專利名稱：來自于纖維堆囊菌的基因epoO及其在埃博霉素合成中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種來源于纖維堆囊菌{Sorangiumcellulosum)菌株基因組內(nèi)的基因及其在埃博霉素合成中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
埃博霉素{Epothilone)是由粘細菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的一類16元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有促微管聚合活性，其作用機制類似于紫杉醇(Jaxom (附圖1)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種epo thi1ne結(jié)構(gòu)類似物，相關(guān)發(fā)明專利已經(jīng)超過800篇,epo thi1nes已經(jīng)成為目前生物醫(yī)藥方面令人興奮的研究熱點之一。它被認為是紫杉醇類抗腫瘤化合物的更新?lián)Q代產(chǎn)品。與紫杉醇相比具有明顯的優(yōu)勢:①分子結(jié)構(gòu)簡單，水溶性更好-S^Epothilone的噻唑環(huán)結(jié)構(gòu)與微管作用更加緊密.ΜEpothilone不會產(chǎn)生長期使用紫杉醇類藥物帶來的白細胞減少，脫發(fā)等癥狀.' Epothilone具有比紫杉醇更廣泛的抗腫瘤譜，一般比紫杉醇的抗腫瘤活性高5到25倍-MEpothilone具有對多重耐藥性及耐紫杉醇腫瘤細胞的很高的細胞毒活性，比紫杉醇強2000-5000倍.MEpothilone由微生物產(chǎn)生，可以通過發(fā)酵進行大規(guī)模制備，不必像紫杉醇那樣必須通過對杉樹的采伐或者復(fù)雜的化學(xué)合成途徑來獲取。目前已經(jīng)有多種印othilone類化合物進入不同階段的臨床評估，如BMS-247550，BMS-310705，EP0-906, K0S-862 以及 ΖΚ-ΕΡ0 等。其中 BMS-247550 是 epothilone B 的大環(huán)內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)類似物，已經(jīng)于200·7年10月在美國上市銷售，起到了讓人滿意的效果。鑒于化學(xué)合成法的高成本及低收率，目前國際上埃博霉素的生產(chǎn)均采用微生物發(fā)酵法，但由于其生產(chǎn)菌株纖維堆囊菌的遺傳特性，目前很難對其進行異源表達提高產(chǎn)量，因此除發(fā)酵條件優(yōu)化及傳統(tǒng)的菌種改良外，對生產(chǎn)菌株本身的遺傳改造也具有重要的應(yīng)用價值。目前國際上已經(jīng)報道了負責合成的基因簇，為雜合型的I型聚酮合酶基因簇(NRPS/PKS)(附圖2)，但其相關(guān)調(diào)控基因目前還幾乎沒有相關(guān)報道，如能發(fā)現(xiàn)重要的epothilone合成調(diào)控基因并對其進行有效改造,貝U可以顯著提高epothilone產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從纖維堆囊菌{Sorangium ceBWios ) SoO 157-2中發(fā)現(xiàn)一個與埃博霉素合成相關(guān)的調(diào)控基因印00，該基因的序列為:5’-CATTTTTTTGAGACTCTGCT CAAAGGGATTAGATCGAGTGAGACAGTTCT-3’，該基因長度為50bp，包含啟動子應(yīng)有的-10區(qū)和-35區(qū)特征。本發(fā)明還公開改造該基因的方法，應(yīng)用該方法可以提高埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量。來自于纖維堆囊菌的調(diào)控基因6./7θ0，它具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。該基因位于埃博霉素合成酶基因簇第一個翻譯起始密碼子上游l_230bp范圍內(nèi)。本發(fā)明還要保護的是，該基因在埃博霉素合成中的應(yīng)用以及該基因在抑制腫瘤細胞生長及誘導(dǎo)細胞程序性死亡中的活性。上述來自于纖維堆囊菌的調(diào)控基因印00，可以采用引物、載體和異源宿主改造。
上述的引物為157印o5111-6114F、157印05111-6114D、157-印O6137-7680F、157-印O6137-7680D 中的任一種。上述載體包括PCC11、PCVD442、PRK2013中的任一種。上述異源宿主包括大腸桿菌DH5 a、Top 10、BL21(DE3)中的任一種。本發(fā)明的埃博霉素調(diào)控基因印oQ為首次報道，該基因與纖維堆囊菌發(fā)酵合成埃博霉素密切相關(guān)。通過分子生物學(xué)手段對該基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改造或直接替換成其他啟動子，可以顯著提高菌株埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量。


圖1 埃博霉素A {epothileon A)及紫杉醇(Taxol)分子結(jié)構(gòu)圖，埃博霉素A{epothileon A)及紫杉醇(JaxoT)分子結(jié)構(gòu)圖(A為埃博霉素A ;B為紫杉醇)；
圖2合成酶基因簇結(jié)構(gòu)合成酶基因簇結(jié)構(gòu)；
圖3實施例3中調(diào)控基因印oQ的PCR擴增結(jié)果電泳譜圖，調(diào)控基因epoO的PCR擴增結(jié)果電泳譜圖(I, 2為擴增的DNA片段；3為DNA marker DL2000)；
圖4實施例1以pCCl I質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組載體，實施例1以pCCll質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組載體；
圖5實施例2接合子照片；
圖6實施例1中陽性結(jié)合子發(fā)酵后埃博霉素的HPLC檢測譜圖，實施例1中陽性結(jié)合子發(fā)酵后埃博霉素的HPLC檢測譜圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
來對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。纖維堆囊菌埃博霉素合成調(diào)控基因印OQ序列為:
5 ‘-CATTTTTTTGAGACTCTGCTCAAAGGGATTAGATCGAGTGAGACAGTTCT-3’ ，該序列位于epothilone合成酶基因簇上游。實施例中所用原料均可市場購得，實施例中所用高效液相色譜儀為LC-2010A HT,Shimadzu0實施例1
敲除部分片段(前端頸環(huán)結(jié)構(gòu))舉例:
以纖維堆囊菌So0157-2基因組為模板，采用引物EOFl和EORl:
EOFl: 5’ -CCCCTCGAGCCACAGCATCAGG-3’ ;
EORl: 5 ’ -CGAGGTCGGGATCCAACCACGC-3 ’，按照表I配制PCR擴增體系，并采用表I所示進行PCR擴增，即可得到含有調(diào)控基因印oQ的DNA片段，如附圖3所示。表I PCR擴增體系各組分含量__
添加物I體積—
ddHa010.4 μ L
2XGCbufferI12.5μ L
So0157-2genomeDNA(10ng/μ L)0.5 μ L
PrimerupEOFl (62.5 μ Μ)0.2 μ L
權(quán)利要求
1.來自于纖維堆囊菌的基因6./7θ0，其特征在于，它具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述來自于纖維堆囊菌的基因印00，其特征在于，該基因位于埃博霉素合成酶基因簇第一個翻譯起始密碼子上游l_230bp范圍內(nèi)。
3.如權(quán)利要求1所述來自于纖維堆囊菌的基因印00，其特征在于，該基因在埃博霉素合成中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述來自于纖維堆囊菌的基因印00，其特征在于，該基因在抑制腫瘤細胞生長及誘導(dǎo)細胞程序性死亡中的活性。
5.如權(quán)利要求1所述來自于纖維堆囊菌的基因epoO，采用引物、載體和異源宿主改造。
6.如權(quán)利要求5中所述來自于纖維堆囊菌的基因epoO，其特征在于，所述的引物為157epo5111-6114FU57epo5111-6114DU57-epo6137-7680FU57-epo6137-7680D 中的任一種。
7.如權(quán)利要求5中所述來自于纖維堆囊菌的基因epoO，其特征在于，所述載體包括PCC11、PCVD442、PRK2013 中的任一種。
8.權(quán)利要求5中所述來自于纖維堆囊菌的基因epoO，其特征在于，所述異源宿主包括大腸桿菌DH5a 、Top 10、BL21(DE3)中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種來源于纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)菌株基因組內(nèi)的基因epoO及其在埃博霉素合成中的應(yīng)用。來源于纖維堆囊菌的調(diào)控基因epoO，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的埃博霉素調(diào)控基因epoO為首次報道，該基因與纖維堆囊菌發(fā)酵合成埃博霉素密切相關(guān)。通過分子生物學(xué)手段對該基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改造或直接替換成其他啟動子，可以顯著提高菌株埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量。
文檔編號C12R1/01GK103194448SQ201210441630
公開日2013年7月10日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者趙林, 劉新利, 孫欣, 李越中, 黎志鳳 申請人:山東輕工業(yè)學(xué)院