高密度脂蛋白2中的膽固醇的定量方法和用于該方法的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種不必進行繁雜的操作，即可定量受檢樣品中的HDL2膽固醇的方法。膽固醇的定量方法包括：使磷脂酶與HDL發(fā)生作用，來定量膽固醇。該方法包括：步驟一，使受檢樣品中的高密度脂蛋白以外的膽固醇轉(zhuǎn)移到反應(yīng)系統(tǒng)外；以及步驟二，定量反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)殘留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2膽固醇，通過利用該方法進行步驟二，可以定量受檢樣品中的高密度脂蛋白2膽固醇。
【專利說明】高密度脂蛋白2中的膽固醇的定量方法和用于該方法的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高密度脂蛋白2(以下，有時稱作“HDL2”)中的膽固醇(以下，有時將HDL2中的膽固醇稱作“HDL2膽固醇”)的定量方法和用于該方法的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]由于高密度脂蛋白(HDL)從包含動脈硬化壁的各組織接受膽固醇，所以其與蓄積在細(xì)胞內(nèi)的膽固醇的除去作用有關(guān)，因此其還被稱作膽固醇逆轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。已知HDL與冠狀動脈硬化等動脈硬化疾病呈負(fù)相關(guān)，已知HDL呈低值，這作為脂質(zhì)異常癥之一而設(shè)有低值限，可以作為動脈硬化的指標(biāo)。
[0003]HDL由脫輔基蛋白、磷脂、膽固醇和中性脂肪構(gòu)成。HDL的密度d = 1.063~
1.210g/mL，進一步被分類為下述的兩種組分(分畫):d = 1.063~1.125g/mL的HDL2和d = 1.125~1.210g/mL的HDL3。根據(jù)脂蛋白的分布曲線,在d = 1.125g/mL部分確認(rèn)到凹口，從這里起將密度重的部分作為HDL3。另外，還存在著下述的亞組分(亜分畫)的劃分方法，即在HDL中的脫輔基蛋白中，根據(jù)脫輔基脂蛋白E含量差，將脫輔基脂蛋白E的含量多的HDL作為富含脫輔基脂蛋白E的HDL。
[0004]一直以來，已知不僅HDL全體、就連HDL2和HDL3各亞組分也顯示出不同的作用。據(jù)說HDL2具有抗動脈硬化作用。已知在臨床上，由于CETP缺損，HDL沒有代謝成LDL或IDL，HDL膽固醇量增加。據(jù)說由于CETP缺損而增加的HDL是HDL2。另外，據(jù)說由于CETP缺損，富含脫輔基脂蛋白E的HDL上升，據(jù)說富含脫輔基脂蛋白E的HDL，其爭奪膽固醇的能力強，具有抗血小板作用，即使在HDL中也是較好的。另外，由于肝性脂肪酶活性降低，HDL3沒有轉(zhuǎn)變成HDL2，HDL3增加。即，HDL的各亞組分的比率根據(jù)病態(tài)而不同，僅憑只測定HDL，難以看到它們的變化。根據(jù)上述的傾向測定HDL的各亞組分，預(yù)想這將有助于判斷動脈硬化疾病或脂質(zhì)異常癥等疾病的有無或病因。目前，各制造商正在推進依據(jù)這些HDL亞組分的作用、抑制CETP的作用、減少LDL膽固醇量、增加HDL膽固醇量的治療藥的開發(fā)。
[0005]確立HDL亞組分的簡便的測定方法，這有可能關(guān)系到詳細(xì)的作用的闡明或它們的治療效果。
[0006]迄今為止，作為HDL亞組分的測定方法而已知的方法，有超離心法、高效液相色譜(HPLC)法、HDL3沉淀法(專利文獻I)、NMR法等。
[0007]超離心是指利用脂蛋白的密度差，通過離心進行分餾的方法，存在著操作必需熟練、需要數(shù)日、費用也高的缺點。在岡崎等人采用HPLC來區(qū)分HDL2和HDL3的方法中，操作需要時間，還需要特別的儀器。HDL3沉淀法是指，利用包含二價金屬離子和葡聚糖硫酸的試劑，使HDL3以外的脂蛋白聚集，通過離心回收上清部分的HDL3，再利用自動分析裝置進行測定的方法。該方法仍然要求操作熟練，而且是手動的方法，有時還需要進行檢體的前處理操作，存在著到測定為止需要花費某種程度的時間的缺點，不具有通用性。另外，NMR法是通過核磁共振來計測脂蛋白的顆粒數(shù)的方法，其需要特殊的機械，通常不采用。[0008]需要說明的是，存在HDL亞組分的分析方法(專利文獻2)。雖然可以利用通用自動分析裝置進行測定，但采用通過使用表面活性劑由于酶的作用抑制HDL3以外的脂蛋白的方法，通過測定HDL3并根據(jù)總HDL求出HDL3值的差，可以測定HDL2，但該方法不是可以直接測定HDL2的方法。[0009]必需發(fā)明簡便且可以更具選擇性地定量HDL2中膽固醇量的試劑，以代替上述的方法。[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻1:日本特開2009-207463號公報； 專利文獻2:日本特開2001-346598號公報。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的目的在于提供:不需要繁雜的操作，即可定量受檢樣品中的HDL2膽固醇的方法。[0012]發(fā)明所要解決的課題 本發(fā)明的目的在于提供:不需要繁雜的操作，即可定量受檢樣品中的HDL2膽固醇的方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供:用于利用本發(fā)明的方法來定量HDL2的試劑盒。[0013]解決課題的方法 本申請的發(fā)明人深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了磷脂酶與HDL中的HDL2作用、而幾乎不與HDL3作用的條件，找到了通過利用磷脂酶可以優(yōu)先測定HDL2的方法，實驗性地確認(rèn)了這可以實現(xiàn)，完成了本發(fā)明。[0014]即，本發(fā)明提供HDL2的膽固醇的定量方法，該方法包括:使磷脂酶與HDL作用，來定量膽固醇。另外，本發(fā)明還提供用于通過上述本發(fā)明的方法定量高密度脂蛋白2中的膽固醇的試劑盒，該試劑盒包含磷脂酶。而且，本發(fā)明還提供受檢樣品中的高密度脂蛋白2膽固醇的定量方法，該方法包括下述步驟:步驟一，使受檢樣品中的高密度脂蛋白以外的膽固醇轉(zhuǎn)移到反應(yīng)系統(tǒng)外；以及步驟二，定量反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)殘留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2膽固醇，其中，利用上述本發(fā)明的方法進行該步驟二。[0015]發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，無需超離心或前處理等繁雜的操作，可以使用自動分析裝置特異性地定量受檢樣品中的HDL2膽固醇。另外，通過由利用作為現(xiàn)有技術(shù)的受檢體中HDL總膽固醇定量法得到的總HDL膽固醇量算出HDL2膽固醇量的差，還可以定量HDL3膽固醇量。
【具體實施方式】[0016]如上所述，本發(fā)明的HDL2膽固醇的定量方法包括:使磷脂酶與HDL作用，來定量膽固醇。通過將該定量方法應(yīng)用于從自生物體內(nèi)分離的受檢樣品中預(yù)先除去HDL以外的脂蛋白中的膽固醇而得到的樣品，可以定量受檢樣品中的HDL2膽固醇。即，受檢樣品中的HDL2膽固醇的定量方法包括:步驟一，使受檢樣品中的HDL以外的膽固醇轉(zhuǎn)移到反應(yīng)系統(tǒng)外；以及步驟二，定量反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)殘留的HDL中的HDL2膽固醇，其中，作為該定量方法中的步驟二，通過采用上述本發(fā)明的方法，可以定量受檢樣品中的HDL2膽固醇。以下，對該兩步驟法進行說明。需要說明的是，在以下的說明中，雖然說明兩步驟法，但該兩步驟法的步驟二是本發(fā)明的方法(不過，該兩步驟法本身也是本發(fā)明的方法)。另外，為了進行本發(fā)明的方法，以下的步驟一不是必須的，通過利用其他公知的方法、例如超離心法等從自生物體內(nèi)分離的受檢樣品中只取出HDL，再應(yīng)用本發(fā)明的方法(下述步驟二)，也可以定量受檢樣品中的HDL2膽固醇。不過，在這種情況下，必需重新供給膽固醇的定量所必需的膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶(在以下的兩步驟法中，步驟一中使用的膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶可以繼續(xù)在步驟二中使用)。
[0017]作為供給本發(fā)明的方法的受檢樣品，只要是想要定量其樣品中的HDL2膽固醇的樣品即可，沒有特別限定，但優(yōu)選為血清或血漿或它們的稀釋物，特別優(yōu)選血清或其稀釋物。
[0018]本發(fā)明中想要測定的HDL2，是指相當(dāng)于密度d = 1.063~1.125g/mL或粒徑為
12.1~16nm的部分等在HDL中也屬于較大顆粒的HDL。但是，上述定義是指HDL的在連續(xù)范圍內(nèi)的界定，未必是根據(jù)上述數(shù)值明確地限定臨床意義。在一般的報告中，也存在著密度的界定不同的HDL，所以大致將上述范圍的大顆粒側(cè)的HDL作為HDL2。需要說明的是，當(dāng)為大顆粒側(cè)的HDL時，富含脫輔基脂蛋白E的HDL等也包含在本發(fā)明的測定范圍內(nèi)。
[0019]在本發(fā)明的步驟一中，除了向受檢樣品中添加膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶等膽固醇反應(yīng)酶，還添加磷脂酶或脂蛋白脂肪酶，使之反應(yīng)。磷脂酶、脂蛋白脂肪酶可以添加I種也可以是兩種以上組合添加。而且，在步驟一中還可以使用表面活性劑，還可以將前述的酶和表面活性劑組合使用。
[0020]在本發(fā)明方法的步驟一中，利用膽固醇酯酶等的作用，使HDL以外的脂蛋白膽固醇轉(zhuǎn)移到反應(yīng)系統(tǒng)外。這里，“轉(zhuǎn)移到反應(yīng)系統(tǒng)外”是指，通過消除或保護膽固醇及其酯，在之后的步驟中，使膽固醇及其酯不再參與。
[0021 ] 這里，“消除”是指，分解受檢樣品中的脂蛋白的膽固醇，在之后的步驟中，在膽固醇測定的反應(yīng)中使其不再產(chǎn)生作用。作為用于消除脂蛋白膽固醇的方法，可以列舉:使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶作用產(chǎn)生過氧化氫，再使用過氧化氫酶將該過氧化氫分解成水和氧的方法。另外，使用過氧化物酶，使氫供體與所產(chǎn)生的過氧化氫反應(yīng)，可以轉(zhuǎn)化成無色苯醌，但并不限于這些方法。消除膽固醇的方法本身在該領(lǐng)域中眾所周知。
[0022]“保護”是指，保護受檢樣品中的脂蛋白，在之后的步驟中，在膽固醇測定中使其不發(fā)生反應(yīng)。在保護脂蛋白方面，可以列舉:使用特異性地保護各脂蛋白使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶不發(fā)生作用的表面活性劑的方法，但并不限于這些方法。
[0023]步驟一通過事先單獨或同時添加用于使HDL以外的脂蛋白轉(zhuǎn)移到反應(yīng)系統(tǒng)外的酶系或表面活性劑，還可以將兩個步驟作為單一的步驟同時進行。
[0024]在步驟一中，使用膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶時，膽固醇酯酶的濃度(在本說明書中，只要沒有特別說明，則濃度是指終濃度)優(yōu)選0.1~10.0U/mL左右，更優(yōu)選0.2~2.0U/mL左右。膽固醇氧化酶的濃度優(yōu)選0.05~10.0U/mL左右，更優(yōu)選0.1~1.0U/mL左右。需要說明的是，膽固醇酯酶只要是與酯型膽固醇發(fā)生作用的酶即可，沒有特別限定，例如可以使用旭化成公司制的膽固醇酯酶(CEBP、CEN)或東洋紡公司制的膽固醇酯酶(C0E-311、C0E-313)或々二一 >公司制的膽固醇酯酶(CHE-XE)等的市售品。另外，膽固醇氧化酶只要是與游離型膽固醇發(fā)生作用的酶即可，沒有特別限定，例如可以使用旭化成公司制的膽固醇氧化酶(CONII)或東洋紡公司制的膽固醇氧化酶(C00-311、C00-321、C00-331)或今'7 - 一 >公司制的膽固醇氧化酶(CHO-CE、CHO-PEWL、CH0-BS)等的市售品。
[0025]使用膽固醇脫氫酶時，其濃度優(yōu)選0.01~200U/mL，進一步優(yōu)選0.1~100U/mL。需要說明的是，作為膽固醇脫氫酶，只要是具有將膽固醇氧化以還原氧化型輔酶的能力的酶即可，沒有特別限定，例如可以使用天野工 ^ A公司制的膽固醇脫氫酶(CHDH-5)等的市售品。
[0026]可以進一步添加磷脂酶或脂蛋白脂肪酶，此時，其濃度優(yōu)選0.01~0.5U/mL左右，進一步優(yōu)選0.02~0.5U/mL。脂蛋白脂肪酶、磷脂酶可以使用市售品，例如可以使用東洋紡公司制的脂蛋白脂肪酶(LPL-311或LPL-314)、天野二 > △公司制的脂蛋白脂肪酶(LPL-3等)、旭化成公司制的脂蛋白脂肪酶(LPBP或LP等)。磷脂酶例如可以使用旭化成公司制的鞘磷脂酶(SPC)或作為磷脂酶的磷脂酶A2(PLA2L)、磷脂酶D(PLD*PLDP*PLDPV)、磷脂酶C (PLC)。其中，使用鞘磷脂酶時，鞘磷脂酶的終濃度優(yōu)選0.05~50U/mL左右，更優(yōu)選0.1~30U/mL。鞘磷脂酶只要是至少與鞘磷脂發(fā)生作用的酶即可，沒有特別限定，其可以對鞘磷脂以外的作為構(gòu)成磷脂的成分的磷脂酰肌醇等具有活性。需要說明的是，在步驟一中的磷脂酶的濃度和其他條件下，鞘磷脂酶對HDL2的影響少、且可以與HDL以外的脂蛋白發(fā)生作用，因此容易將HDL以外的脂蛋白弓丨導(dǎo)到反應(yīng)系統(tǒng)外。
[0027]添加表面活性劑時，優(yōu)選以0.001~5.0重量％的濃度進行添加，更優(yōu)選0.002~
3.0重量％左右。作為表面活性劑，可以列舉:聚氧乙烯烷基醚硫酸鈉等陰離子表面活性劑；和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物、酰胺非離子、聚氧乙烯壬基苯基醚、HLB值為14~17的聚氧乙烯多環(huán)苯基醚等非離子系表面活性劑，但并不限于這些。更具體而言，可以列舉:Pluronic P123 ( 7 于.'力)、Pluronic F68 ( 7 于.'力)、Pluronic F88 ( 7 于.'力)、>《^ 一WX (花王)、非離子HS220(日油)、f ^ ^ F MT-215(日油)、Newcol-723(日本乳化劑)、Newcol-2614(日本乳化劑)、Newcol-714 (日本乳化劑)。
[0028]步驟一中使用的反應(yīng)液,可以使用普通的生化反應(yīng)中使用的各種緩沖液，優(yōu)選pH為5~8之間。作為溶液，優(yōu)選Good、Tris、磷酸、甘氨酸的緩沖溶液，優(yōu)選作為Good緩沖液的雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥乙基)甲烷(Bis-Tris)、哌嗪-1，4-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、哌嗪-1, 4-雙(2-乙磺酸)的1.5鈉鹽一水合物(PIPES1.5Na)、2_羥基-3-嗎啉代丙磺酸(M0PS0)、N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)和哌嗪-1, 4-雙(2-羥基-3-丙磺酸)(P0PS0)。
[0029]在步驟一中，為了容易區(qū)別HDL以外的脂蛋白，可以添加一價或二價的陽離子或它們的鹽。具體而言，可以使用氯化鈉、氯化鉀、氯化錳、氯化鈣、氯化銨、硫酸鎂、硫酸鉀、硫酸鋰、硫酸銨、乙酸鎂等。濃度優(yōu)選I~50.0g/L,進一步優(yōu)選5~30g/L。
[0030]步驟一的反應(yīng)溫度優(yōu)選25~40°C左右，進一步優(yōu)選35~38°C，最優(yōu)選37°C。對反應(yīng)時間沒有特別限定，通常為2~10分鐘左右。
[0031]步驟一可以在不存在表面活性劑下進行，但可以將鞘磷脂酶等酶和表面活性劑組合使用。
[0032]需要說明的是，在步驟一中，即使是表面活性劑共存的情況下，反應(yīng)條件(反應(yīng)溫度、時間、緩沖液等)也如上所述。
[0033]接著，在步驟二中，定量反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)殘留的HDL中的HDL2的膽固醇。這可以通過使磷脂酶與反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)殘留的HDL作用，優(yōu)先定量HDL2的膽固醇來進行。
[0034]步驟二中使用的磷脂酶只要至少與甘油磷脂作用即可，進一步優(yōu)選至少對磷脂酰膽堿具有活性的酶，但其可以對磷脂酰膽堿以外的溶血磷脂酰乙醇胺等、或甘油磷脂以外的鞘磷脂或神經(jīng)酰胺等具有活性。磷脂酶可以使用市售品，具體而言，可以使用旭化成公司制的磷脂酶A2 (PLA2L)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D (PLD或PLDP或PLDPV)、溶血磷脂酶(LYPL)，但特別優(yōu)選磷脂酶C和磷脂酶D。
[0035]在步驟二中使用磷脂酶時，可以將I種或兩種以上的磷脂酶組合起來使之作用，濃度(兩種以上組合時是指其終濃度)優(yōu)選0.5~200U/mL，進一步優(yōu)選1.0~100U/mL，更進一步優(yōu)選3.0~50U/mL。在步驟一中使用磷脂酶時,在步驟二中使用步驟一中使用的濃度以上的濃度。
[0036]在步驟二中，利用磷脂酶等的作用來定量膽固醇。膽固醇的定量方法本身眾所周知，還可以采用眾所周知的任一種方法，在下述實施例中也有具體的記載。例如，在脂蛋白中的酯型膽固醇中使用膽固醇酯酶進行水解，生成游離型膽固醇和脂肪酸，使用膽固醇氧化酶使所產(chǎn)生的游離型膽固醇和本來脂蛋白中存在的游離膽固醇產(chǎn)生膽留烯酮和過氧化氫，使其在過氧化物酶的存在下形成苯醌色素，進行定量。作為產(chǎn)生苯醌色素的化合物，例如可以列舉HDAOS (N- (2-羥基-3-磺丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺)、DA0S (N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)_3，5-二甲氧基苯胺)或TOOS (N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)和4-氨基安替比林，但只要是可以產(chǎn)生苯醌色素的組合即可，并不限于這些。在步驟一中使用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶時，在步驟二中可以直接使用步驟一中使用的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，不必重新添加。
[0037]作為與膽固醇反應(yīng)的膽固醇測定用酶，使用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶時,通過酶反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫。由產(chǎn)生的過氧化氫在過氧化物酶的存在下、通過氫供體與氫受體的偶聯(lián)反應(yīng)形成色素，測定該色素 在波長400~700nm下的吸光度，從而可以定量HDL2中的膽固醇。
[0038]作為與膽固醇反應(yīng)的膽固醇測定用酶,使用膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶時,通過酶反應(yīng)，由NAD (P)產(chǎn)生NAD (P) H。通過測定所產(chǎn)生的NAD (P) H在波長330~400nm下的吸光度，可以定量HDL2中的膽固醇。
[0039]關(guān)于產(chǎn)生苯醌色素的化合物的濃度，例如，當(dāng)為HDAOS時，濃度優(yōu)選0.5~
2.0mmol/L左右；當(dāng)為4-氨基安替比林時，濃度優(yōu)選0.1~2.0mmol/L，另外，過氧化物酶的濃度優(yōu)選0.4~5.0U/mL。另外，在用過氧化氫酶分解步驟一中產(chǎn)生的過氧化氫的步驟中，使用作為過氧化氫酶抑制劑的疊氮化鈉，將其添加在步驟二的反應(yīng)液中。此時疊氮化鈉的濃度通常為0.lg/L~1.0g/L左右。
[0040]在步驟一中使用過氧化物酶時，過氧化物酶的濃度優(yōu)選2.0~5.0U/mL左右，進一步優(yōu)選3.0~4.0U/mL。另外，使用轉(zhuǎn)化成無色苯醌的化合物時，其濃度優(yōu)選0.4~
0.8mmol/L 左右。
[0041]在步驟二中，表面活性劑的存在不是必須的，可以添加也可以不添加。添加表面活性劑時，可以在步驟一的相同濃度或其以下的范圍內(nèi)添加步驟一中可以使用的表面活性劑。
[0042]步驟二的其他反應(yīng)條件(反應(yīng)溫度、時間、緩沖液、pH等)可以和上述步驟一的反應(yīng)條件相同。
[0043]在截止到上述的步驟一和步驟二中測定HDL2膽固醇的方法，可以以包含上述各試劑的試劑盒的形式進行組合。
[0044]而且，還可以根據(jù)受檢樣品中的HDL膽固醇量算出由步驟一和步驟二得到的HDL2膽固醇量之差，求出受檢樣品中的HDL3膽固醇量。計算受檢樣品中的HDL膽固醇量的方法眾所周知(例如日本特開2001-103998號公報)，用于該方法的試劑盒也有銷售，所以使用它們可以容易地進行定量。
[0045]以下，根據(jù)實施例來更具體地說明本發(fā)明。不過，本發(fā)明并不限于下述實施例。
[0046]實施例1 利用超離心法回收HDL2和HDL3，以下述制備試劑A作為步驟一、以制備試劑I作為步驟二，組合進行反應(yīng)，通過在步驟二中使用磷脂酶D，確認(rèn)與HDL3相比是否特異性地與HDL2進行反應(yīng)。即，該方法具體如下進行。超離心法是指，通過使用溴化鈉溶液等，利用血清等受檢樣品的脂蛋白的密度差，制備CM、LDL、HDL2、HDL3等各組分的方法。在本專利的實施例中，HDL2組分是指包含密度d = 1.063~1.125g/mL的密度范圍內(nèi)的脂蛋白的組分，而HDL3組分是指包含密度d = 1.125~1.210g/mL的密度范圍內(nèi)的脂蛋白的組分。測定中，將150// L步驟一用制備試劑與2// L超離心組分混合，在37°C下反應(yīng)5分鐘，之后以50// L的比例混合步驟二用制備試劑，在37°C下反應(yīng)5分鐘。波長使用600nm的主波長、700nm的副波長。
[0047]通過用HDL3的吸光度除所測定的HDL2的吸光度，算出HDL2與HDL3的反應(yīng)性的倍率，與使用HDL試劑進行測定的情形進行比較。結(jié)果見表1。在本實施例中，HDL試劑使用HDL-EX DENKA生研公司制的試劑。
[0048]制備試劑A
BES 緩沖液IOOninio 1/L pH6,6
HOAOS0'7minc>l./L
過氣化IlSI600U/1HL
氯化鈉丨g/L
膽固醇釀丨,4 U / inL
膽固醇氧化綠 ().8Ij/inL
Pliironic F680,2g/L
制備試劑I
BES 緩沖液10()m?iol/L pH7i)
疊1化鈉0.m
4-氣基安替比林 4.0mmol/l,
過氣化物i|IAWmL
磷脂綠 D(PLDP) LOUZinL
[表1]
【權(quán)利要求】
1.高密度脂蛋白2中的膽固醇的定量方法，該方法包括:使磷脂酶與高密度脂蛋白作用，來定量膽固醇。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述磷脂酶至少對磷脂酰膽堿具有反應(yīng)性。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，上述磷脂酶為磷脂酶C和/或磷脂酶D。
4.權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中，上述磷脂酶的濃度為0.1~200U/mL。
5.試劑盒，其用于通過權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法定量高密度脂蛋白2中的膽固醇，該試劑盒中包含磷脂酶。
6.受檢樣品中的高密度脂蛋白2膽固醇的定量方法，該方法包括:步驟一，使受檢樣品中的高密度脂蛋白以外的膽固醇轉(zhuǎn)移到反應(yīng)系統(tǒng)外；以及步驟二，定量反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)殘留的高密度脂蛋白中的高密度脂蛋白2膽固醇，其中，利用上述權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法進行該步 驟二。
【文檔編號】C12Q1/44GK103608465SQ201280020681
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月28日
【發(fā)明者】樋口麻衣子, 伊藤康樹 申請人:電化生研株式會社