專利名稱：一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)dha的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，特別涉及一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法。
背景技術(shù)：
二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid, 22:6 A 4, 7, 10, 13, 16, 19,簡稱 DHA)俗稱“腦黃金”，屬于《_3型多不飽和脂肪酸，具有補腦健腦，預(yù)防老年性癡呆癥；提高視力，防治近視；預(yù)防高血壓、動脈硬化、關(guān)節(jié)炎及治療癌癥等生理功能。因此，DHA作為新一代功能性保健因子具有廣闊的市場前景。隨著市場需求量的擴(kuò)大，對DHA品質(zhì)的要求也越來越高，DHA生產(chǎn)研究逐漸向利用生物技術(shù)合成方向發(fā)展，傳統(tǒng)魚油來源的DHA已逐漸被藻油DHA所取代。藻油DHA是指通過微生物發(fā)酵獲得的含有DHA等長鏈多不飽和脂肪酸的油脂，其中DHA生產(chǎn)菌主要有裂殖壺菌、破囊壺菌、隱甲藻等。裂殖壺菌又稱裂壺藻，屬于真菌門、卵菌綱、水霉目、破囊壺菌科的一類類藻的海洋真菌，單細(xì)胞、球形。細(xì)胞累積大量對人體有用的活性物質(zhì)，如油脂、色素(類胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素)、角鯊烯等，其中總脂肪酸中DHA含量高達(dá)35% 45%，且細(xì)胞中90%以上的油脂以人體易吸收的中性油脂——甘油三酯形式存在，是DHA的理想生產(chǎn)菌株。中國專利CN101575584公開一種裂殖弧菌及利用其生產(chǎn)DHA油脂的方法，該方法提供一種從滲透壓和元素供應(yīng)角度優(yōu)化菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，并結(jié)合流加策略，實現(xiàn)裂殖壺菌高密度發(fā)酵，采用傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，從甘油保存種接入搖瓶活化一一級種子液一搖瓶二級種子液一一級種子罐一二級種子罐一發(fā)酵，最終細(xì)胞干重達(dá)到70g/L，油脂含量達(dá)31.5g/L，DHA占總脂肪酸含量高于35%。中國專利CN101519676公開一種采用含微量元素的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)DHA的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，采用傳 統(tǒng)方法培養(yǎng)菌種裂殖壺菌，即斜面活化培養(yǎng)、然后轉(zhuǎn)接入搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、再經(jīng)一級擴(kuò)大培養(yǎng)得到發(fā)酵用種子液；或菌種經(jīng)斜面活化培養(yǎng)、然后轉(zhuǎn)接入搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)、再經(jīng)一級擴(kuò)大培養(yǎng)和二級擴(kuò)大培養(yǎng)后得到發(fā)酵用種子液，IOT罐發(fā)酵95h生物量為53g/L，油脂含量72%，DHA含量50%。而傳統(tǒng)的種子培養(yǎng)和發(fā)酵方法涉及的發(fā)酵級數(shù)較多，工藝較繁瑣，培養(yǎng)周期長，投資成本高。因此，改進(jìn)種子制備方式，簡化擴(kuò)種工藝，降低生產(chǎn)成本，有利于DHA的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供可簡化擴(kuò)種工藝，縮短種子培養(yǎng)和發(fā)酵周期，減少投資，節(jié)約成本，固料培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，富含多種生長因子，更利于種子的生長，菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)、同步性較好，培養(yǎng)固料種子階段產(chǎn)生的廢水、廢渣少，環(huán)境污染小的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法。本發(fā)明米用的菌種為裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)KDff-12,已于2012年11月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCN0.6843，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編為100101。
本發(fā)明包括如下步驟:
I)菌種活化與菌懸液制備:將裂殖壺菌菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化,培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液；
在步驟I)中，所述斜面培養(yǎng)基的配方可為:葡萄糖20 30g/L,蛋白胨10 15g/L，酵母粉3 5g/L，海水晶15 20g/L，瓊脂粉20g/L，pH值6 7，121°C滅菌30min ;所述培養(yǎng)活化的溫度可為25 28°C，培養(yǎng)活化的時間可為2 3天；所述菌懸液的菌體濃度可為 1.0 2.5 X IO6 個/mL。
2)—級種子制備:將步驟I)獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種至固料培養(yǎng)基上培養(yǎng)，制成一級固料種子；或
將步驟I)獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種至液體種子培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)，制成一級液體種子；
在步驟2)中，所述固料培養(yǎng)基包括固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分，所述固態(tài)組分為谷物，含量為250 400g/L，所述谷物可選自米類、麥類和玉米等中的至少一種，所述米類可選自大米、小米、糙米等中的至少一種，所述麥類可選自大麥、小麥、燕麥等中的至少一種；
所述液體營養(yǎng)液組分包括組分I和組分2，所述組分I的組成為:葡萄糖2 5g/L,七水硫酸鎂0.2 0.6g/L，磷酸氫二鉀1.0 5.0g/L,海鹽0.1 0.8g/L，甘氨酸0.2 0.6g/L,蘇氨酸1.5 1.8g/L,蛋氨酸2 3.5g/L,蘋果酸3 6g/L,加水定容,調(diào)節(jié)pH值為 6 7 ;所述組分 2 的組成為:La3+10 15mg/L, Ce3+I 4mg/L, Sm3+2 6mg/L, Nd3+8 12mg/L, Mn2+0.6 1.2mg/L, Co2+0.05 0.lmg/L,生物素 0.2 0.6mg/L,淺藍(lán)菌素 0.1 0.3mg/L，赤霉素 GA2 5mg/L, VB120.5 1.0mg/L,葉酸 0.01 0.05mg/L,余量為水；
所述固料培養(yǎng)基的制備方法可為:固態(tài)組分與液體營養(yǎng)液組分I混合均勻，將谷物蒸或煮至谷物中心無白心，且含水率為50% 65%，獲得固料培養(yǎng)基原料；將固料培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2混合均勻，裝于固態(tài)發(fā)酵K瓶中，厚度0.2 1.0cm, 121°C滅菌30min，制得固料培養(yǎng)基；
所述固態(tài)組分與液 體營養(yǎng)液組分I按質(zhì)量/體積的配比可為(5 10) g: (2 5)mL，其中固態(tài)組分按質(zhì)量計算，液體營養(yǎng)液組分I按體積計算；
所述固料培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按質(zhì)量/體積的配比可為(10 15)g:(3 6)mL，其中固料培養(yǎng)基原料按質(zhì)量計算，液體營養(yǎng)液組分2按體積計算；
所述液體種子培養(yǎng)基的組成可為:葡萄糖20 25g/L，氯化鈉20 25g/L，磷酸二氫鉀0.2 0.5g/L，酵母粉3 5g/L，七水硫酸鎂8 12g/L，海鹽0.1 0.8g/L，谷氨酸0.2 0.6g/L, pH 值 6 7，121°C滅菌 30min ；
所述培養(yǎng)的溫度可為25 28°C，培養(yǎng)的時間可為I天；所述搖瓶的轉(zhuǎn)速可為180 220rpm ;搖瓶培養(yǎng)的溫度可為25 28°C，搖瓶培養(yǎng)的時間可為I天。
3) 二級固料種子的制備:一級固料種子以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水根據(jù)I: I (ff/ν)比例洗滌菌體，制成菌懸液；
在無菌條件下:
按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 20%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級固料種子液；或
按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8% 15%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級液體種子，搖動K瓶混合均勻，25 28°C，培養(yǎng)2 3天；制得二級固料種子；4) 二級固料種子發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng):二級固料種子加入1:3 5 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 20%的接種量接種至發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵前48h溫度控制在25 28°C，利用攪拌轉(zhuǎn) 速保持30% 50%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在18 22°C，發(fā)酵3 5天，通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.0 6.5，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在4 8g/L ；在步驟4)中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可為:葡萄糖30 60g/L, NaCl 15 20g/L, MgSO4.7H204 8g/L,酵母粉 3 8g/L, KH2PO40.5 1.0g/L,(NH4)2SO40.2 0.5g/L, NaHCO30.8 1.2g/L, CoCl2L 0 ~ 2.0 u g/L, MnSO40.5 1.0 y g/L，VB10.05 0.lmg/L, VB120.001 0.01mg/L，初始pH6.0 7.0 ;所述發(fā)酵最好溶氧維持在8% 12%。5)發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體細(xì)胞，提取DHA油脂。經(jīng)測定，發(fā)酵液中細(xì)胞干重達(dá)105 160g/L，DHA含量達(dá)20 35g/L。本發(fā)明還適用于除裂殖壺菌(Schizochytrium sp.) KDW-12以外的其它裂殖壺菌種屬的生產(chǎn)，包括可以從美國典型培養(yǎng)物收集中心、日本大阪發(fā)酵工程研究所等保藏機(jī)構(gòu)獲得的裂殖壺菌菌種。本發(fā)明摒棄傳統(tǒng)的種子培養(yǎng)工藝流程，直接由固料發(fā)酵獲得的種子液進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng):斜面活化一一級固料種子/搖瓶液體種子一二級固料種子液一液體發(fā)酵。本發(fā)明改進(jìn)種子制備方式，簡化擴(kuò)種工藝，縮短種子培養(yǎng)和發(fā)酵周期，可減少投資，節(jié)約成本；同時固料培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，富含多種生長因子，更利于種子的生長，菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)、同步性較好；培養(yǎng)固料種子階段產(chǎn)生的廢水、廢渣少，環(huán)境污染小。本發(fā)明的有益效果是:克服傳統(tǒng)發(fā)酵方法種子擴(kuò)培級數(shù)較多的缺陷，改進(jìn)DHA發(fā)酵用種子液的制備，可簡化DHA生產(chǎn)工藝過程；固料培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，種子飽滿活力強(qiáng)，可縮短種子上罐后延遲期，提高DHA產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力；培養(yǎng)固料種子階段產(chǎn)生的廢水、廢渣少，環(huán)境污染??；發(fā)酵得到的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例中用到的菌種為:裂殖壺菌(Schizochytriumsp.) KDff-12 (CGMCCN0.6843)；裂殖壺菌(Schizochytriumsp.) S31 (ATCC N0.20888)裂殖壺菌(Schizochytriumsp.) S8 (ATCC N0.20889)裂殖壺菌Schizochytrium aggregatum(ATCC N0.28209)實施例1:將裂殖壺菌(Schizochytrium sp.) KDW-12菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，溫度為25°C，培養(yǎng)2天。斜面培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，酵母粉3，海水晶15，瓊脂粉20，pH值6.5，121 °C滅菌30min。培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液，控制菌體濃度為2.5 X IO6個/mL。
獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量直接接種至滅菌的固料培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)I天，制得一級固料種子。
在無菌條件下，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級固料種子(用于接種的一級固料種子以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水根據(jù)1:1(W/V)比例洗滌菌體，制成菌懸液)，搖動K瓶混合均勻，25°C，培養(yǎng)2.5天，制得二級固料種子。
二級固料種子加入1:4 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的接種量接種至50L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接后體積32L。發(fā)酵前48h溫度控制在25°C，利用攪拌轉(zhuǎn)速保持40%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在22°C，溶氧維持在10%左右，發(fā)酵4天。通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.5，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在8g/L。
固料培養(yǎng)基的制備方法為:由固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分組成，其中固態(tài)組分為小米，含量為375g/L，小米與液體營養(yǎng)液組分I按8:3 (W/V)比例混合均勻，將谷物蒸煮至谷物中心無白心，且含水率為55%，獲得固料培養(yǎng)基原料。固料培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按10:3 (W/V)比例混合均勻，裝于固態(tài)發(fā)酵K瓶中，厚度0.3挪，1211:滅菌301^11，制得固料培養(yǎng)基。
液體營養(yǎng)液組分I (g/L):葡萄糖3，七水硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀3.0,海鹽0.6，甘氨酸0.6，蘇氨酸1.5，蛋氨酸2，蘋果酸4，加水定容至所需體積，調(diào)節(jié)pH值6.5。組分2(mg/L):La3+15，Ce3+2，Sm3 +3，Nd3+8，Mn2+L O, Co2+0.08，生物素 0.2，淺藍(lán)菌素 0.1，赤霉素 GA5，VB12LO,葉酸0.03，余量為水。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖30g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H205g/L,酵母粉3g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.4g/L, NaHCO3L 2g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO40.7 μ g/L, VB10.06mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.5。
發(fā)酵結(jié)束，收集菌體細(xì)胞，測定發(fā)酵液中細(xì)胞干重達(dá)125g/L，DHA含量達(dá)25g/L。提取的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。
實施例2:
將裂殖壺菌(Schizochytrium sp.) KDW-12菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，溫度為28°C，培養(yǎng)2天。斜面培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖25，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶16，瓊脂粉20，pH值6.0，121°C滅菌30min。培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液，控制菌體濃度為1.0 X IO6個/mL。
獲得的菌懸液直接接種至搖瓶液體培養(yǎng)基上，接種量1%，搖瓶轉(zhuǎn)速220rpm，28°C培養(yǎng)I天，制得一級液體種子。搖瓶液體種子培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖25，氯化鈉20，磷酸二氫鉀0.2，酵母粉5，七水硫酸鎂10，海鹽0.4，谷氨酸0.4，pH值6.0，121°C滅菌30min。
在無菌條件下，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級液體種子，搖動K瓶混合均勻，26°C，培養(yǎng)3天，制得二級固料種子。
二級固料種子加入1:3 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的接種量接種至100L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接后體積60L。發(fā)酵前48h溫度控制在28°C，保持30%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在18°C，溶氧維持在10%左右。發(fā)酵5天。通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.0，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在7g/L。固料培養(yǎng)基的制備方法為:由固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分組成，其中固態(tài)組分為小米，含量為300g/L，小米與液體營養(yǎng)液組分I按8:3 (W/V)比例混合均勻，將谷物蒸煮至谷物中心無白心，且含水率為60%，培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按10:4 (W/V)比例混合均勻，裝于固態(tài)發(fā)酵K瓶中，厚度0.5cm，121°C滅菌30min，制得固料培養(yǎng)基。液體營養(yǎng)液組分I (g/L):葡萄糖5，七水硫酸鎂0.4，磷酸氫二鉀2.0，海鹽0.5，甘氨酸0.3，蘇氨酸1.5，蛋氨酸3.5，蘋果酸6，加水定容至所需體積,調(diào)節(jié)pH值6.0。組分2(mg/L):La3+10，Ce3+4，Sm3+5，Nd3+9，Mn2+0.8，Co2+0.06，生物素 0.2，淺藍(lán)菌素 0.1，赤霉素 GA2，VB120.8，葉酸0.03，余量為水。液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖40g/L，NaC115g/L, MgSO4.7H204g/L,酵母粉5g/L，KH2PO40.5g/L, (NH4)2SO40.2g/L, NaHCO30.8g/L, CoCl2L 5 u g/L, MnSO4L 0 u g/L, VB10.lmg/L,VB120.01mg/L，初始 pH6.0。發(fā)酵結(jié)束，收集菌體細(xì)胞，測定發(fā)酵液中細(xì)胞干重達(dá)159g/L，DHA含量達(dá)34.5g/L。提取的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。實施例3:將裂殖壺菌(Schizochytrium sp.) KDW-12菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，溫度為28°C，培養(yǎng)3天。斜面培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖30，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶15，瓊脂粉20，pH值6.5，121 °C滅菌30min。培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液，控制菌體濃度為2.0 X IO6個/mL。獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1`%的接種量直接接種至搖瓶液體培養(yǎng)基上，搖瓶轉(zhuǎn)速220rpm，28°C培養(yǎng)I天，制得一級液體種子。搖瓶液體種子培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，氯化鈉22，磷酸二氫鉀0.2，酵母粉3，七水硫酸鎂10，海鹽0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121°C滅菌30min。在無菌條件下，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級液體種子，搖動K瓶混合均勻，26°C，培養(yǎng)3天，制得二級固料種子。二級固料種子加入1:3 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的接種量接種至100L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接后體積60L。發(fā)酵前48h溫度控制在25°C，保持30%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在20°C，溶氧維持在10%左右。發(fā)酵5天。通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.0，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在8g/L。固料培養(yǎng)基的制備方法為:由固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分組成，其中固態(tài)組分為小麥，含量為350g/L，小麥與液體營養(yǎng)液組分I按10:4 (W/V)比例混合均勻，將谷物蒸煮至谷物中心無白心，且含水率為55%，培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按15:4 (W/V)比例混合均勻，裝于固態(tài)發(fā)酵K瓶中，厚度0.7cm，121 °C滅菌30min，制得固料培養(yǎng)基。液體營養(yǎng)液組分I (g/L):葡萄糖3.5，七水硫酸鎂0.3，磷酸氫二鉀3.0，海鹽0.4，甘氨酸0.5,蘇氨酸1.6,蛋氨酸3.5,蘋果酸5,加水定容至所需體積,調(diào)節(jié)pH值6.0。組分2 (mg/L):La3+12，Ce3+4, Sm3+5, Nd3+8, Mn2+0.9，Co2+0.08，生物素 0.4，淺藍(lán)菌素 0.1，赤霉素GA3，VB120.8，葉酸0.02，余量為水。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖40g/L，NaC116g/L, MgSO4.7H206g/L,酵母粉4g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.5g/L, NaHCO3L 2g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO4L 0 μ g/L, VB10.05mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.0。
發(fā)酵結(jié)束，收集菌體細(xì)胞，測定發(fā)酵液中細(xì)胞干重達(dá)132g/L，DHA含量達(dá)30.5g/L。提取的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。
實施例4:
將裂殖壺菌(Schizochytrium sp.S31) (ATCC N0.20888)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，溫度為28°C，培養(yǎng)2天。斜面培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖30，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶15，瓊脂粉20，pH值6.5，121°C滅菌30min。培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液，控制菌體濃度為1.5 X IO6個/mL。
獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量直接接種至搖瓶液體培養(yǎng)基上，搖瓶轉(zhuǎn)速200rpm，28°C培養(yǎng)I天，制得一級液體種子。搖瓶液體種子培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖20，氯化鈉22，磷酸二氫鉀0.2，酵母粉5，七水硫酸鎂12，海鹽0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121°C滅菌30min。
在無菌條件下，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級液體種子，搖動K瓶混合均勻，26°C，培養(yǎng)2天，制得二級固料種子。
二級固料種子加入1:3 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的接種量接種至100L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接后體積60L。發(fā)酵前48h溫度控制在25°C，保持30%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在20°C，溶氧維持在10%左右。發(fā)酵4.5天。通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.0，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在6g/L。
固料培養(yǎng)基的制備方法為:由固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分組成，其中固態(tài)組分為小米，含量為350g/L，小米與液體營養(yǎng)液組分I按10:4 (W/V)比例混合均勻，將谷物蒸煮至谷物中心無白心，且含水率為55%，培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按10:4 (W/V)比例混合均勻，裝于固態(tài)發(fā)酵K瓶中，厚度0.3cm，121 °C滅菌30min，制得固料培養(yǎng)基。
液體營養(yǎng)液組分I (g/L):葡萄糖3，七水硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀5.0，海鹽0.8，甘氨酸0.2，蘇氨酸1.6，蛋氨酸3.5，蘋果酸3，加水定容至所需體積,調(diào)節(jié)pH值6.0。組分2(mg/L):La3+15, Ce3+4, Sm3+5, Nd3+IO,Mn2+0.9, Co2+0.1,生物素 0.4,淺藍(lán)菌素 0.2,赤霉素 GA2,VB12LO,葉酸0.02，余量 為水。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖40g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H206g/L,酵母粉4g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.5g/L, NaHCO30.8g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO40.5 μ g/L, VB10.05mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.0。
發(fā)酵結(jié)束，收集菌體細(xì)胞，測定發(fā)酵液中細(xì)胞干重達(dá)115g/L，DHA含量達(dá)22.7g/L。提取的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。
實施例5:
將裂殖壺菌(Schizochytrium sp.S8) (ATCC20889)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，溫度為28°C，培養(yǎng)2天。斜面培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨12，酵母粉3，海水晶20，瓊脂粉20，pH值6.5，121°C滅菌30min。培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液，控制菌體濃度為2.5 X IO6個/mL。
獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量直接接種至搖瓶液體培養(yǎng)基上，搖瓶轉(zhuǎn)速220rpm，28°C培養(yǎng)I天，制得一級液體種子。搖瓶液體種子培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖25，氯化鈉22，磷酸二氫鉀0.5，酵母粉5，七水硫酸鎂12，海鹽0.3，谷氨酸0.6，pH值6.5，121°C滅菌30min。在無菌條件下，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級液體種子，搖動K瓶混合均勻，28°C，培養(yǎng)3天，制得二級固料種子。二級固料種子加入1:4 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的接種量接種至1000L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接后體積600L。發(fā)酵前48h溫度控制在28°C，保持30%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在20°C，溶氧維持在10%左右。發(fā)酵5天。通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.5，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在8g/L。固料培養(yǎng)基的制備方法為:由固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分組成，其中固態(tài)組分為大米，含量為300g/L，大米與液體營養(yǎng)液組分I按8:5 (W/V)比例混合均勻，將谷物蒸煮至谷物中心無白心，且含水率為50%，培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按15:3 (W/V)比例混合均勻，厚度0.5cm。液體營養(yǎng)液組分I (g/L):葡萄糖3，七水硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀5.0，海鹽0.8，甘氨酸0.2，蘇氨酸1.6，蛋氨酸3.5，蘋果酸3，加水定容至所需體積,調(diào)節(jié)pH值6.0。組分2(mg/L):La3+15,Ce3+4,Sm3+5, Nd3+IO,Mn2+L 2, Co2+0.1,生物素 0.4,淺藍(lán)菌素 0.2,赤霉素 GA2,VB12LO,葉酸0.02，余量為水。液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖40g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H206g/L,酵母粉4g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.5g/L, NaHCO30.8g/L, CoC122.0 u g/L, MnSO40.5 u g/L, VB10.05mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.5。發(fā)酵結(jié)束，收集菌體細(xì)胞，測定發(fā)酵液中細(xì)胞干重達(dá)138g/L，DHA含量達(dá)31.6g/L。提取的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。實施例6:將裂殖壺菌(Schizochytrium aggregatum) (ATCC28209)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，溫度為25°C，培養(yǎng)2天。斜面培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，酵母粉3，海水晶15，瓊脂粉20，pH值6.5，121°C滅菌30min。培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為
0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液，控制菌體濃度為2.5 X IO6個/mL。獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量直接接種至滅菌的固料培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)I天，制得一級固料種子。在無菌條件下，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級固料種子(用于接種的一級固料種子以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水根據(jù)1:1(W/V)比例洗滌菌體，制成菌懸液)，搖動K瓶混合均勻，25°C，培養(yǎng)3天，制得二級固料種子。二級固料種子加入1:4 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的接種量接種至1000L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，接后體積600L。發(fā)酵前48h溫度控制在28°C，保持40%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束 溫度控制在18°C，溶氧維持在10%左右。發(fā)酵5天。通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.5，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在8g/L。
固料培養(yǎng)基的制備方法為:由固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分組成，其中固態(tài)組分為大麥，含量為375g/L，大麥與液體營養(yǎng)液組分I按8:3 (W/V)比例混合均勻，將谷物蒸煮至谷物中心無白心，且含水率為55%，培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按10:3 (W/V)比例混合均勻，厚度0.5cm。
液體營養(yǎng)液組分I (g/L):葡萄糖5，七水硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀3.0,海鹽0.6，甘氨酸0.6，蘇氨酸1.5，蛋氨酸2，蘋果酸4，加水定容至所需體積，調(diào)節(jié)pH值6.5。組分2(mg/L):La3+15，Ce3+2，Sm3+3，Nd3+8，Mn2+L 2，Co2+0.08，生物素 0.2，淺藍(lán)菌素 0.1，赤霉素 GA5，VB12LO,葉酸0.03，余量為水。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:葡萄糖30g/L，NaC120g/L, MgSO4.7H205g/L,酵母粉3g/L，KH2PO4L Og/L, (NH4)2SO40.4g/L, NaHCO3L 2g/L, CoC122.0 μ g/L, MnSO40.7 μ g/L, VB10.06mg/L, VB120.005mg/L,初始 pH6.5。
發(fā)酵結(jié)束，收集菌體細(xì)胞，測定發(fā)酵液中細(xì)胞干重達(dá)142g/L，DHA含量達(dá)32.3g/L。提取的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人 類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。
權(quán)利要求
1.一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)菌種活化與菌懸液制備:將裂殖壺菌(Schizochytriumsp.) KDff-12菌種接種于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化，培養(yǎng)到期斜面加入質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水洗滌菌體，獲得菌懸液；所述裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)KDW_12,已于2012年11月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC N0.6843 ； 2)—級種子制備:將步驟I)獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種至固料培養(yǎng)基上培養(yǎng)，制成一級固料種子；或 將步驟I)獲得的菌懸液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種至液體種子培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)，制成一級液體種子； 3)二級固料種子的制備 :一級固料種子以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水根據(jù)1:1 (W/V)比例洗滌菌體，制成菌懸液； 在無菌條件下: 按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 20%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級固料種子液；或 按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8% 15%的接種量在固料培養(yǎng)基中接入一級液體種子，搖動K瓶混合均勻，25 28°C，培養(yǎng)2 3天； 制得二級固料種子； 4)二級固料種子發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng):二級固料種子加入1:3 5 (W/V)無菌水振蕩洗下菌體，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 20%的接種量接種至發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵前48h溫度控制在.25 28°C，利用攪拌轉(zhuǎn)速保持30% 50%的溶氧，48h至發(fā)酵結(jié)束溫度控制在18 22°C，發(fā)酵3 5天，通過重量百分比為28%的氨水控制發(fā)酵pH6.0 6.5，整個發(fā)酵過程自動流加經(jīng)118°C滅菌25min的濃度為580g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵葡萄糖濃度在4 8g/L ； 5)發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體細(xì)胞，提取DHA油脂。
2.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于在步驟I)中，所述斜面培養(yǎng)基的配方為:葡萄糖20 30g/L，蛋白胨10 15g/L，酵母粉.3 5g/L，海水晶15 20g/L，瓊脂粉20g/L，pH值6 7，121°C滅菌30min ;所述培養(yǎng)活化的溫度可為25 28°C，培養(yǎng)活化的時間可為2 3天；所述菌懸液的菌體濃度可為1.0 .2.5 X IO6 個/mL。
3.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于在步驟2)中，所述固料培養(yǎng)基包括固態(tài)組分和液體營養(yǎng)液組分，所述固態(tài)組分為谷物，含量為250 400g/L，所述谷物可選自米類、麥類和玉米中的至少一種，所述米類可選自大米、小米、糙米等中的至少一種，所述麥類可選自大麥、小麥、燕麥中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于在步驟2)中，所述液體營養(yǎng)液組分包括組分I和組分2，所述組分I的組成為:葡萄糖2 .5g/L,七水硫酸鎂0.2 0.6g/L，磷酸氫二鉀1.0 5.0g/L,海鹽0.1 0.8g/L，甘氨酸.0.2 0.6g/L,蘇氨酸1.5 1.8g/L,蛋氨酸2 3.5g/L,蘋果酸3 6g/L，加水定容，調(diào)節(jié)pH值為6 7 ;所述組分2的組成為:La3+IO 15mg/L, Ce3+I 4mg/L, Sm3+2 6mg/L,Nd3+8 12mg/L, Mn2+0.6 1.2mg/L, Co2+0.05 0.lmg/L,生物素 0.2 0.6mg/L,淺藍(lán)菌素 0.1 0.3mg/L,赤霉素 GA2 5mg/L, VB120.5 1.0mg/L,葉酸 0.01 0.05mg/L,余量為水。
5.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于在步驟2)中，所述固料培養(yǎng)基的制備方法為:固態(tài)組分與液體營養(yǎng)液組分I混合均勻，將谷物蒸或煮至谷物中心無白心，且含水率為50% 65%，獲得固料培養(yǎng)基原料；將固料培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2混合均勻，裝于固態(tài)發(fā)酵K瓶中，厚度0.2 1.0cm, 121°C滅菌30min，制得固料培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于所述固態(tài)組分與液體營養(yǎng)液組分I按質(zhì)量/體積的配比為(5 10) g: (2 5)mL，其中固態(tài)組分按質(zhì)量計算，液體營養(yǎng)液組分I按體積計算； 所述固料培養(yǎng)基原料與液體營養(yǎng)液組分2按質(zhì)量/體積的配比為(10 15)g: (3 6) mL，其中固料培養(yǎng)基原料按質(zhì)量計算，液體營養(yǎng)液組分2按體積計算。
7.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于在步驟2)中，所述液體種子培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖20 25g/L，氯化鈉20 25g/L，磷酸二氫鉀0.2 0.5g/L，酵母粉3 5g/L，七水硫酸鎂8 12g/L，海鹽0.1 0.8g/L，谷氨酸 0.2 0.6g/L, pH 值 6 7，121°C滅菌 30min。
8.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于在步驟2)中，所述培養(yǎng)的溫度為25 28°C，培養(yǎng)的時間為I天。
9.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法,其特征在于在步驟2)中，所述搖瓶的轉(zhuǎn)速為180 220rpm ;搖瓶培養(yǎng)的溫度為25 28°C，搖瓶培養(yǎng)的時間為I天。
10.如權(quán)利要求1所述的一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，其特征在于在步驟4)中，所述擴(kuò)大培養(yǎng)采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖30 60g/L, NaCl 15 20g/L, MgSO4.7H204 8g/L,酵母粉 3 8g/L, KH2PO40.5 1.0g/L,(NH4)2SO40.2 0.5g/L, NaHCO30.8 1.2g/L, CoCl2L 0 ~ 2.0 u g/L, MnSO40.5 1.0 y g/L，VB10.05 0.lmg/L, VB120.001 0.01mg/L，初始pH6.0 7.0 ;所述發(fā)酵最好溶氧維持在8% 12%。
全文摘要
一種固料培養(yǎng)裂殖壺菌液體發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法，涉及發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法。采用的菌種為裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)KDW-12。菌種活化與菌懸液制備；一級種子制備；二級固料種子的制備；二級固料種子發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)；發(fā)酵結(jié)束后，收集菌體細(xì)胞，提取DHA油脂。提取的DHA可作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑，為人類和動物提供所需長鏈多不飽和脂肪酸。改進(jìn)種子制備方式，簡化擴(kuò)種工藝，縮短種子培養(yǎng)和發(fā)酵周期，可減少投資，節(jié)約成本；同時固料培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，富含多種生長因子，更利于種子的生長，菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)、同步性較好；培養(yǎng)固料種子階段產(chǎn)生的廢水、廢渣少，環(huán)境污染小。
文檔編號C12R1/645GK103146584SQ201210593090
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
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