用除菌過濾器進行除菌之后再進行供給。
在本發(fā)明中，可以將該細胞或該細胞的處理物直接與氧化劑接觸，但通常是以懸濁在水性介質(zhì)中的狀態(tài)與氧化劑接觸。此處所說的‘水性介質(zhì)’，是含水的介質(zhì)，表示生理食鹽水、或者以適當濃度溶解了磷酸鹽等緩沖劑、硫酸鹽或碳酸鹽等無機鹽、堿金屬的氫氧化物、酰胺化合物等的水溶液、或者由腈化合物制造酰胺化合物時的反應(yīng)液、以及靜止期以后的培養(yǎng)液等。
對于該細胞或該細胞的處理物在水性介質(zhì)中懸濁時的濃度，沒有特殊限制，但通常可以是，按換算成該細胞干燥重量計，相對于該水性介質(zhì)，為0.1～30重量％的范圍。
在本發(fā)明中，使氧化劑與含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物接觸時的氧化劑濃度，只要是能保持或提高腈水合酶活性的濃度就可以，沒有特殊限制，通常相對于該水性介質(zhì)，優(yōu)選為1重量ppm～10重量％。
本發(fā)明中的含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物與氧化劑的接觸溫度，通常為0～60℃，優(yōu)選為0～50℃，更優(yōu)選為5～40℃。并且接觸時的pH值，通常為5～10。優(yōu)選為pH值為5～9，更優(yōu)選為6～8。
根據(jù)本發(fā)明，對于含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物，在不伴有細胞增殖的條件下，通過與氧化劑的接觸，不僅能保持腈水合酶活性，而且，即使是腈水合酶活性一旦降低了的細胞或該細胞的處理物，通過使它們在反應(yīng)開始前或反應(yīng)過程中與氧化劑接觸，就能提高腈水合酶的活性。因此，含有腈水合酶的細胞或該細胞處理物與這些氧化劑的接觸，可在腈水合反應(yīng)結(jié)束以前的任意時刻進行。
即，可以在將該菌體或菌體處理物供至反應(yīng)中之前與氧化劑進行接觸，或者也可以將該菌體或菌體處理物供至反應(yīng)中之后，也將氧化劑供至反應(yīng)中，使該菌體或菌體處理物與氧化劑進行接觸。然而，將氧化劑供至反應(yīng)中時，會有與腈化合物的水合反應(yīng)不同的副反應(yīng)、例如腈化合物為(甲基)丙烯腈時、腈化合物本身或者作為對應(yīng)的生成物的(甲基)丙烯酰胺進行聚合的可能性等，因此，優(yōu)選在將該菌體或菌體處理物供至反應(yīng)中之前與氧化劑進行接觸。
將培養(yǎng)結(jié)束了的微生物菌體或菌體處理物與氧化劑進行接觸、提高基于腈水合酶的腈水合活性后，可將該菌體或菌體處理物直接地供至反應(yīng)中，但根據(jù)需要，也可以將它們洗凈后再供至反應(yīng)中。例如，在將該菌體或菌體處理物懸濁在水性介質(zhì)中的狀態(tài)下，在與作為氧化劑的氧進行接觸的情況下，確認已提高了腈水合活性后，即使通入氮氣等來除去水性介質(zhì)中的溶解氧，也保持了腈水合活性，因此，可以以該狀態(tài)供至反應(yīng)中。
在本發(fā)明中，對于腈化合物的種類沒有特殊限定，具體而言，是碳原子數(shù)為2～20左右的腈化合物，包括范圍很廣的腈、例如有脂肪族腈、芳香族腈等。作為脂肪族腈來說，可以舉出碳原子數(shù)為2～6的飽和或不飽和腈、例如乙腈、丙腈、丁腈、異丁腈、戊腈、異戊腈、己腈等脂肪族飽和單腈類；丙二腈、丁二腈、己二腈等脂肪族飽和二腈類；丙烯腈、甲基丙烯腈、丁烯腈等脂肪族不飽和腈等。
作為芳香族腈來說，例如可以舉出苯腈、o-、m-及p-氯苯腈、o-、m-及p-氟苯腈、o-、m-及p-硝基苯腈、o-、m-及p-甲苯基腈、芐基氰化物等。其中作為優(yōu)選的例子可以舉出丙烯腈、甲基丙烯腈及丁烯腈等。
實施例以下列舉實施例進一步詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受以下實施例任何限定。
以下，反應(yīng)液的HPLC分析是，使用ULTRON80HG(50×8φmm)作為HPLC柱，使用10mM磷酸水溶液作為展開液。利用220nm的吸光度檢測丙烯酰胺及丙烯腈，測定了濃度。并且利用氧電極(InPro6800/12/320，メトラ一·トレド社制)和溶解氧濃度指示計(4050e型メトラ一·トレド社制)測定了溶解氧濃度，但測定前要進行校正，預(yù)先用5％的亞硫酸鈉水溶液校正零點，然后用空氣充分飽和的10℃純水校正飽和濃度，指示為10.92ppm。
實施例1本實施例中使用的含有腈水合酶的細胞是，在大腸菌HB101株中導(dǎo)入腈水合酶基因，并使用了三井化學(xué)株式會社保藏的MT-10822株(FERM BP-5785，參照特開平11-253168號公報)。
本菌株的培養(yǎng)，是在30L的培養(yǎng)槽內(nèi)，調(diào)整下述組成的培養(yǎng)基15.0L，利用121℃、高壓蒸汽滅菌20分鐘。向該培養(yǎng)基中添加氨芐西林，最終濃度為50μg/ml，然后，將上述菌株植入一白菌耳，在37℃、700rpm下培養(yǎng)20小時。這時，在培養(yǎng)開始后約15小時，添加IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，使終濃度達到100μmol/L，進行培養(yǎng)。
(培養(yǎng)基組成)酵母提取液 5.0g/L多胨 10.0g/LNaCl 5.0g/L
氯化鈷·六水合物10.0mg/L硫酸鐵·七水合物40.0mg/LpH值7.5培養(yǎng)結(jié)束后，將500mL停止菌體增殖的菌體懸濁液，轉(zhuǎn)移到安裝有氧電極和溫度計的1L燒瓶內(nèi)。一邊保持內(nèi)溫10℃，一邊以400N-ml/min向燒瓶氣相部通入空氣、并進行排氣，進行攪拌。在保持0、24小時后，取出一部分菌體懸濁液。這期間，該菌體懸濁液的溶解氧濃度指示為10.0～10.9ppm。
在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100ml可密封的玻璃容器內(nèi)，將23.0mg該菌體懸濁液，懸濁在10.0g預(yù)先脫氧的50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽水溶液(pH值8.1)中，向該懸濁液中添加預(yù)先脫氧的丙烯腈，其終濃度為19重量％，在20℃下邊攪拌邊反應(yīng)2小時。添加80g的10mM磷酸水溶液，結(jié)束反應(yīng)后，利用HPLC分析，測定反應(yīng)結(jié)束液中的丙烯酰胺濃度，接著求出該菌體懸濁液的干燥菌體重量濃度，并計算出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將保存第0小時的生成量設(shè)為1，則第24小時為1.1，這期間穩(wěn)定地保持了腈水合酶的腈水合活性。
實施例2將500mL的與實施例1同樣得到的停止了菌體增殖的菌體懸濁液，轉(zhuǎn)移到裝有氧電極和溫度計的1L燒瓶內(nèi)。一邊保持10℃內(nèi)溫，一邊向燒瓶氣相部以400N-ml/min通入空氣、以4000N-ml/min通入氮氣地通入混合氣體，并進行排氣，進行攪拌。在保存0、24小時后，取出一部分菌體懸濁液。這期間，該菌體懸濁液的溶解氧濃度指示為1.0～1.5ppm。與實施例1同樣，求出該菌體懸濁液的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將保存第0小時的生成量設(shè)為1時，則第24小時為1.0，這期間穩(wěn)定地保持了腈水合酶的腈水合活性。
比較例1將500mL的與實施例1同樣得到的停止了菌體增殖的菌體懸濁液，轉(zhuǎn)移到裝有氧電極和溫度計的1L燒瓶內(nèi)。一邊保持10℃內(nèi)溫，一邊以400N-ml/min向燒瓶氣相部通入氮氣，并進行排氣，進行攪拌，對該菌體懸濁液進行脫氧。在保存0、1、3小時后，取出一部分菌體懸濁液。這期間，該菌體懸濁液的溶解氧濃度指示為0.0ppm。與實施例1同樣，求出該菌體懸濁液的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將保存0小時的生成量設(shè)為1時，則第1小時為0.45，第3小時為0.20，這期間，腈水合酶的腈水合活性隨著時間延長而降低了。
比較例2將500mL的與實施例1同樣得到的停止了菌體增殖的菌體懸濁液，轉(zhuǎn)移到裝有氧電極和溫度計的1L燒瓶內(nèi)，一邊保持10℃內(nèi)溫，一邊以400N-ml/min向燒瓶氣相部通入氮氣，并進行排氣，進行攪拌。與實施例1同樣，求出保存0小時后的該菌體懸濁液的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。保存1小時后，取出一部分菌體懸濁液，在氮氣環(huán)境中，對菌體懸濁液進行離心分離(15000G×15分鐘)，從懸濁液中只分離出菌體，得到濕菌體。
在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100mL可密封的玻璃容器內(nèi)，將上述得到的0.20g濕菌體懸濁在預(yù)先脫氧的純水中，調(diào)整總量為20.00g。一邊保持20℃內(nèi)溫，一邊對該菌體懸濁液攪拌15分鐘。
在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100mL可密封的玻璃容器內(nèi)，將66.0mg該菌體懸濁液，懸濁在10.0g的預(yù)先脫氧的50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽水溶液(pH值8.1)中，向該懸濁液中添加預(yù)先脫氧的丙烯腈，其終濃度為19重量％，在20℃下邊攪拌邊反應(yīng)4小時。添加80g的10mM磷酸水溶液，反應(yīng)結(jié)束后，利用HPLC分析，測定反應(yīng)結(jié)束液中的丙烯酰胺濃度。接著求出該菌體懸濁液的干燥菌體重量濃度，并計算出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將保存1小時后利用離心分離得到的濕菌體的生成量設(shè)為1.0時，則保存0小時的生成量為2.9，確認了比較例2得到的濕菌體是腈水合酶活性降低了的菌體。
實施例3～9將與實施例1同樣得到的停止了菌體增殖的菌體懸濁液，利用離心分離(15000G×15分鐘)從懸濁液中只分離出菌體，得到濕菌體。在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100ml可密封的玻璃容器內(nèi)，將0.20g所得到的濕菌體懸濁在預(yù)先脫氧的純水中，進而添加并懸濁作為氧化劑的鐵氯化鉀，形成下表1所示那樣的終濃度，調(diào)整總量為20.00g。另一方面，同樣地調(diào)整不添加氧化劑的菌體懸濁液。一邊保持20℃內(nèi)溫，一邊將該菌體懸濁液攪拌15分鐘。
在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100ml可密封的玻璃容器內(nèi)，將66.0mg該菌體懸濁液，懸濁在10.0g預(yù)先脫氧的50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽水溶液(pH值8.1)中，并向該懸濁液中添加預(yù)先脫氧的丙烯腈，其終濃度為19重量％，20℃下邊攪拌邊反應(yīng)4小時。添加80g的10mM磷酸水溶液，反應(yīng)結(jié)束后，利用HPLC分析，測定反應(yīng)結(jié)束液中的丙烯酰胺濃度。接著求出該菌體懸濁液的干燥重量濃度，并計算出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將沒有添加氧化劑時的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1.0，將實施例3～9的生成量，以相對值示于下表1中。
實施例10～11取代實施例3中使用的鐵氯化鉀，作為氧化劑，添加、懸濁過硫酸銨，形成下表1所示的終濃度，除此以外，同樣地求出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將不添加氧化劑時的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1.0，將實施例10～11的生成量以相對值示于表1中。
實施例12取代實施例3中使用的鐵氰化鉀，作為氧化劑，添加、懸濁30重量％過氧化氫水，使過氧化氫終濃度如下表1所示，除此之外，同樣地求出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將未添加氧化劑時的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1.0，將實施例12的生成量以相對值示于表1中。
表1

從上述結(jié)果可知，當將微生物菌體與鐵氰化鉀、過氧化氫、過硫酸銨這樣的氧化劑接觸時，可提高腈水合酶的腈水合活性。
實施例13將與實施例3同樣地得到的0.20g濕菌體，在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100ml可密封的玻璃容器內(nèi)，懸濁在預(yù)先脫氧的純水中，而且，作為氧化劑，添加、懸濁鐵氰化鉀，終濃度為0.77重量％，調(diào)整總量達到20.00g。一邊保持20℃內(nèi)溫，一邊攪拌該菌體懸濁液。在攪拌開始后，經(jīng)過0小時、10分鐘、2小時、24小時的時刻，采取少量該菌體懸濁液，與實施例3同樣，計算出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將攪拌開始后第0小時的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1，將攪拌開始后第10分鐘、2小時、24小時的生成量以相對值示于表2中。
表2

從上述結(jié)果可知，當將微生物菌體與鐵氰化鉀這樣的氧化劑接觸時，在因接觸時間使得腈水合酶的腈水合活性提高的同時，并保持住已提高了的活性。
實施例14與實施例3同樣地得到濕菌體。接著在裝有氧電極和溫度計的100ml燒瓶內(nèi)，將1.5g在上述所得到的濕菌體懸濁在48.5g的純水中。一邊保持10℃內(nèi)溫，一邊以40N-ml/min向燒瓶氣相部通入空氣，并進行排氣，進行攪拌。在保存0、1、2、3、7、19天后，采取一部分菌體懸濁液。這期間，該菌體懸濁液的溶解氧濃度指示為10.0～10.9ppm。對所采取的該菌體懸濁液，與實施例3同樣，求出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將保存第0天的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1，將保存第1、2、3、7、19天的生成量以相對值示于表3中。
實施例15與實施例3同樣地得到濕菌體。在安裝有氧電極和溫度計的100ml燒瓶內(nèi)，將1.5g在上述所得到的濕菌體懸濁在48.5g的純水中。一邊保持10℃內(nèi)溫，一邊向燒瓶氣相部以40N-ml/min通入空氣和以400N-ml/min通入氮氣即通入混合氣體，并進行排氣，進行攪拌。在保存0、1、2、3、7、19天后，采取一部分菌體懸濁液。這期間，該菌體懸濁液的溶解氧濃度指示為1.0～1.5ppm。與實施例3同樣，求出所采取的該菌體懸濁液中每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將保存第0天的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1，將保存第1、2、3、7、19天的生成量以相對值示于下表3中。
表3

從上述結(jié)果可知，當使作為氧化劑的氧與微生物菌體接觸時，因接觸時間使得腈水合酶的腈水合活性提高，經(jīng)過某時間后，腈水合活性仍穩(wěn)定地保持為很高狀態(tài)。
實施例16～18將0.20g的與實施例3同樣所得到的濕菌體，在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100ml可密封的玻璃容器內(nèi)，懸濁在預(yù)先脫氧的純水中，進而添加作為氧化劑的鐵氰化鉀，最終濃度達到2.0重量％，接著用氫氧化鈉水溶液或硫酸調(diào)整到表4所示的pH值，調(diào)整到總量為20.00g。另一方面，也同樣地調(diào)制了不添加氧化劑、不調(diào)整pH的菌體懸濁液。邊保持20℃內(nèi)溫，邊攪拌該菌體懸濁液15分鐘。與實施例3同樣，計算出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將不添加氧化劑、不調(diào)整pH值時的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1，將實施例16～18的生成量以相對值示于下表4中。
表4

實施例19～21將0.20g的與實施例3同樣得到的時菌體，在預(yù)先用氮氣充分置換內(nèi)部的100ml可密封的玻璃容器內(nèi)，懸濁在預(yù)先脫氧的純水中，進而添加并懸濁作為氧化劑的鐵氰化鉀，使最終濃度達到2.0重量％，調(diào)整成總量為20.00g。另一方面，也同樣地調(diào)制不添加氧化劑的菌體懸濁液。將內(nèi)溫保持在下表6的溫度下，攪拌該菌體懸濁液15分鐘。與實施例3同樣，計算出每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量。將不添加氧化劑并在20℃內(nèi)溫下懸濁的每單位干燥菌體重量的丙烯酰胺生成量設(shè)為1，將實施例19～21的生成量以相對值示于下表5中。
表5

產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，可以用簡便方法，在不伴有細胞增殖的條件下，對含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物，不僅能保持腈水合酶的活性，還能提高一旦降低了的腈水合酶活性，所以在工業(yè)上可有利于由腈化合物制造酰胺化合物。
權(quán)利要求
1.一種保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于在不伴有細胞增殖的條件下，將含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物與氧化劑接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于在結(jié)束培養(yǎng)后或停止培養(yǎng)后，在實質(zhì)上不伴有細胞增殖的條件下，將含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物與氧化劑接觸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于使用標準電極電位相對于標準氫電極在0.1～2.1V范圍的氧化劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于氧化劑是選自氧、過氧化氫、鐵氰化鉀和過硫酸銨中的至少一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于以含有氧的氣體的方式供給作為氧化劑的氧。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于氧化劑的濃度在1重量ppm～10重量％的范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于與氧化劑接觸時的溫度是0～60℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于與氧化劑接觸時的pH值是5～10。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于腈水合酶是分子內(nèi)含有鈷的腈水合酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于在不伴有細胞增殖的條件下，將利用基因轉(zhuǎn)換在分子內(nèi)表達有含鈷腈水合酶的細胞或該細胞的處理物，與氧化劑接觸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合活性的方法，其特征在于細胞是含有腈水合酶的微生物菌體或該微生物菌體的處理物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于微生物菌體是基因轉(zhuǎn)換微生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于基因轉(zhuǎn)換微生物是基因轉(zhuǎn)換大腸菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于基因轉(zhuǎn)換大腸菌的宿主是源自Escherichia coli K-12的W3110株(ATCC27325)、HB101株(ATCC33694)、JM109株(ATCC53223)或WA802株(ATCC33526)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保持或提高腈水合酶活性的方法，其特征在于含有腈水合酶的細胞或該細胞處理物用于由腈化合物制造酰胺化合物的方法中。
16.一種由腈化合物制造酰胺化合物的方法，其特征在于使用含有利用權(quán)利要求1～15中任一項所述的方法獲得的腈水合酶的細胞或該細胞處理物。
全文摘要
本發(fā)明是通過在不伴有細胞增殖的條件下使含有腈水合酶的細胞或該細胞的處理物與氧化劑接觸從而保持或提高腈水合酶活性的方法、以及使用已與氧化劑接觸的該細胞或該細胞的處理物由腈化合物制造酰胺化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明，不僅能保持腈水合酶的活性，還能提高一旦降低了的腈水合酶活性，因此能有效地由腈化合物制造酰胺化合物。
文檔編號C12N9/96GK1572871SQ200410038399
公開日2005年2月2日 申請日期2004年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月28日
發(fā)明者上原與志一, 末廣雅子, 福田偉志, 深田功 申請人:三井化學(xué)株式會社