專(zhuān)利名稱(chēng)：一種L型PML/RARα融合基因檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于血液分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種L型PML/RARa融合基因檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
白血病是一類(lèi)造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生積聚并浸潤(rùn)其他器官和組織，同時(shí)使正常造血受抑制，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染及各器官浸潤(rùn)癥狀。染色體異常是白血病發(fā)生的常見(jiàn)原因之一。根據(jù)白血病細(xì)胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性?xún)纱箢?lèi)。急性白血病的細(xì)胞分化停滯在較早階段，多為原始細(xì)胞及早幼細(xì)胞，病情發(fā)展迅速。其中急性早幼粒細(xì)胞白血病(AcutePromyelocytic Leukemia, APL)是一種常伴發(fā)嚴(yán)重出血的急性白血病,95%以上的APL發(fā)生特異性的染色體易位t (15 ；17) (q22 ；ql2 21)，導(dǎo)致15號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病((Promyelocytic leukemia, PML)基因與17號(hào)染色體上的維甲酸受體a (Retinoicacid receptor α , RARa)基因融合產(chǎn)生PML / RARa融合基因。依據(jù)PML基因內(nèi)部斷點(diǎn)不同，可分為L(zhǎng)、S和V型三種，其中L型PML /RARa融合基因?yàn)橹饕?lèi)型，約占70 80%。分子生物學(xué)研究表明，PML / RARa融合基因是APL高度特異性的分子標(biāo)志物，是APL患者發(fā)病的重要機(jī)制之一，已作為APL MICM分型診斷的依據(jù)之一。近年來(lái)，隨著維甲酸、三氧化二砷在臨床上的應(yīng)用，APL完全緩解(complete reminion, CR)率明顯提高，長(zhǎng)期無(wú)病生存的病例大大增加。但白血病的復(fù)發(fā)問(wèn)題卻一直困擾著醫(yī)務(wù)人員，關(guān)鍵原因在于臨床上CR患者體內(nèi)仍有微小殘留病灶(minimal residual disease MRD)存在。初發(fā)患者體內(nèi)白血病細(xì)胞總數(shù)為IO12 1013，經(jīng)化療誘導(dǎo)達(dá)到血液學(xué)CR后，體內(nèi)仍殘留IO6 IO8白血病細(xì)胞。因此，準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)APL微小殘留病，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)，指導(dǎo)臨床治療是提高APL患者長(zhǎng)期生存率的主要途徑之一。目前PML/ RARa融合基因檢測(cè)的方法主要有染色體分析、實(shí)時(shí)定量RT-PCR、熒光原位雜交技術(shù)等，但這些方法均存在特異性不高、操作繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用高等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用魏娜，陳敬華，王昆等.發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA探針用于檢測(cè)白血病PML / RARa融合基因的電化學(xué)傳感器的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27 (9):907— 910。所以急需建立一種簡(jiǎn)便、快速、高特異性的檢測(cè)新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種L型PML/RARa融合基因檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的檢測(cè)方法，目的是實(shí)現(xiàn)某一種細(xì)胞該融合基因的檢測(cè)。本發(fā)明是采用如下技 術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種L型PML/RARa融合基因檢測(cè)試劑盒，由以下成分組成:功能化氧化石墨烯、序列為5’ FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC標(biāo)記的單鏈DNA、試劑1、甲醛、皂角素、PBS緩沖液，試劑盒中各成分濃度及用量見(jiàn)表1，所列試劑的量為10個(gè)樣本反應(yīng):
表I
權(quán)利要求
1.一種L型PML/RARd融合基因檢測(cè)試劑盒，其特征是由以下成分組成:功能化氧化石墨烯、序列為5’ FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC標(biāo)記的單鏈DNA、試劑1、甲醛、皂角素、PBS緩沖液，試劑盒中各成分濃度及用量見(jiàn)表1，所列試劑的量為10個(gè)樣本反應(yīng):
2.—種L型PML/RARa融合基因的檢測(cè)方法，該方法使用權(quán)利要求1的試劑盒，其特征是包括以下步驟: (1)細(xì)胞培養(yǎng) 將待測(cè)細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液中，在37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)，2 3天半量換液； (2)與細(xì)胞共孵育的孵育液制備 將功能化氧化石墨烯、序列為5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC標(biāo)記的單鏈DNA和試劑I混合即得到孵育液； (3)細(xì)胞預(yù)處理 A、將待測(cè)細(xì)胞收集到流式離心管中，于室溫下1000 rpm離心5 min，棄去上清液；B、然后在上述流式離心管中加入100W甲醛，立刻混勻，室溫下靜置10 15min后， 向流式離心管中加入4ml PBS緩沖液吹打混勻后，于室溫下1000 rpm離心5 min,棄去上清 液；C、最后在處理完的流式離心管中加入100W皂角素，混勻，室溫下靜置5min后，向流 式離心管中加入4 ml PBS緩沖液輕輕混勻后，于室溫下1000 rpm離心5 min,棄去上清液 備用;(4)孵育液與細(xì)胞共孵育將步驟(2)得到的孵育液加入步驟(3)處理后的流式離心管中，充分混勻，37°C下、避 光、靜置lh后，于室溫下1000 rpm離心5 min，棄去上清液，然后向流式離心管中再加入4 ml PBS緩沖液混勻后，于室溫下1000 rpm離心5 min,棄去上清液,再向流式離心管中加 lml PBS緩沖液，混勻后進(jìn)行結(jié)果分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種L型PML/RARa融合基因的檢測(cè)方法，該方法使用權(quán)利 要求1的試劑盒，其特征是所述步驟(4)中的分析方法采用激光共聚焦顯微鏡法和流式細(xì) 胞儀法。
全文摘要
本發(fā)明涉及血液分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體為一種L型PML/RARα融合基因檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的檢測(cè)方法，由以下試劑組成功能化氧化石墨烯、序列為5’FITC-TGACCTGCCATTGAG-3’的FITC標(biāo)記的單鏈DNA、試劑Ⅰ、甲醛、皂角素以及PBS緩沖液，其中試劑Ⅰ由Tris堿、NaCl、KCl、MgCl2、HCl、H2O組成，使用方法包括細(xì)胞培養(yǎng)、與細(xì)胞共孵育的孵育液制備、細(xì)胞預(yù)處理和孵育液與細(xì)胞共孵育。使用本試劑盒提供的試劑，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出某一種細(xì)胞是否存在L型PML/RARα融合基因，該試劑盒更敏感、特異，操作簡(jiǎn)單、快速，這對(duì)于APL的診斷及其微小殘留的監(jiān)測(cè)具有重要的意義，可以做到早期預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)、指導(dǎo)臨床治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103074420SQ201210449468
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者李然, 王宏偉, 覃艷紅, 陳秀花, 任方剛, 張耀方, 徐智芳, 李莉, 郭海秀, 王曉娟 申請(qǐng)人:山西醫(yī)科大學(xué)