專利名稱：一種核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其是涉及一種核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組I基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組I (excision repair cross complementing 1，ERCC1)是核苷酸剪切修復(fù)家族中的一個(gè)重要成員，定位于19號(hào)染色體上，基因全長(zhǎng)
15X 103bp，含10個(gè)外顯子，編碼297個(gè)氨基酸的蛋白，ERCCl基因的表達(dá)產(chǎn)物與DNA修復(fù)酶缺乏互補(bǔ)基因F(XPF)形成緊密的異二聚體(ERCC1-XPF)，該二聚體是一個(gè)特異性的連結(jié)5'端的核酸內(nèi)切酶，具有損傷識(shí)別和切除5'端的雙重作用，ERCCl在NER中起到限速或調(diào) 節(jié)作用。核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)是細(xì)胞內(nèi)最重要的修復(fù)方式，能修復(fù)外因?qū)е碌腄NA損傷，在維持基因組功能完整性、抗癌過(guò)程中起到極為重要的作用。NER的修復(fù)通過(guò)切除藥物或者紫外線等損傷的DNA而形成的DNA加合物，以互補(bǔ)鏈為模板復(fù)制并修復(fù)損傷DNA來(lái)維護(hù)基因組的完整性。而DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)有時(shí)是引起腫瘤細(xì)胞耐藥的一個(gè)重要因素。ERCCl修復(fù)作用呈現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，ERCCl基因在118位密碼子有一個(gè)C — T的突變，從而影響ERCCl蛋白的表達(dá)水平。許多研究指出118C/T單核苷酸多態(tài)可能與鉬類化療藥耐藥相關(guān)，抑制ERCCl的表達(dá)可克服鉬類耐藥性，提高治療效果。鉬類藥物是最常用的腫瘤化療藥物之一，包括順鉬、卡鉬和奧沙利鉬等。其藥理學(xué)機(jī)制主要是通過(guò)引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA的交聯(lián)，阻礙DNA合成與復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。DNA修復(fù)是鉬類藥物耐藥性產(chǎn)生的主要原因。ERCCl在所有的腫瘤細(xì)胞中都存在表達(dá)，而且表達(dá)水平差異很大。臨床研究已證實(shí)ERCCl參與鉬類藥物耐藥的發(fā)生，其表達(dá)水平與多種腫瘤鉬類藥物化療的療效和生存期呈負(fù)相關(guān)，即表達(dá)水平低的患者對(duì)鉬類藥物敏感，反之表達(dá)水平高的患者則耐藥。美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)(第二版，2010)中明確指出在接受鉬類藥物化療前進(jìn)行ERCCl基因水平的表達(dá)檢測(cè)。因此，化學(xué)致癌物代謝酶，即藥物代謝酶基因表達(dá)檢測(cè)尤其是ERCCl基因表達(dá)的檢測(cè)對(duì)于腫瘤病人的個(gè)體化用藥及腫瘤發(fā)病機(jī)制研究至關(guān)重要。但目前臨床檢測(cè)ERCCl基因表達(dá)的檢測(cè)試劑原料需多方配備，實(shí)驗(yàn)過(guò)程分布進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)，容易污染，所以探索一種檢測(cè)ERCCl基因表達(dá)快速可靠的方法已經(jīng)成為臨床試驗(yàn)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

實(shí)用新型內(nèi)容為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本實(shí)用新型提供一種核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組I基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒，包括盒體I、盒蓋2、固定座3、引物試劑瓶4、SYBR premix Ex Taq(含ROX)試劑瓶5、去離子水試劑瓶6、固定座3上設(shè)置有Eppendorf管7、加樣器吸頭8。進(jìn)一步地，所述固定座3還設(shè)置有孔9和空格10?？?設(shè)置用來(lái)分別將Eppendorf管7、加樣器吸頭8固定，以防止遺撒?？?的形狀依據(jù)不同Eppendorf管7、加樣器吸頭8的形狀和大小而設(shè)置。空格10設(shè)置用來(lái)將引物試劑瓶4、SYBR premix Ex Taq試劑瓶5、去離子水試劑瓶6固定。所述引物包括擴(kuò)增引物和白蛋白內(nèi)參。其中，擴(kuò)增引物為特異性擴(kuò)增 ERCCl 的引物，上游引物序列為 5 ' -GAAGTCAGTCAACAAAACGGACAGT-3 '；下游引物序列為5 ' -TGGGCATAAGGCCAGATCTT-3 '，白蛋白內(nèi)參上游引物序列為5' -TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3，下游引物序列為5' -CAGCCTGGATAGCAACGTACA-3。引物濃度為10uM。 所述SYBR premix Ex Taq(含 ROX) (2*Conc.)含有 0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L的 Mg2+，2xBuffer，lU/20ii I 的 Ex Taq HS, 1U/20 u I Tli RnaseH, lmmol/L SYBR Green 1，0. lmmol/L ROX Reference Dye。本實(shí)用新型與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，具有如下積極有益的效果本試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理、使用方便、制造容易、檢測(cè)過(guò)程不易受污染；本試劑盒在檢測(cè)核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組I基因表達(dá)時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。

圖I為本實(shí)用新型的整體結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。表I為本實(shí)用新型PCR反應(yīng)體系。如圖I所示，本實(shí)用新型的一個(gè)實(shí)施例為核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組I基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒，包括盒體I、盒蓋2、固定座3、引物試劑瓶4、SYBR premixEx Taq(含R0X)試劑瓶5、去離子水試劑瓶6、固定座3上設(shè)置有Eppendorf管7、加樣器吸頭8。固定座3還設(shè)置有孔9和空格10?？?設(shè)置用來(lái)分別將Eppendorf管7、加樣器吸頭8固定，以防止遺撒?？?的形狀依據(jù)不同Eppendorf管7、加樣器吸頭8的形狀和大小而設(shè)置?？崭?0設(shè)置用來(lái)將引物試劑瓶4、SYBR premix Ex Taq試劑瓶5、去離子水試劑瓶6固定。所述引物包括擴(kuò)增引物和白蛋白內(nèi)參。其中，擴(kuò)增引物為特異性擴(kuò)增 ERCCl 的引物，上游引物序列為 5 ' -GAAGTCAGTCAACAAAACGGACAGT-3 '；下游引物序列為5 ' -TGGGCATAAGGCCAGATCTT-3 '，白蛋白內(nèi)參上游引物序列為5 ' -TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3 '，下游引物序列為5 ' -CAGCCTGGATAGCAACGTACA-3 '。引物濃度為10uM。所述SYBR premix Ex Taq(含 ROX) (2*Conc.)含有 0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L的 Mg2+，2xBuffer，lU/20ii I 的 Ex Taq HS, 1U/20 u I Tli RnaseH, lmmol/L SYBR Green 1，0. lmmol/L ROX Reference Dye。[0020]操作方法I)制備模板新鮮組織或石蠟組織，常規(guī)提取RNA，并及時(shí)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。2)反應(yīng)體系將各反應(yīng)物質(zhì)按照如下表I中反應(yīng)體系進(jìn)行配比表I
權(quán)利要求1.一種核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組I基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括盒體(I)、盒蓋⑵、固定座(3)、引物試劑瓶(4),SYBR premix Ex Taq(ROX)試劑瓶(5)、去離子水試劑瓶(6)、固定座(3)上設(shè)置有Eppendorf管(7)、加樣器吸頭(8)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組I基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述固定座(3)還設(shè)置有孔(9)和空格(10)。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)一種核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒，包括盒體1、盒蓋2、固定座3、引物試劑瓶4、SYBR premix Ex Taq(含ROX)試劑瓶5、去離子水試劑瓶6、Eppendorf管7、加樣器吸頭8、孔9、空格10。本試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)合理、使用方便、制造容易、檢測(cè)過(guò)程不易受污染；本試劑盒在檢測(cè)核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)組1基因表達(dá)時(shí)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202519262SQ201220162900

公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 路平, 馬蓉 申請(qǐng)人:馮繼鋒, 吳建中, 唐金海, 路平, 馬蓉