專利名稱：微生物催化制備(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法及菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WZZ001及其在微生物催化制備左乙拉西坦中間體一式(II )所示的(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯中的應用，以及一種微生物催化制備式(II)所示的(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法，該中間體可通過胺解反應合成左乙拉西坦。
背景技術：
左乙拉西坦(levetiracetam, LEV,商品名Keppra)化學名稱為(S) - a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酰胺，為吡拉西坦衍生物，是一種新型抗癲癇藥物(AED)。1999年經(jīng) 美國FDA批準，最初用于成人部分性癲癇發(fā)作.2005年6月其口服片劑和溶液劑被批準用于4歲以上(包括4歲)兒童部分性發(fā)作的輔助治療。2007年3月10日在中國上市(商品名開浦蘭)。左乙拉西坦具有不同于其他抗癲癇藥物的獨特作用機制，它是迄今惟一證實與突觸前神經(jīng)末梢內(nèi)突觸小泡蛋白SV2A結合的抗癲癇藥物，也是目前報道的唯一具有預防癲癇發(fā)生作用的抗癲癇藥物。研究表明，在一定治療劑量范圍內(nèi)左乙拉西坦及其主要代謝物，既不是人體肝臟細胞色素P450、環(huán)氧化水解酶或尿苷二磷酸-葡萄苷酶的抑制劑，也不是它們具有高親合力的底物，因此，不易出現(xiàn)藥代動力學相互作用。對于成人難治性部分性發(fā)作，左乙拉西坦是治療癲癇部分性發(fā)作的首選加用藥物；對于兒童部分性癲癇發(fā)作，亦有良好的顯著效果，且副作用輕微，對臨床治療極具參考價值。該藥物起效迅速，表現(xiàn)出良好的抗癲癇療效和耐受性、安全性，除用于難治性癲癇的輔助治療之外，其適應癥也逐漸擴展到新診斷癲癇的單藥治療。目前，文獻報道的合成左旋乙拉西坦的方法主要是化學拆分法和利用手性氨基酸作為起始底物的合成方法。前者，以吡咯烷酮為原料，過程中與外消旋體(±)-2_溴丁酸甲酯反應，又與(R) - a -甲基芐胺成鹽，再經(jīng)氨解等反應得到左旋對映體；后者，主要以甲硫氨酸為原料，通過酯化、酰胺化、閉環(huán)和脫硫等多步反應得到左旋產(chǎn)物。這些傳統(tǒng)工藝途徑存在著收率低、成本高、步驟繁多、產(chǎn)物純度較低、污染嚴重等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述方法的不足，通過篩選產(chǎn)脂肪酶微生物，提供了一株廉價高效的微生物酶產(chǎn)生菌，并提供了以外消旋a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯為反應底物，以該菌產(chǎn)生的酯水解酶催化立體選擇性水解(R)-Q-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯從而制備(S)-a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的的方法。本發(fā)明采用的技術方案是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) WZZ001，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏日期2012年10月14日，保藏編號=CCTCCNo M 2012403。
該菌株通過以下程序篩選分離得到(I)稱取濕土樣I g混懸于10 mL無菌生理鹽水中，振蕩混勻；接3 mL混懸液于50 mL液體富集培養(yǎng)基中，在30 0C >200 r/min下培養(yǎng)4 5 d后，無菌操作轉接I mL渾濁的菌液到新鮮的液體富集培養(yǎng)基，連續(xù)富集:T4次。富集培養(yǎng)基中，以外消旋a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯為唯一碳源，配方如下NaNO3 3.0 g/L, KH2PO4 1.0 g/L，MgSO4*7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 5 g/L, FeSO4*7H20 0. 01 g/L, (±) -a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯10 mmol/L，pH 7. O。(2)將富集后菌液經(jīng)梯度稀釋，涂布分離平板培養(yǎng)基，多次分離，獲取單菌落。分離平板培養(yǎng)基組成為富集培養(yǎng)基加入瓊脂23 g/L, pH 7.0。(3)挑取分離得到的單菌落先后接種于50 mL的斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，30 °C、200 r/min培養(yǎng)24 h，得到種子液；在無菌條件下，取3 mL種子液接種于50 mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 °C,200 r/min培養(yǎng)24 h，得到發(fā)酵液。斜面培養(yǎng)基組成與分離平板培養(yǎng)基一致； 種子培養(yǎng)基配方為蛋白胨5 g/L,牛肉膏5 g/L,酵母膏I g/L,葡萄糖5 g/L, MgSO4 5 g/LjK2HPO4 1.5 g/L,KH2PO4 0.5 g/L，溶劑為水，pH 7. 0 ;產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為:蛋白胨10 g/L,葡萄糖 5 g/L, MgSO4 5 g/L, K2HPO41. 5 g/L, KH2PO4 0. 5 g/L，橄欖油 5 g/L，溶劑為水，pH7. O。(4)取10 mL發(fā)酵液于10 mL離心管中6000 rpm離心15 min,棄上清液,加入2 mL 0. 2 mo I/L pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液，振蕩混勻，再加入5. 66 g/L底物(±)-a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯。在30。。、200 r/min下，轉化24h。取出離心管，加入2 mL乙酸乙酯,充分振蕩,6000 rpm離心15 min。取上層有機相I mL,用少量無水硫酸鈉干燥除水，以氣相色譜檢測(S)-a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的對映體過量值(e. e.)，并用旋光儀檢測不對稱水解產(chǎn)物的比旋光度，篩選得到所述微生物菌株一WZZ001菌。菌落形態(tài)特征30 1下，培養(yǎng)32h，菌落呈圓形，邊緣呈裂葉狀，中心凸起，乳白色，干燥，無光澤。細胞形態(tài)特征細胞為直或彎曲的短桿狀，大小為[(0.4 0.6) ymX (1.2^1.6)V- m],單個分散排列。生理生化特征WZZ001菌為革蘭氏陽性菌，專性好氧，生長對pH變化不敏感。利用無機氮源的能力較差。生長和產(chǎn)酶受到Cu2+、Mn2+的抑制，受到Mg2+、Fe3+、Ca2+等的促進。經(jīng)測序鑒定，WZZ001菌的 16S rDNA 序列如下GTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTC
AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGT
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TACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTT根據(jù)生理生化特性和分子生物學鑒定，該菌株被鑒定為蠟狀芽孢桿菌。本發(fā)明還涉及所述的蠟狀芽孢桿菌WZZ001在微生物催化制備(II)所示的
(S)-Q-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯中的應用。本發(fā)明還涉及一種微生物催化制備式(II)所示的(S)-C1-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法，所述方法包括以式(I )所示的外消旋a -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯為反應底物，在微生物酯水解酶作用下，進行選擇性水解反應制得所述的(s)-a-z基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯；所述微生物酯水解酶來自蠟狀芽孢桿菌CCTCC No M 2012403
的含酶菌體細胞；
權利要求
1.蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)WZZ001，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址: 中國，武漢，武漢大學，郵編430072，保藏日期.2012年10月14日，保藏編號=CCTCC No M 2012403。
2.如權利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌WZZ001，其特征在于該菌株的16SrDNA序列如 SEQ ID No.1 所示。
3.權利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌WZZ001在微生物催化制備(II)所示的(s)-a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯中的應用；
4.一種微生物催化制備式(II)所示的(S)-a-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法， 所述方法包括以式(I )所示的外消旋α -乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯為反應底物，在微生物酯水解酶作用下，進行選擇性水解反應制得所述的(S) - α -乙基-2-氧-1-吡咯燒乙酸酯；所述微生物酯水解酶來自蠟狀芽孢桿菌CCTCC No Μ 2012403的含酶菌體細胞；
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述選擇性水解反應在l(T50°C、pH6.(Γ8. O 的緩沖液中進行。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述選擇性水解反應在pH7.2的磷酸鹽緩沖液中進行。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于緩沖液中底物初始濃度為5 100g/L，含酶菌體細胞添加量為f 50g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株廉價高效的微生物酶產(chǎn)生菌——蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)WZZ001，并提供了以外消旋α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯為反應底物，以該菌產(chǎn)生的酯水解酶催化立體選擇性水解(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯從而制備(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸酯的方法。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2012年10月14日，保藏編號CCTCC NoM2012403。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明菌株產(chǎn)生的酯水解酶的區(qū)域選擇性強，反應轉化率高，下游分離簡單，能耗低，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/085GK102994429SQ20121051664
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權日2012年12月5日
發(fā)明者汪釗, 鄭建永, 鄢洪德, 章銀軍, 宣磊 申請人:浙江工業(yè)大學