專利名稱：生物學生產(chǎn)酰胺的方法
技術領域：
本發(fā)明是關于在來源于微生物的腈水合酶作用下將腈水合為相應酰胺的方法。更確切地說，本發(fā)明是關于其特征在于所用的微生物的生物學生產(chǎn)酰胺的方法及生產(chǎn)腈水合酶的方法。
通過水合諸如丙烯腈等一種腈生產(chǎn)如丙烯酰胺的低級脂肪族酰胺已有很多酶作用的水合方法，諸如用微生物生產(chǎn)的腈水解酶或腈水合酶(見如日本專利公開N.21519/87，美國專利N，4，001，081未審查
公開日本專利申請NOs162193/86和91189/87，EPCNOs.188316和0204555;和日本專利公開NOs.17918/81和37951/84，美國專利NOs.4，248，968和4，637，982)。這些生物學生產(chǎn)酰胺的方法已經(jīng)工業(yè)應用，特別是生產(chǎn)丙烯酰胺的優(yōu)越方法已引起了人們的注意。
有很多微生物被建議用作生物生產(chǎn)酰胺的微生物。在本發(fā)明研究前的這些微生物雖然可有效水合低級脂肪腈，但對芳香腈并不總是有效的。因此，通過水合3-氰基吡啶水合生產(chǎn)菸酰胺產(chǎn)率太低，所以還不能用于工業(yè)生產(chǎn)。
已知先有技術是在有鐵離子或錳離子存在下培養(yǎng)微生物。這個技術也用于生物學生產(chǎn)酰胺，在有鐵離子參與下培養(yǎng)紅球菌屬(Rhodococcus)微生物的例子在未審查
公開日本專利申請N.162193/86和91189/87中已有敘述。
作為本發(fā)明人的研究結果發(fā)現(xiàn)一種來自假單胞菌屬的細菌的腈水合酶，在其活性中心中含F(xiàn)e+++，因此培養(yǎng)基中鐵離子的存在對該微生物的培養(yǎng)是必需的。在上述已知例子中可預見用于紅球菌屬微生物的培養(yǎng)基中的鐵離子是生產(chǎn)腈水合酶所必需的。
本發(fā)明是基于下面發(fā)現(xiàn)而完成的，即紅球菌屬的一個特定株，玫瑰色紅球菌種的J-1株在含鐵離子培養(yǎng)基中不產(chǎn)生腈水合酶而在含鈷離子培養(yǎng)基中則產(chǎn)生腈水合酶;而這樣生產(chǎn)的腈水合酶可用芳香族腈作底物，將其轉化為酰胺。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)酰胺的方法是生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中腈是通過來源于微生物的腈水合酶的作用水合成相應的酰胺，其特征在于該腈水合酶是通過鈷離子存在下培養(yǎng)玫瑰色紅球菌微生物得到的。
根據(jù)本發(fā)明，雖然在含鐵離子的培養(yǎng)基中沒有腈水合酶活性，但在含鈷離子培養(yǎng)基中其活性增大。但令人意外的是這種特定微生物的腈水合酶的增長很大程度上取決于培養(yǎng)基中金屬離子的類型。
此外，根據(jù)本發(fā)明有利于芳香腈的水合。本發(fā)明的用途特別由于菸酰胺而顯得重要，它是3-氰基吡啶的水合產(chǎn)物，可作合成維生素的原料，而吡嗪酰胺是氰基吡嗪的水合產(chǎn)物，可用作抗結核藥。
1.生物學生產(chǎn)酰胺方法的總構思本發(fā)明是關于在來源于微生物的腈水合酶作用下將腈轉化成相應酰胺的方法，該方法基本上包括培養(yǎng)一種微生物，誘導腈水合酶，使該酶作用于底物腈。
這些步驟本身作為單元操作是已知的，在本發(fā)明中是以它們合適的形式應用的?！霸谟锈掚x子存在下培養(yǎng)微生物得到腈水合酶”這種表達方式是把誘發(fā)腈水合酶看作一個天然的前提。
本發(fā)明的前提“在來源于微生物的腈水合酶作用下將腈水合為相應酰胺的方法”包括任何合適的實施方案或導致腈水合酶作用于腈的各種方法的修飾。作為一種實施方案，有一種收集由微生物產(chǎn)生的酶的方法，和用該酶作酶制品的方法。這種將該酶以酶制劑方式用于腈水合酶的方法也應理解為屬本發(fā)明“生物學方法”范疇。
2.水合反應的細節(jié)
1)微生物用于本發(fā)明的微生物是玫瑰色紅球菌種的微生物，該種的代表菌株為J-1株。
J-1株的細節(jié)如下(1)來源和保藏菌株J-1是從日本京都Sakyo-ku的土壤中取得的樣品，作為國際保藏物(根據(jù)國際承認為專利程序保藏微生物的布達佩斯條約)保藏在日本工業(yè)科技機構所屬的發(fā)酵研究所，貯藏號為FERMBP-1478。
(2)細菌學特性(a)形態(tài)學1細胞形態(tài)和大小0.9-1.0μ×3-10μ。
2.細胞的多形性初始培養(yǎng)階段為長棒狀，迅速生長時呈彎曲狀，然后分裂成短桿菌。
3.游動性無4.芽孢無5.革蘭氏染色陽性6.抗酸性陰性7.異染顆粒細胞已測到(b)不同培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)(30℃)1.肉湯瓊脂平板培養(yǎng)直徑1mm的環(huán)狀(48小時)，不規(guī)則和光滑，表面相當干燥，扁平，不透明，淡桔紅-粉色。
2.肉湯瓊脂斜面培養(yǎng)平滑表面相當干燥的念珠狀，輕度突起部分尤其干，呈淡桔紅-粉色。
3.肉湯液體培養(yǎng)繁茂生長，形成菌膜，中度混濁，隨著生長形成沉淀。
4.肉湯明膠穿刺培養(yǎng)表面生長良好，沿穿刺部分呈園錐形，但在底層不是此狀，明膠中無液化現(xiàn)象。
5.石蕊乳無變化。
(c)生理學性質1.還原硝酸鹽陽性2.反硝化陰性3.甲基紅(MR)試驗陰性4.VP試驗陰性5.吲哚形成陽性6.硫化氫形成陽性7.淀粉水解陰性8.檸檬酸利用Kocur培基陰性Christenson培基陽性9.利用無機氮源硝酸鹽陽性銨鹽陽性10.成色反應陽性11.脲酶陽性12.氧化酶陰性13.過氧化氫酶陽性14.纖維素水解陰性15.生長范圍pH5-10，溫度10-41℃。
16.對氧的需要喜氧氣17.分解酪氨酸陽性18.分解腺嘌呤陽性19.磷酸酯酶陽性20.水解吐溫80陽性21.O-F試驗陰性
22.抗熱性(在10%的脫脂乳中，72℃，15分鐘)無23.由糖產(chǎn)酸和氣體酸氣L-阿拉伯糖--D-木糖--D-葡萄糖+-D-甘露糖--D-果糖+-麥芽糖+-蔗糖+-乳糖--海藻糖--D-山梨醇+-D-甘露醇+-甘油+-+陽性;-陰性24.在單一碳源中生長肌醇-麥芽糖+D-甘露醇+鼠李糖-D-山梨糖+間-羥基苯甲酸+已二酸鈉+苯甲酸鈉+檬檬酸鈉+
乳酸鈉+睪丸酮+L-酪氨酸+甘油(1%)(w/v)(+)海藻糖(+)對-羥基苯甲酸(1%)(w/v)++陽性，-陰性，(+);輕度陽性。
25.脂肪酸和細胞壁;含不飽合和飽合的直鏈脂肪酸和結核硬脂酸。分枝菌酸的薄層層析產(chǎn)生一個單斑。
按照Bergy的系統(tǒng)細菌學手冊作為上述細菌學性質的分類結果，J-1菌株是一個好氣，革蘭氏陽性，弱抗酸，過氧化氫酶陽性和不生成內(nèi)芽孢的桿菌，它不插入鞭毛。它在生長初期呈類似菌絲體的加長桿菌形，分枝生長，然后分裂成短桿菌。因此它被認為屬于諾卡氏(Nocardia)類型細菌。
脂肪酸組分分析表明該菌含不飽和和包括結核硬脂酸的飽和直鏈脂肪酸。分枝菌酸的薄層層析分析得到一個單斑，其Rf值與標準玫瑰色紅球菌(IFO3338)的Rf值相同，從而可與分枝桿菌屬(Mycobacterium)分開。也由于其分枝菌酸組成(碳原子數(shù))不同而與諾卡氏菌區(qū)分開。其它生化性質試驗結果證實該細菌為玫瑰色紅球菌。
微生物都傾向于突變，因此，不用說J-1株本身，即使是有效菌株J-1的突變體，只要它在有鈷離子存在下培養(yǎng)能生成腈水合酶就可用于本發(fā)明。
2)底物/腈如上所述微生物生產(chǎn)的腈水合酶將嬗米韉孜錚廡╇媸欠枷闋澹咀宓ル婊蛩媯乇鶚塹ル妗 最具有本發(fā)明的特征的腈是芳香族腈，特別是由4-10個碳原子組成其芳香環(huán)的芳香腈。典型的例子是由下面[Ⅰ]-[Ⅵ]通式表示的
它們中典型的化合物是4-，3-，和2-氰基吡啶。
其中R1-和R2-分別代表H，CH3，OH，OCH3，Cl，F(xiàn)，CN，NH2或NO2。
它們中典型化合物是芐腈，鄰-，間-，和對-氯芐腈，鄰-，間和對-氟芐腈，鄰-，和間-硝基芐腈，對-氨基芐腈，鄰-間和對-芐基氰，4-氰基苯酚，茴香腈，鄰苯二甲腈，異鄰苯二甲腈，對苯二腈，2，6-二氯芐腈，2，4-二氯芐腈和2，6-二氟芐腈。
它們中的典型化合物是α-和β-萘甲腈。
其中X代表S或O它們中的典型化合物是2-苯硫腈和2-氟腈。
它們中的典型例子是5-氰基吲哚
它們中的典型例子是氰基吡嗪。
構成本發(fā)明對象的另一組腈優(yōu)選的是脂肪族腈，較好的是具2-6個碳原子的單或雙腈，最好為單腈。從生成酰胺的用途來判斷，丙烯腈是典型的并具有良好的產(chǎn)率。
這些相應于腈的酰胺是由于將腈的氰基轉化為酰胺基而得到的。在二腈情況下，至少有一個氰基轉化為酰胺基。
3)腈水合酶的培養(yǎng)和生產(chǎn)玫瑰色紅球菌種的微生物的培養(yǎng)在鈷離子存在于培養(yǎng)基的情況下可以于任何適宜的條件下進行。通常的作法是向培養(yǎng)基中加入隨后將詳述的一種酶誘導劑，以便使腈水合酶在細菌細胞內(nèi)積聚。
(1)基礎培養(yǎng)基適合的培養(yǎng)基的例子闡述如下，本領域的普通技術人員能很容易地改變下述各成分的劑量，以另一種物質替換某成分，去除某些成分或加入某些成分等操作。
(1)培養(yǎng)基A成分劑量(每升培養(yǎng)基中)維生素混合物＊10.1mlK2HPO413.4gKH2PO46.5gNaCl1.0gMgSO4·7H2O 0.2g蒸餾水平衡(pH7.0)＊1組分生物素2μg泛酸鈣0.4mg肌醇2mg尼克酸0.4mg鹽酸硫胺0.4mg鹽酸吡哆醇0.4mg
對氨基苯甲酸0.2ng核黃素0.2mg葉酸0.01ng水至1升(ⅱ)培養(yǎng)基B甘油10g胨5g麥芽汁3g酵母膏3g蒸餾水平衡(pH7.2)(ⅲ)培養(yǎng)基C酵母膏3gKH2PO40.5gK2HPO40.5gMgSO4·7H2O 0.5g蒸餾水平衡(pH7.2)(2)酶誘導劑用以誘導和產(chǎn)生玫瑰色紅球菌微生物的腈水合酶的酶誘導劑可以是任一類適于此目的的物質。
典型的對本發(fā)明合適的誘導劑是腈和酰胺。
對J-1菌株已證實有效的酶誘導劑的例子如下巴豆酰胺(又稱丁烯酰胺)，乙腈，丙腈，苯酰胺，丙酰胺，乙酰胺，異戊腈，正丁腈，異丁腈，正己腈，3-戊烯腈，別戊腈，正丁酰胺，異丁酰胺，正戊酰胺，正己酰胺，異丁烯酰胺和苯乙酰胺。
(3)鈷離子來源即使上述的酶誘導劑存在于培養(yǎng)基中，也不能得到腈水合酶，根據(jù)本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入鈷離子是必需的。
如果培養(yǎng)基是液體，則向培養(yǎng)基中加入水溶性鈷化合物來獲得鈷離子。水溶性鈷化合物常見于化學辭典中，本領域的普通技術人員很易于從中選擇和使用一種適宜的化合物(某些情況下，尚需做一個簡單的預試驗來決定)。典型的鈷化合物應提供Co++或Co+++，特別是Co++。特殊的例子是氯化鈷，硫酸鈷，醋酸鈷，溴化鈷，硼酸鈷等。維生素B12和金屬鈷是鈷化合物的其它例子，它們在培養(yǎng)基中通過電離作用或在培養(yǎng)過程中經(jīng)微生物氧化侵蝕可在原位產(chǎn)生鈷離子。
(4)培養(yǎng)為在細菌細胞內(nèi)產(chǎn)生和積聚腈水合酶的培養(yǎng)可以通過于適宜條件下在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所用微生物，如J-1株來完成。
所用酶誘導劑的劑量按順序為2-6g/l培基。鈷離子劑量按順序為5-15mgCOCl2/l培基。
培養(yǎng)基組分的特殊例子特列于下(ⅰ)培養(yǎng)基A1升乙腈(誘導劑)2gCOCl210mg(ⅱ)培養(yǎng)基B1升異戊腈2gCOCl210mg(ⅲ)培養(yǎng)基C1升丁烯酰胺2gCOCl210mg經(jīng)在15-50℃，尤其是20-45℃，最好是30℃左右，pH7-9條件下振蕩培養(yǎng)J-1菌株大約30小時或30小時以上，最好是40小時或40小時以上(上限不超過120小時)能使腈水合酶優(yōu)勢產(chǎn)生。最好是從培養(yǎng)的初始階段就有酶誘導劑存在，為準備具高度活性的細菌細胞，要求不斷補充誘導劑。例如，當需在28℃下振蕩培養(yǎng)76小時時，在反應開始后26小時和56小時都添加額外量的丁烯酰胺，以使其濃度維持0.2%(w/v)。
4)腈的水合反應本發(fā)明的前提“在來源于微生物的腈水合酶作用下將腈水合轉變?yōu)橄鄳０返纳a(chǎn)酰胺的生物學方法”包括如上所述的任何合適的突施方案和導致腈水合酶作用于腈的各種方法的修飾。
突施方案之一是在微生物培養(yǎng)基中有底物腈存在的情況下在培養(yǎng)基中生產(chǎn)酰胺。
導致腈水合酶作用于其底物的另一實施方案是將底物腈加入已積聚了腈水合酶的培養(yǎng)基中，以發(fā)生水合反應。對該實施方案的修飾是使用該微生物細胞已被破壞的培養(yǎng)基作為“腈水合酶已積聚的培養(yǎng)基”。
導致腈水合酶作用于其底物的進一步實施是從培養(yǎng)基中分離已積聚了腈水合酶的細胞，最好再將細胞加以適當?shù)妮d體或“固定”它們，然后使其與底物接觸。這種方法，特別是使用固定的細胞的最好突施方案據(jù)認為與上述第二種突施方案一樣甚至更好地用于工業(yè)化生產(chǎn)。使用固定的細胞的這項技術在載體的類型，固定該微生物于載體上的方法，和在所謂的生物反應器中利用固定的微生物等技術細節(jié)都是本領域眾所周知的。
使腈水合酶作用于其底物的另一實施方案是制備腈水合酶制劑的方法和腈被該酶制劑以非生物學方式水合的方法。不言而喻，以這種方式進行的水合反應最好是在不喪失酶活性的pH和溫度下進行。這些條件可認為與上述“生物學方式”的條件一樣。如上所述，在酶作用期間不存在微生物的實施方案也如本發(fā)明中“生物學生產(chǎn)方法”一樣處理。
根據(jù)本發(fā)明，腈水合酶有一個適合的pH范圍7-9，其中最適pH為8.0。如果反應液pH低于7，該酶活性趨向突然降低。據(jù)此，要求添加緩沖液于反應液中。即使使用如磷酸鉀緩沖液，Tris/HCl緩沖液，Hepes/KOH緩沖液或硼酸鈉緩沖液中任一種緩沖液，腈水合酶活性也不會改變。
在培養(yǎng)基中或水合反應溶液中底物的濃度范圍通常為4-7克分子/每升，反應溫度波動于10-30℃。
3.實驗實施例測定腈水合酶活性和下列實驗實施例中酶活性單位的方法特規(guī)定如下(1)測定腈水合酶活性的方法通過用含10mM芐腈，30mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和一定量微生物細胞(由培養(yǎng)基中分離得到)的反應混合液2ml在10℃下反應5分鐘，隨后加入1N-HCl2ml以終止反應來測定腈水合酶活性。
(2)單位的定義1單位腈水合酶活性被定義為芐腈在上述條件下以每分鐘1微克分子速率產(chǎn)生苯酰胺所需的酶量。
參考例1使用其組分特列于下的培養(yǎng)基在特列于下的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)J-1菌株，腈水合酶活性的表達通過在培養(yǎng)期間向培養(yǎng)基中加入COCl和/或Fe SO4來檢查。
(ⅰ)培養(yǎng)基組分成分劑量(每升培養(yǎng)基中)維生素混合物3.0mlK2HPO40.5gKH2PO40.5gMgSO4·7H2O 0.5g丙腈2ml
蒸餾水平衡(pH7.2)(ⅱ)培養(yǎng)條件28℃/70-80小時所獲結果顯示如下可以看出，如果向基礎培養(yǎng)基中加入Fe SO4將不出現(xiàn)腈水合酶活性，但加入COCl2時則出現(xiàn)腈水合酶活性，向已加有COCl2的系統(tǒng)中再加入Fe SO4將反向影響其結果。
加入金屬離子COCl20 0 0 0 0 10 10 10 10 10(mg)Fe SO40 5 10 20 40 0 5 10 20 40(mg)細胞量＊1(mg/ml)1.061.141.251.241.342.041.902.162.162.07酶活性U/mg細胞＊2000000.590.260.340.320.16U/ml培養(yǎng)基000001.200.490.730.690.33
＊1細胞量以干重計＊2U按上述定義的酶活性單位，細胞量以干重計。
參考例2各種腈和酰胺作為酶誘導物對J-1菌株的影響列于下表。
下表所列結果是通常對J-1菌株在上述培養(yǎng)基B中28℃下預先培養(yǎng)，并分別以0.1%(v/v)或0.2%(w/v)劑量加入腈或酰胺作為誘導劑，當該菌株已充分增殖后，再進一步轉種于上述的培養(yǎng)基C之中，并添加COCl20.001%(w/v)來進行培養(yǎng)36至48小時，最后獲得結果。
比活性總活性細胞量(U/mg)(U/ml)(mg干細胞/ml)巴豆酰胺2.224.482.02乙腈1.413.472.46丙腈1.364.443.26苯酰胺0.842.753.26丙酰胺0.792.292.90乙酰胺0.711.552.18正丁腈1.400.383.70異丁腈0.411.243.06異戊腈0.341.053.07正己腈0.281.043.713-戊烯腈0.321.424.49別戊腈0.350.240.69
正丁酰胺0.431.553.62異丁酰胺0.090.333.48異戊酰胺0.441.081.81正己酰胺0.301.063.52異丁烯酰胺0.200.623.12苯乙酰胺0.290.280.95實例1在由上述培養(yǎng)基C和分別以每升培養(yǎng)基中0.01g和2g的比例加入的COCl2和巴豆酰胺所構成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株得到J-1株的細胞與作為底物使用的各種腈反應。該反應使用包括從2ml培養(yǎng)基所得細胞，10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和200mM底物的反應混合液2ml在25℃下進行76小時后完成。加入1N-HCl 0.2ml以終止該反應。腈水合酶對各自底物的酶活性按經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)測定的底物消耗量或反應產(chǎn)物對以3-氰基吡啶為底物測定的腈水合酶活性的比率排列于下，即比活性(%)。
結果如下底物比活性(%)3-氰基吡啶100丙烯腈1064-氰基吡啶1292-氰基吡啶645-氰基吲哚92-苯硫腈116
2-糠腈71芐腈804-氰基苯酚24對-氨基芐腈16間-硝基芐腈7鄰-硝基芐腈16間-氯芐腈29對-芐基氰5鄰-芐基氰46間-芐基氰32茴香腈20鄰-氯芐腈41對-氯芐腈72，4-二氯芐腈22，6-二氯芐腈1氰基吡嗪80實例2在容量1升的錐形瓶內(nèi)置入組成包括前述培養(yǎng)基C，并含COCl2(0.01g/l)和巴豆酰胺(2g/l的培養(yǎng)基400ml，28℃下振蕩培養(yǎng)該混合物。開始培養(yǎng)后的30小時和60小時，向培基中分別加入0.2%(w/v)的巴豆酰胺(800mg/400ml)，并繼續(xù)培養(yǎng)至第80小時終止。
離子培養(yǎng)基以收集細菌細胞，條件為離子機(HitachimodelSCR20B)，12，000g，15分鐘，團塊以0.85%NaCl沖洗后再次離心，團塊懸浮于上述溶液40ml內(nèi)。一小部分懸液作為樣品以測定懸液中的細菌干重。
將含有細胞的懸液(相當于2，33mg干細胞)加到4ml包含10mM酸鉀緩沖液(pH8.0)昨4.57M3-氰基吡啶的反應液中，在25℃下反應過夜，同時在反應3小時和6小時后分別向反應液中加入0.55M和0.49M3-氰基吡啶。從開始反應算起18小時之后，尼克酰胺的產(chǎn)率為5.58M。據(jù)此，轉化率達99.5%。相當于產(chǎn)生了681g尼克酰胺。在此濃度下，作為尼克酰胺沉淀的結果，反應產(chǎn)物呈固態(tài)。
所產(chǎn)生的尼克酰胺經(jīng)分離出結晶狀產(chǎn)物，并通過元素分析，紅外光譜，核磁共振波譜和質譜分析加以鑒定。未檢測出尼克酸。
實例3將實例2中得到的含細胞的懸液(相當于2.33mg的干細胞)加于含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和各種濃度的氰基吡嗪的反應液4ml之中。反應在25℃下進行。反應6小時后，4克分子的氰基吡嗪轉化為吡嗪酰胺，轉化率達100%，9小時后有6克分子氰基吡嗪轉化。另一方面，當以相當于干重4.66mg的細菌細胞懸液代替上述2.33mg干重的細菌細胞時，懸液加于同樣的反應液(4ml)中，反應6小時后，以100%的轉化率，7克分子氰基吡嗪轉化為吡嗪酰胺，9小時后有8克分子氰基吡嗪轉化。未檢出吡嗪羧酸產(chǎn)物。
吡嗪酰胺從溶液中結晶析出。直接收集結晶狀沉淀物，并以甲醇重結晶，經(jīng)元素分析，紅外光譜，核磁共振波譜，和質譜分析證實結晶物是吡嗪酰胺。
使用高效液相色譜方法對氰基吡嗪，吡嗪酰胺和吡嗪羧酸進行分析。
在下列實例中也用此例的方法進行同樣的分析。
實例4
從例2所獲細菌細胞懸液(相當于細胞干重4.66mg)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和3M異丁腈的反應液4ml之中，25℃下反應，并于1小時和3小時后分別向反應液中加入3M異丁腈。反應12小時后9M異丁烯酰胺以100%的轉化率產(chǎn)生。
在上述反應中，在反應后5小時再加1M異丁腈的情況下，反應后24小時將以100%的轉化率產(chǎn)生10克分子異丁烯酰胺。10克分子濃度相當于產(chǎn)生并積累851g異丁烯酰胺/每升反應液。
反應液以水稀釋，離心(12，000g，15分鐘)棄除細菌細胞。無細胞溶液在旋轉蒸發(fā)器上濃縮并結晶。然后，將結晶物復溶和以水重結晶，得到異丁烯酰胺結晶品。
實例5從例2所獲細菌細胞懸液(相當于細胞干重4.66mg)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和1M巴豆腈的反應液4ml之中，25℃下反應，并每隔1小時向反應液中加入1M部分的異丁腈共5次。反應開始6小時后以100%的轉化率產(chǎn)生6克分子巴豆酰胺。當在反應6小時和10小時后分別多加1M部分的巴豆腈時，在10小時和22小時后，以100%轉化率分別產(chǎn)生7克分子和8克分子的巴豆酰胺。8克分子濃度相當于每升反應液生產(chǎn)和積聚了681g巴豆酰胺。
巴豆酰胺結晶化操作同例4。
實例6從例2所獲細菌細胞懸液(相當于細胞干重4.66mg)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和3M乙腈的反應液4ml之中，25℃下反應，并于反應開始后的1小時和3小時再加乙腈3M，6小時后5M。反應12小時后，以100%的轉化率獲得14克分子的乙酰胺。換言之，每升反應液中產(chǎn)生和積聚827g乙酰胺。
反應液以水稀釋，再離心棄除細菌細胞。上清液在旋轉蒸發(fā)器上濃縮至干，復溶于甲醇中并重結晶以得到乙酰胺的結晶品。
實例7從例2所獲細菌細胞懸液(相當于細胞干重4.66mg)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和3M3-羥基丙腈的反應液4ml之中，25℃下反應，反應開始后每隔1小時向反應液中加入3M部分的3-羥基丙腈，共4次。反應后5小時，以100%的轉化率產(chǎn)生15克分子3-羥基丙酰胺。當在此階段中，多加入3M3-羥基丙腈時，則在反應11小時后以100%的轉化率產(chǎn)生18克分子3-羥基丙酰胺。這意味著每升反應液中產(chǎn)生和積聚1600g3-羥基丙酰胺。
反應液以水稀釋，離心棄除細菌細胞。無細胞上清液置旋轉蒸發(fā)器上濃縮并于-20℃下結晶。結晶物復溶于異丙醇中并重結晶以得到3-羥基丙酰胺結晶品。
實例8在容量1升的錐形瓶內(nèi)置入組成包括前述培養(yǎng)基C，并含COCl20.01g/l)和巴豆酰胺(2g/l)的培養(yǎng)基400ml，28℃下振蕩培養(yǎng)該混合物。開始培養(yǎng)后的26小時和56小時，向培養(yǎng)基中分別加入0.2%(w/v)的巴豆酰胺(800mg/400ml)，并繼續(xù)培養(yǎng)至第76小時終止。
用離心機(HitachimodelSCR20B)，以10，000g離心培養(yǎng)基20分鐘以收集細菌細胞，用0.85%NaCl洗滌，再次離心，并懸浮于40ml上述溶液中，一小部分懸液作為樣品以測定懸浮中的細菌干重。
將含有細胞的懸液(相當于2.96mg干細胞)加到4ml包括10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和各種濃度的3-氰基吡啶的反應溶液中。25℃下進行反應。反應9小時后有8克分子3-氰基吡啶以100%轉化率轉化為尼克酰胺，反應22小時后有9克分子3-氰基吡啶轉化。另一方面，當以相當于5.92mg干重的細菌細胞懸液代替上述2.96mg干重的細菌細胞時，懸液加于同樣的反應液(4ml)中，反應5小時后，以100%的轉化率，9克分子3-氰基吡啶轉化為尼克酰胺，反應9小時后，有12克分子3-氰基吡啶轉化。未檢出尼克酸產(chǎn)物。
12克分子濃度相當于每升反應溶液中產(chǎn)生并積聚了1.46g尼克酰胺。
尼克酰胺從溶液中結晶析出，收集結晶并以甲醇重結晶。
實例9從例8所獲細菌細胞懸浮液(相當于5.92mg干細胞)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和1M芐腈的4ml反應液中，25℃下進行反應，并于1，2，3，4，5和7小時后分別向反應液中加入1M芐腈，反應24小時后7M(848g/l)苯甲酰胺以100%轉化率產(chǎn)生。
實例10從例8所獲細菌細胞懸浮液(相當于5.92mg干細胞)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和0.5M2，6-二氟芐腈的4ml反應液中，25℃下進行反應，并于2，4，6和8小時后分別向反應液中加入1M2，6-二氟芐腈，反應22小時后2.5M(393g/l)2，6-二氟苯甲酰胺以100%轉化率產(chǎn)生。
實例11從例8所獲細菌細胞懸浮液(相當于5.92mg干細胞)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和1M2-苯硫腈的4ml反應液中，25℃下進行反應，并于1小時后向反應液中加入1M2-苯硫腈，反應5小時后2M(254g/l)2-苯硫苯甲酰胺以100%轉化率產(chǎn)生。
實例12從例8所獲細菌細胞懸浮液(相當于5.92mg干細胞)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和1M2-糠腈的4ml反應液中，25℃下進行反應，并于1，2，4，6，8，11和23小時后分別向反應液中加入1M2-糠腈，反應23小時后8M(888g/l)2-糠酰胺以100%轉化率產(chǎn)生。
實例13從例8所獲細菌細胞懸浮液(相當于5.92mg干細胞)加入含10mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)和4M3-吲哚乙腈的4ml反應液中，25℃下進行反應，反應24小時后，4M(697g/l)3-吲哚乙酰胺以100%轉化率產(chǎn)生。
權利要求
1.生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中的腈通過來源于微生物的腈水合酶作用水合成相應的酰胺，此方法特征在于在鈷離子存在下培養(yǎng)玫瑰色紅球菌種微生物，得到腈水合酶并用該酶催化水合反應。
2.根據(jù)權利要求1生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述微生物是玫瑰色紅球菌種的J-1菌株，F(xiàn)ERM BP-1478。
3.根據(jù)權利要求1和2中任一項生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述腈是其芳香核中具有4-10個碳原子的芳香腈。
4.根據(jù)權利要求3生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述芳香腈選自下面[Ⅰ]-[Ⅵ]式所示化合物
其中R1和R2分別代表H，CH3，OH，OCH3，Cl，F(xiàn)，CN，NH2或NO2;
其中x代表S或O;
5.根據(jù)權利要求4生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述芳香腈是2-氰基吡啶，3-氰基吡啶或4-氰基吡啶。
6.根據(jù)權利要求5生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述芳香腈是3-氰基吡啶。
7.根據(jù)權利要求4生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述芳香腈是氰基吡嗪。
8.根據(jù)權利要求1和2中任一項生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述腈是具2-6個碳原子的脂肪族腈。
9.根據(jù)權利要求8生產(chǎn)酰胺的生物學方法，其中所述具2-6個碳原子的脂肪族腈是丙烯腈。
全文摘要
在用來源于微生物的腈水合酶作用下將腈水合成相應酰胺的生物學生產(chǎn)方法中，其改進在于所用的腈水合酶是從有鈷離子存在下培養(yǎng)玫瑰色紅球菌種微生物得到的。
文檔編號C08J9/00GK1032436SQ8810673
公開日1989年4月19日 申請日期1988年9月17日 優(yōu)先權日1987年9月18日
發(fā)明者山田秀明, 長沢透 申請人:山田秀明