專利名稱：一種脂肪細胞體外培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種脂肪細胞體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
脂肪組織是機體內(nèi)最大的能量儲庫，脂肪代謝是生命最基本的能量代謝方式?，F(xiàn)在普遍認為脂肪代謝異常可引發(fā)多種疾病，如肥胖、動脈粥樣硬化、II型糖尿病、高血壓和血脂代謝障礙等。為了更深入地對脂肪代謝紊亂疾病進行研究，研究者發(fā)現(xiàn)建立脂肪細胞體外培養(yǎng)模型是一種有效的途徑(Armani A, Mammi C, Marzolla V, et al. . Cellular models for understanding adipogenesis, adipose dysfunction, and obesity. J Cell Biochem. 2010，110(3) : 564-72.)。
脂肪細胞體外培養(yǎng)方法目前主要有兩種，分別是膠原酶消化法和組織塊培養(yǎng)法。 膠原酶消化法首先將脂肪組織剪碎，然后加入一定濃度的膠原酶，37°C消化60-90分鐘，期間每隔約10分鐘用吸管吹打混勻組織，之后將消化的組織液過200目細胞篩，收集過濾的液體離心洗滌兩次，最后加入培養(yǎng)液放培養(yǎng)箱培養(yǎng)，約16-18小時后細胞貼壁生長，3-4天后有約80-90%細胞貼壁。這種方法的優(yōu)點是細胞貼壁快，生長均勻，然而缺點是操作時步驟繁瑣、花費時間較長，因而容易造成培養(yǎng)污染。組織塊培養(yǎng)法同樣是先將脂肪組織剪碎， 然后用吸管將組織塊均勻排放在培養(yǎng)瓶底壁上(組織塊間隔約3毫米)，之后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入培養(yǎng)液，平放入培養(yǎng)箱，2-3小時后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液浸入組織塊繼續(xù)培養(yǎng)，96-108 小時后有細胞從組織塊周圍游離出來生長，約10-12天后有80-90%細胞貼壁。這種方法的優(yōu)點是操作步驟簡單、一般不會造成培養(yǎng)污染，但缺點也是顯而易見的，一是細胞培養(yǎng)周期較長；二是細胞生長不均勻，組織塊周圍細胞生長由于過于密集而老化，但這時培養(yǎng)瓶底壁還有部分空間由于距離組織塊較遠，細胞還未游離過來貼壁生長。發(fā)明內(nèi)容
為了克服以上兩種脂肪細胞體外培養(yǎng)方法的缺點，本發(fā)明提供了一種脂肪細胞的體外培養(yǎng)方法。該培養(yǎng)方法與膠原酶消化法相比，操作步驟簡單，花費時間短，通常不會造成培養(yǎng)污染，而且由于不受膠原酶消化的影響，細胞活性較高，貼壁后生長狀態(tài)良好；與組織塊培養(yǎng)法相比，細胞培養(yǎng)周期大大縮短，而且細胞生長均勻。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種脂肪細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，將脂肪組織先勻漿處理成乳糜狀，然后用接種環(huán)(優(yōu)選用改進的接種環(huán))將乳糜組織在培養(yǎng)瓶底壁均勻涂片，之后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入含?；撬岬呐囵B(yǎng)液，平放入培養(yǎng)箱，30-40分鐘后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn), 讓培養(yǎng)液進入培養(yǎng)瓶底壁的涂片中繼續(xù)培養(yǎng)，24-36小時后細胞貼壁生長，4-5天后有約 80-90%細胞貼壁。
具體包括以下步驟
( I)脂肪組織的勻漿處理
在無菌超凈臺內(nèi)首先將脂肪組織放在平皿中修剪成0. 8-1. 2cm3的塊狀，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3-5遍，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾3-5下，讓組織塊稍微干燥后，放入組織勻漿機的無菌試管內(nèi)，180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理3-5分鐘，這時組織塊成乳糜狀。
(2)脂肪細胞培養(yǎng)
用吸管吸取乳糜組織放在培養(yǎng)瓶底壁，然后用改進的接種環(huán)(環(huán)圈與手柄之間成 30度角，如圖I所示)將組織在培養(yǎng)瓶底壁上均勻涂片(厚度為O. 10-0. 15毫米)，之后將剩余乳糜組織用接種環(huán)推到瓶口處，吸管吸出棄掉；然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入含?；撬岬呐囵B(yǎng)液， 平放入培養(yǎng)箱中，30-40分鐘后將培養(yǎng)瓶再次輕輕翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液慢慢進入培養(yǎng)瓶底壁的涂片中，并重新放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24-36小時后細胞貼壁生長，4-5天后有約80-90%細胞貼壁。
(3)培養(yǎng)液配制與添加
將50-60份(體積份數(shù))胎牛血清(FBS )、2-3份(體積份數(shù))青鏈霉素混合液、O.1-0. 2份(質(zhì)量份數(shù)，每450-500毫升的細胞培養(yǎng)液中加入O. I O. 2g的?；撬?牛磺酸溶解在450-500份(體積份數(shù))細胞培養(yǎng)液(DMEM/F12)中，經(jīng)O. 22微米濾膜過濾后分裝到滅菌的離心管中，每管40-45毫升，放置4°C保存，兩周內(nèi)用完。細胞培養(yǎng)前O. 5-1小時將培養(yǎng)液放在37 °C水浴鍋中預熱。
培養(yǎng)瓶中第一次加入培養(yǎng)液的量非常關(guān)鍵，應嚴格按照表I所不。
表I培養(yǎng)液添加量與培養(yǎng)瓶型號對應表
權(quán)利要求
1.一種脂肪細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，將脂肪組織先勻漿處理成乳糜狀，然后用接種環(huán)將乳糜組織在培養(yǎng)瓶底壁均勻涂片，之后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入含?；撬岬呐囵B(yǎng)液，平放入培養(yǎng)箱，30-40分鐘后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液進入培養(yǎng)瓶底壁的涂片中繼續(xù)培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求I所述的脂肪細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，(1)脂肪組織的勻漿處理在無菌超凈臺內(nèi)首先將脂肪組織放在平皿中修剪成O. 8-1. 2cm3的塊狀，然后用PBS緩沖液沖洗3-5遍，之后把組織塊放在干燥的平皿內(nèi)沾3-5下，再放入組織勻漿機的無菌試管內(nèi)180-200轉(zhuǎn)/分鐘勻漿處理3-5分鐘，使組織塊成乳糜狀；(2)脂肪細胞培養(yǎng)用吸管吸取乳糜狀組織放在培養(yǎng)瓶底壁，然后用接種環(huán)將組織在培養(yǎng)瓶底壁上均勻涂片，涂片厚度為O. 10-0. 15毫米，之后將剩余乳糜狀組織用接種環(huán)推到瓶口處，吸管吸出； 然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入含?；撬岬呐囵B(yǎng)液，平放入培養(yǎng)箱中，30-40分鐘后將培養(yǎng)瓶再次翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液慢慢進入培養(yǎng)瓶底壁的涂片中，并重新放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的脂肪細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，所述含牛磺酸的培養(yǎng)液為按體積比，將50-60份胎牛血清和2-3份青鏈霉素混合液溶解在450-500份的細胞培養(yǎng)液DMEM/F12中，同時每450-500ml細胞培養(yǎng)液DMEM/F12中另外加入O. I O. 2g的?；撬?。
4.如權(quán)利要求I或2所述的脂肪細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，所述接種環(huán)的環(huán)圈與手柄之間呈30度角。
5.如如權(quán)利要求I或2所述的脂肪細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，所述培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液的添加量為T25型培養(yǎng)瓶內(nèi)添加4-5ml，T75型培養(yǎng)瓶內(nèi)添加12_15ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂肪細胞體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明將脂肪組織先勻漿處理成乳糜狀，然后用改進的接種環(huán)將乳糜組織在培養(yǎng)瓶底壁均勻涂片，之后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶加入含牛磺酸的培養(yǎng)液，平放入培養(yǎng)箱，30-40分鐘后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓培養(yǎng)液進入培養(yǎng)瓶底壁的涂片中繼續(xù)培養(yǎng)，24-36小時后細胞貼壁生長，4-5天后有約80-90%細胞貼壁。本發(fā)明培養(yǎng)方法與膠原酶消化法相比，操作步驟簡單，花費時間短，通常不會造成培養(yǎng)污染，而且由于不受膠原酶消化的影響，細胞活性較高，貼壁后生長狀態(tài)良好；與組織塊培養(yǎng)法相比，細胞培養(yǎng)周期大大縮短，而且細胞生長均勻。
文檔編號C12N5/077GK102936580SQ20121045479
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者譚秀文, 游偉, 成海建, 劉桂芬, 劉曉牧, 萬發(fā)春, 宋恩亮, 韓紅 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所