專(zhuān)利名稱(chēng)：一種microRNAs熒光檢測(cè)探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)靈敏檢測(cè)多種microRNAs或者短片段RNA的探針。
背景技術(shù)：
研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs (microRNAs)在真核細(xì)胞中廣泛存在，它們是一類(lèi)有重要調(diào)控功能的短鏈內(nèi)源非編碼RNA，長(zhǎng)度通常為20 25個(gè)核苷酸。microRNAs來(lái)源于較長(zhǎng)的含有折疊型結(jié)構(gòu)的RNA前體，當(dāng)合成后，Dicer酶可以識(shí)別并剪切，隨后形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRISC, RNA-induced silencing complex)或者其他的生物過(guò)程。miRISC的組成成分是microRNAs與蛋白Argonaute (Ago)等。RISC通常通過(guò)堿基配對(duì)的方式識(shí)別祀基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’ UTR),當(dāng)其與靶基因mRNA完美匹配時(shí)，會(huì)降解靶基因mRNA ;當(dāng)其與革巴基因mRNA有少許錯(cuò)配時(shí)，會(huì)抑制目標(biāo)基因的表達(dá)?！icroRNA在動(dòng)植物中有廣泛表達(dá)，通過(guò)干擾靶基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯，參與細(xì)胞增殖凋亡、發(fā)育、病毒防御、造血、器官形成、脂肪代謝等多種調(diào)節(jié)過(guò)程，可以說(shuō)是細(xì)胞生命活動(dòng)的開(kāi)關(guān)。miciORNA具有保守性，特異性和時(shí)序性，只在特定的細(xì)胞和組織中表達(dá)，因此決定了細(xì)胞和組織功能的特異性。區(qū)別于寡核苷酸和RNA的降解片段，miCix)RNA3’端為羥基，5'端有一個(gè)磷酸基。目前，microRNA的功能僅被部分闡明，近年來(lái),有報(bào)道m(xù)icroRNA與細(xì)胞癌變具有密切關(guān)聯(lián)。miR-17-92家族類(lèi)似于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)；miR-21是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因素。microRNA的功能類(lèi)似于癌基因或抑癌基因，有些microRNA會(huì)協(xié)同行使癌基因的功能,使一些凋亡蛋白受到抑制而另外一些microRNA在正常組織中高表達(dá)，它們的缺失或低表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和一些癌基因的激活。因此，microRNA可以作為一個(gè)重要的腫瘤標(biāo)識(shí)物,針對(duì)microRNA的檢測(cè)對(duì)于早期診斷和愈后診斷有重要意義，同時(shí)也為其功能研究提供重要依據(jù)。人體中存在著各種不同的microRNAs，據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約三分之一的基因的表達(dá)水平受到microRNA的嚴(yán)謹(jǐn)控制。研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)microRNA可以作用于多個(gè)祀基因的翻譯；與此同時(shí)，多個(gè)microRNA也可以協(xié)同作用于同一個(gè)祀基因的表達(dá)。microRNA網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,是細(xì)胞生命活動(dòng)有序進(jìn)行的重要調(diào)節(jié)因素。長(zhǎng)期以來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生的主要因素包括蛋白編碼基因的遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)的失調(diào)。組織細(xì)胞在復(fù)雜的環(huán)境因素的作用下，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島容易發(fā)生過(guò)度甲基化，導(dǎo)致抑癌基因功能的抑制；同時(shí)，細(xì)胞蛋白編碼基因全局性甲基化程度減弱，導(dǎo)致細(xì)胞的失控增生導(dǎo)致癌變。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中13ql4區(qū)域染色體的缺失率很高，懷疑該區(qū)域存在重要的抑癌基因，定位及連鎖研究發(fā)現(xiàn)，所尋找的抑癌基因位于不編碼蛋白序列的短DNA片段，所發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)基因編碼了 microRNA，即miR-15和miR-16。大規(guī)?；驕y(cè)序比較分析發(fā)現(xiàn)，miR-15和miR-16在大部分的CLL中都已經(jīng)缺失，導(dǎo)致相關(guān)基因抑癌功能的缺失。這是microRNA表達(dá)異常和腫瘤存在重要關(guān)聯(lián)的一個(gè)直接例子。從此以后，更多的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的microRNA基因被發(fā)現(xiàn)并定位在染色體上，這些基因的缺失或者移位經(jīng)常導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，癌前病變組織甚至也能觀測(cè)到microRNA表達(dá)異常，顯示了 microRNA在腫瘤早期預(yù)警的重要性。針對(duì)多份腫瘤實(shí)際標(biāo)本的分析發(fā)現(xiàn)了一些可疑的microRNA，它們的表達(dá)水平在腫瘤組織中大大降低。相關(guān)miCToRNA的表達(dá)譜，甚至可以測(cè)定腫瘤的組織來(lái)源并判斷腫瘤的分化程度，診斷結(jié)果十分可靠并具有相當(dāng)?shù)拿舾行??；蛐酒治霰容^常見(jiàn)實(shí)體瘤以及正常對(duì)照組織的microRNA表達(dá)譜進(jìn)一步驗(yàn)證了，microRNA表達(dá)譜在癌癥診斷中可靠性很高。深入研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)microRNA表達(dá)譜可以判斷腫瘤細(xì)胞的惡性程度、病人的預(yù)后和藥物治療反應(yīng)的評(píng)估等。因此，microRNA譜的異常促使腫瘤細(xì)胞惡性程度的增加，腫瘤的起始以及發(fā)展與之密切相關(guān)。MicroRNA復(fù)雜的調(diào)控功能使得人們對(duì)它的研究一直以來(lái)都是學(xué)術(shù)界的重點(diǎn)。然而對(duì)于它功能研究的基礎(chǔ)則是針對(duì)它的檢測(cè)。同時(shí)，miciORNA作為重要的腫瘤疾病標(biāo)識(shí)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)它的高靈敏高特異且經(jīng)濟(jì)廉價(jià)的檢測(cè)意義重大。而目前針對(duì)microRNA的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法以Northern雜交，熒光實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR，芯片微陣列為主，但通常不經(jīng)濟(jì)，不環(huán)保，檢測(cè)體系設(shè)計(jì)復(fù)雜且需要大型儀器。隨后發(fā)展的新方法通常有基于恒溫?cái)U(kuò)增，滾環(huán)擴(kuò)增，電化學(xué)法或者納米金量子點(diǎn)的納米等的衍生方法。然而，這些方法中有些需要復(fù)雜的探針簇，有些需要昂貴的材料，另外一些納米粒子的合成及修飾也會(huì)帶來(lái)較高的成本及操作的難度。另外，·由于microRNA的同源性會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜體系檢測(cè)中的交叉干擾，這對(duì)于臨床上的實(shí)際應(yīng)用，特別是我國(guó)廣大貧困地區(qū)的臨床診斷有著很大局限。因此，申請(qǐng)人希望設(shè)計(jì)更為方便有效，經(jīng)濟(jì)環(huán)保又兼高具靈敏度高特異性的新方法，特別是針對(duì)復(fù)雜的實(shí)際臨床樣本的多色檢測(cè)體系以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)高特異性檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種microRNA檢測(cè)探針以及含有探針的檢測(cè)試劑盒，通過(guò)不同熒光標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)低成本同時(shí)檢測(cè)多種microRNAs。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明首先提供的一種熒光探針，其兩端至少包括一互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)段，且該探針的兩末端一端具有報(bào)告熒光基團(tuán)，另一端具有淬滅熒光基團(tuán)，其兩端的互補(bǔ)區(qū)段互補(bǔ)結(jié)合并且報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)能夠被淬滅熒光基團(tuán)吸收；檢測(cè)時(shí)熒光探針能形成雙鏈結(jié)構(gòu)，且報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，發(fā)出熒光信號(hào)。這種熒光探針是通過(guò)改變熒光探針的狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的目的。本發(fā)明進(jìn)一步基于引物延伸，提供一種折疊型HiiCT0RNA檢測(cè)探針。在靶標(biāo)miCToRNA存在的條件下通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別與之完全匹配的靶標(biāo)。與靶標(biāo)結(jié)合后折疊型結(jié)構(gòu)打開(kāi)，其5'-與3'-端原末端區(qū)部分裸露出來(lái)，與體系中游離的引物配對(duì)，并在大片段聚合酶作用下進(jìn)行引物延伸。延伸過(guò)程中遇到前方microRNA阻礙時(shí)將其擠下，并繼續(xù)延伸，最終microRNA被完全頂下，脫離探針?lè)肿?，成為游離狀態(tài)而與新的折疊型探針?lè)肿幼R(shí)別并結(jié)合，從而進(jìn)入新一輪打開(kāi)探針-引物延伸-被擠下并脫離探針的循環(huán)。在每一次的識(shí)別，結(jié)合并打開(kāi)探針?lè)肿舆^(guò)程中都將產(chǎn)生熒光恢復(fù)。靶標(biāo)的循環(huán)使用達(dá)到信號(hào)的指數(shù)級(jí)放大。同時(shí)，由于探針的末端區(qū)及環(huán)狀區(qū)長(zhǎng)度及序列的特殊設(shè)計(jì)，只有當(dāng)靶標(biāo)和探針之間完全匹配時(shí)才能相互穩(wěn)定結(jié)合并將其折疊型打開(kāi)，因而多個(gè)靶標(biāo)和探針同時(shí)存在的混合體系中不會(huì)產(chǎn)生交叉影響，各探針的引物延伸過(guò)程不相互干擾。因此，只需選取激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不重疊的熒光團(tuán)標(biāo)記各探針序列就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。
具體地，本發(fā)明熒光檢測(cè)探針為折疊型結(jié)構(gòu)，包括末端區(qū)，該區(qū)域?yàn)殡p鏈結(jié)構(gòu)；環(huán)狀區(qū)，為單鏈結(jié)構(gòu)，包括待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列以及間隔序列，所述待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列與間隔序列相連，待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列的另一端以及間隔序列的另一端分別與末端區(qū)同一端的兩條雙鏈相連接，所述間隔序列不與探針的其它序列形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。末端區(qū)的雙鏈結(jié)構(gòu)，可以使得探針的折疊型結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，末端區(qū)的長(zhǎng)度例如可以是6 15bp,優(yōu)選7 IObp,更優(yōu)選9bp。環(huán)狀區(qū)長(zhǎng)度宜為20 36nt，其中間隔序列為6 9nt。間隔序列位于環(huán)狀區(qū)的3’端。在使用時(shí)，針對(duì)不同檢測(cè)對(duì)象，對(duì)環(huán)狀區(qū)的待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列進(jìn)行修改，并使用·不同的熒光標(biāo)記，即可實(shí)現(xiàn)不同靶標(biāo)的檢測(cè)。本發(fā)明整個(gè)探針為折疊型結(jié)構(gòu)，在不加入靶標(biāo)HiiCT0RNA的情況下折疊型結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。由于末端區(qū)以雙鏈形式存在，體系中即使存在大量與之互補(bǔ)的引物序列，探針仍然保持分子內(nèi)互補(bǔ)配對(duì)，引物處于游離狀態(tài)。在靶標(biāo)microRNA存在的條件下通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別與之完全匹配的靶標(biāo)。與靶標(biāo)結(jié)合后折疊型結(jié)構(gòu)打開(kāi)，其5'-與3'-端原末端區(qū)部分裸露出來(lái)，可與體系中游離的引物配對(duì)，并在大片段聚合酶作用下進(jìn)行引物延伸。延伸過(guò)程中遇到前方microRNA阻礙時(shí)將其擠下，并繼續(xù)延伸，最終microRNA被完全頂下，脫離探針?lè)肿?，成為游離狀態(tài)而與新的折疊型探針?lè)肿幼R(shí)別并結(jié)合，從而進(jìn)入新一輪打開(kāi)探針-引物延伸-被擠下并脫離探針的循環(huán)。在每一次的識(shí)別，結(jié)合并打開(kāi)探針?lè)肿舆^(guò)程中都將產(chǎn)生熒光恢復(fù)。靶標(biāo)的循環(huán)使用達(dá)到信號(hào)的指數(shù)級(jí)放大。整個(gè)探針末端區(qū)和環(huán)狀區(qū)的堿基數(shù)直接影響到探針的穩(wěn)定性和特異性。經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)，使得探針游離狀態(tài)時(shí)保持折疊型，末端區(qū)以雙鏈存在，能與引物結(jié)合的部分被保護(hù)起來(lái)，因此不會(huì)產(chǎn)生非特異的背景信號(hào)。同時(shí)末端區(qū)不能過(guò)長(zhǎng)，保證探針與靶標(biāo)結(jié)合后，只有當(dāng)其完全與靶標(biāo)互補(bǔ)時(shí)，形成的雙鏈部分才能將折疊型打開(kāi)。因此多個(gè)靶標(biāo)和探針同時(shí)存在的混合體系中不會(huì)產(chǎn)生交叉影響，各探針的引物延伸過(guò)程不相互干擾。因此，只需選取激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)不重疊的熒光團(tuán)標(biāo)記各探針序列就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。通過(guò)軟件模擬，解鏈溫度的計(jì)算發(fā)現(xiàn)末端區(qū)9個(gè)堿基對(duì)，環(huán)狀區(qū)20-32個(gè)堿基時(shí)探針的背景最低，檢測(cè)效果最好。為方便使用，本發(fā)明還提供包括含有上述microRNA檢測(cè)探針的試劑盒。如含有兩種以上不同熒光標(biāo)記的所述檢測(cè)探針，來(lái)實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)對(duì)象的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒還進(jìn)一步包括引物，所述引物與檢測(cè)探針的末端區(qū)互補(bǔ)。所述引物為單鏈引物。本發(fā)明還提供同時(shí)檢測(cè)多種microRNAs的方法，其特征在于，包括如下步驟I)、根據(jù)待測(cè)microRNA設(shè)計(jì)合成權(quán)利要求2 5任一項(xiàng)所述的microRNA檢測(cè)探針，且不同種探針使用不同熒光標(biāo)記；2)、將合成的microRNA檢測(cè)探針與待測(cè)microRNA互補(bǔ)配對(duì),使得折疊型結(jié)構(gòu)打開(kāi)；3)、加入與檢測(cè)探針的末端區(qū)互補(bǔ)的引物，并加入不具外切酶活性的DNA聚合酶，通過(guò)引物延伸以及相應(yīng)的鏈置換釋放出microRNA，恢復(fù)產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)產(chǎn)生的檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的靶microRNA。
當(dāng)待測(cè)microRNA為miR199a時(shí),上述檢測(cè)方法的優(yōu)選的條件是microRNA檢測(cè)探針末端區(qū)的長(zhǎng)度設(shè)置為9個(gè)堿基，microRNA檢測(cè)探針的濃度為50nM，Bst大片段聚合酶的用量為20U每反應(yīng)體系。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于I、本發(fā)明的檢測(cè)microRNA的方法中，設(shè)計(jì)的每一個(gè)探針針對(duì)一個(gè)特定的microRNA序列；只需單一探針，不需要額外模板序列；信號(hào)強(qiáng)度與背景可相差20倍，探針對(duì)靶標(biāo)的特異性識(shí)別，在其他不與之完全配對(duì)的microRNA存在的情況下不產(chǎn)生明顯增強(qiáng)信號(hào)；所有結(jié)果均僅用熒光檢測(cè)即可明確地區(qū)分靶標(biāo)microRNA。2、本發(fā)明的HiiCT0RNA檢測(cè)探針可滿(mǎn)足不同檢測(cè)需要。探針可用于快速篩查病人 體液包括血清樣本，唾液樣本，尿液樣本等中是否含有靶標(biāo)microRNA ;對(duì)于已知存在靶標(biāo)miCToRNA的，通過(guò)本探針與標(biāo)準(zhǔn)品作工作曲線從而計(jì)算出實(shí)際樣品的靶標(biāo)含量。3、本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針對(duì)實(shí)際臨床樣本中的靶標(biāo)有較好響應(yīng)，且對(duì)于不同表達(dá)量的樣品有較好區(qū)分度。


圖I本發(fā)明的同時(shí)多色檢測(cè)microRNA方法的工作原理圖。圖2引物以及折疊探針濃度的優(yōu)化。圖3FAM標(biāo)記的針對(duì)miR199a探針的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 圖4凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5新方法的特異性檢測(cè)。圖6多色檢測(cè)的熒光光譜。圖7多色檢測(cè)的效果圖。圖8新方法對(duì)于人體血清microRNAs的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明中所涉及到的實(shí)驗(yàn)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)操作。實(shí)施例II.多色microRNAs檢測(cè)探針體系的設(shè)計(jì)(I)探針包含,與祀microRNA互補(bǔ)區(qū),該區(qū)域負(fù)責(zé)識(shí)別相應(yīng)的microRNA,這部分序列設(shè)計(jì)為特異檢測(cè)目標(biāo)microRNA ;末端區(qū)序列，當(dāng)沒(méi)有microRNA時(shí)，末端區(qū)保證探針為折疊型結(jié)構(gòu)，如圖I所示。探針的5’末端標(biāo)記不同的熒光，3’末端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，探針在通常條件下為折疊結(jié)構(gòu)，其中熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)距離靠近，熒光被淬滅。(2)所需達(dá)到的檢測(cè)目標(biāo)對(duì)于相應(yīng)祀標(biāo)microRNA探針能產(chǎn)生很好信號(hào)響應(yīng),突光應(yīng)可以達(dá)到明顯差別，并且對(duì)非靶標(biāo)miCToRNA不產(chǎn)生背景。2.驗(yàn)證探針的靈敏性和選擇性(I)寡核苷酸定量根據(jù)各寡核苷酸(探針A，B, C，D，短引物以及所合成的microRNAs)樣品管上所標(biāo)注的納摩爾數(shù)加入10倍微升數(shù)的超純水(電阻率為IO18 Ω)，充分溶解。取10 μ L寡核苷酸母液加入990 μ I雙蒸水中，即稀釋100倍，用于寡核苷酸定量，定量溶液95°C加熱5分鐘，取出迅速置于冰上冷卻，混勻后離心，破壞高濃度寡核苷酸母液中可能存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證寡核苷酸為單鏈狀態(tài)。測(cè)定寡核苷酸定量溶液在260nm處的紫外吸收值，根據(jù)各寡核苷酸的毫摩爾吸光系數(shù)，得到母液濃度，根據(jù)需要將各寡核苷酸母液稀釋成50 μ M或10 μ M，-20°C保存。(2)引物延伸反應(yīng)待測(cè)microRNA選取被研究較多的在多種腫瘤發(fā)病中非常重要的miR199a，miR215,miR21,miR155,microRNA200 家族的 miR141 及 miR429，它們的序列如表 I 所示。當(dāng)加入相應(yīng)的microRNA時(shí)，microRNA可以識(shí)別并與探針的環(huán)狀區(qū)配對(duì),從而打開(kāi)折疊探針，之后短引物可以結(jié)合到探針的3’末端，在所用的Bst聚合酶的作用下加入dNTPs，當(dāng)延伸的鏈遇到microRNA的阻礙時(shí),延伸段可以逐漸將結(jié)合在探針上的microRNA擠下來(lái)，當(dāng)全長(zhǎng)片段合成結(jié)束，microRNA被完全擠掉，成為自由狀態(tài)，因此可以尋找并識(shí)別新的折疊探針，從而開(kāi)始新的循環(huán)。miCToRNA可以影響探針在折疊結(jié)構(gòu)時(shí)的穩(wěn)定性，使得探針能在與靶標(biāo)microRNA結(jié)合后能被打開(kāi),從而起到一個(gè)引導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的開(kāi)關(guān)作用；當(dāng)microRNA不存在·時(shí)，折疊型探針的結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，短引物結(jié)合不上去，從而不能發(fā)生熒光增強(qiáng)的作用，保證了很低的檢測(cè)背景信號(hào)。表I相關(guān)microRNA、探針及引物
霖聚核酸__li$j(froni5’to3’)_
miR141 (RNA)UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG
miR429(RNA) ■UAAUACUGUCUGGUA.4AACCGU
_7] miRI99a(lNA)巧石石又石.舊石斤■石石
miR21(RNA) ~UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miR155(RNA)UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU
miR21 S(RNA)__AUGACCUAUGAAUL'GACAGAC_
PrAe-199aI(DNA)廣 ^^一八
WACTAG TGGGTTGGG-/BHQ/
Probc-141(DNA)
》TTACTAG TGGGTTGGG-/BHQ/::Cv3,:-rcCAACCCAirAACAnAGTCTGAMAGCm Prc*c-2i (DNA) ^
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Probe-155( DNA)
_、 j__TTACTAG TGGGTTGGG-/BHQ/_
_primer__CCCAACCCA_每個(gè)樣品為100 μ L反應(yīng)體系，包括DEPC水，10 X ThermoPol 緩沖溶液，Bst DNA大片段聚合酶，RNA酶抑制劑,雙標(biāo)記的折疊探針和不同濃度的祀標(biāo)microRNAs。具體的，取潔凈無(wú)RNase的PCR管，按順序加入上述組分，保證探針終濃度50nM，20U Bst DNA大片段聚合酶，microRNA濃度梯度稀釋?；靹蚝?7°C溫浴30mins，之后開(kāi)始檢測(cè)熒光。從系列探針優(yōu)化來(lái)看，引物區(qū)為7-11個(gè)堿基時(shí)效果較好，且背景相對(duì)較低，如圖2所示，當(dāng)引物與折疊模板的濃度比為10 1時(shí)，效果最好，Bst DNA聚合酶可以進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，導(dǎo)致熒光的增強(qiáng)，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)引物與折疊探針的濃度比需要優(yōu)化，由于短引物與折疊的識(shí)別與結(jié)合是分子間的反應(yīng)，為了促進(jìn)反應(yīng)的效率，本發(fā)明嘗試加大引物與折疊探針的比例，加入更多的引物。如圖2所示，在圖中，最高的一條柱狀線是50nM探針對(duì)于500nM引物，分析500pMmiR199a的信號(hào)響應(yīng)(當(dāng)沒(méi)有microRNA時(shí)，其背景很低)，第二高的一條柱狀線是50nM探針對(duì)于IOOnM引物，分析500pMmiR199a的信號(hào)響應(yīng)(當(dāng)沒(méi)有microRNA時(shí)，其背景較低)，第三高的一條曲線是50nM探針對(duì)于50nM引物，分析500pM miR199a的信號(hào)響應(yīng)。在圖中，最高的曲線是miR199a量為50nM且酶量為20U時(shí)的信號(hào)響應(yīng)(當(dāng)沒(méi)有microRNA時(shí)，其背景為最低的曲線)，第二高的曲線是探針量為500fM時(shí)的信號(hào)響應(yīng)(當(dāng)沒(méi)有microRNA時(shí)，其背景為最低的曲線)。(3)檢測(cè)樣品的突光信號(hào)當(dāng)折疊型探針打開(kāi)為雙鏈結(jié)構(gòu)后，本發(fā)明可以通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)熒光團(tuán)的激發(fā)以及發(fā)射，進(jìn)而推斷祀microRNA存在與否。引物延伸反應(yīng)在緩沖液20mMTris-HCl, IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl, 2mM MgSO4 and 0. l%TritonX-100at pH 8.8@25°C 中進(jìn)行。每個(gè)樣品含有指定濃度的各種寡核苷酸和20U的Bst DNA聚合酶。從檢測(cè)結(jié)果看， microRNA141濃度最低到500fM時(shí)，體系仍有明顯響應(yīng)，高濃度到50nM時(shí)有接近20倍信號(hào)增強(qiáng)，如圖3所示。在圖中，曲線的高度依次降低時(shí)，分別反映的是從50nM microRNA,5nM,500pM、50pM、5pM、500fM以及沒(méi)有microRNA時(shí)的信號(hào)響應(yīng)。具體步驟，取I. 5mL離心管，加入約88 μ L超純水、10 μ L 10 X ThermoPol 緩沖溶液、I μ L雙標(biāo)記的折置探針,之后加入Bst聚合酶的反應(yīng)體系。樣品混和均勾后尚心，37 C水浴鍋中反應(yīng)30分鐘，取出冷卻至室溫。本發(fā)明對(duì)于反應(yīng)的精細(xì)程度用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行了檢測(cè)，本發(fā)明利用了摻入探針的SpeI序列，將與不同濃度的miciORNA的引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物用SpeI酶切，酶切的時(shí)間為半小時(shí)，溫度為37度，并將產(chǎn)物電泳。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)不加入microRNA時(shí)，檢測(cè)不到任何條帶；一旦加入不同濃度的microRNAs,有兩條條帶出現(xiàn)在膠上,一條是延伸之后的雙鏈產(chǎn)物，一條是SpeI酶切的產(chǎn)物，這個(gè)是很明顯的證據(jù)。檢測(cè)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行,用LS55Perkin Elmer型突光分光光度計(jì)的光譜掃描模式進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)針對(duì)不同標(biāo)記的熒光團(tuán)選擇，發(fā)射光譜的范圍相應(yīng)，0. 5秒記錄I次數(shù)據(jù)，完成整個(gè)光譜的獲取。反應(yīng)前，用加樣槍將反應(yīng)溶液從管子中轉(zhuǎn)入熒光比色池，關(guān)閉樣品倉(cāng)門(mén)，點(diǎn)擊“開(kāi)始”按鈕，開(kāi)始記錄數(shù)據(jù)。從結(jié)果看，50nM miCToRNA濃度時(shí)，有很強(qiáng)的熒光產(chǎn)生，500fM時(shí)有明顯強(qiáng)于背景的熒光。特異設(shè)計(jì)針對(duì)miR199a的探針對(duì)于miR199a的響應(yīng)很強(qiáng)，針對(duì)與miR199a同源的miR215序列響應(yīng)很弱，如圖5所示。3.對(duì)于不同配比的多種microRNAs的檢測(cè)本發(fā)明利用四種不同的microRNAs,進(jìn)行了不同的組合。如表2所不，一共15 種，分別為樣品 1，miR199(50nM)；樣品 2，miR21 (50nM)；樣品 3，miR141 (50nM)；樣品 4，miR155(50nM)；樣品 5，miR21(50nM) and miR141 (50nM)；樣品 6，miR21(50nM)and miR155(50nM)；樣品 7，miR141 (50nM) andmiR155 (50nM)；樣品 8，miR199(50nM)and miR155(50nM)；樣品 9，miR199 (50nM) and miR141 (50nM)；樣品 10，miR199(50nM)and miR21(50nM)；樣品 11，miR21 (50nM)，miR141 (50nM) and miR155 ；樣品 12，miR199a (50nM), miR141 (50nM) and miR155(50nM);樣品 13，miR199a (50nM)，miR21 (50nM)and miR155(50nM);樣品 14，miR199a (50nM)，miR21 (50nM) and miR141 (50nM);樣品 15，miR199a (50nM)，miR21 (50nM)，miR141 (50nM) and miR155 (50nM)。本發(fā)明對(duì)它們的熒光進(jìn)行了多色檢測(cè)，其熒光圖如圖6所示。表2不同樣本microRNAs的組合
權(quán)利要求
1.一種熒光探針，其兩端至少包括一互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)段，且該探針的兩末端一端具有報(bào)告熒光基團(tuán)，另一端具有淬滅熒光基團(tuán)，其兩端的互補(bǔ)區(qū)段互補(bǔ)結(jié)合并且報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)能夠被淬滅熒光基團(tuán)吸收；檢測(cè)時(shí)熒光探針能形成雙鏈結(jié)構(gòu)，且報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，發(fā)出熒光信號(hào)。
2.—種microRNA檢測(cè)探針，其特征為折疊型結(jié)構(gòu)，包括 末端區(qū)，該區(qū)域?yàn)殡p鏈結(jié)構(gòu)； 環(huán)狀區(qū)，為單鏈結(jié)構(gòu)，包括待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列以及間隔序列，所述待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列與間隔序列相連，待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列的另一端以及間隔序列的另一端分別與末端區(qū)同一端的兩條雙鏈相連接，所述間隔序列不與探針的其它序列形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)探針，其特征在于，所述末端區(qū)為7 10bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)探針，其特征在于，所述間隔序列為6 9nt。
5.根據(jù)權(quán)利2或3所述的檢測(cè)探針，其特征在于，所述環(huán)狀區(qū)為2(T36nt。
6.含有權(quán)利要求Γ5任一項(xiàng)所述檢測(cè)探針的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其含有兩種以上不同熒光標(biāo)記的權(quán)利要求Γ5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于，其還包括引物，所述引物與檢測(cè)探針的末端區(qū)互補(bǔ)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述引物為單鏈引物。
10.同時(shí)檢測(cè)多種microRNAs的方法,其特征在于,包括如下步驟 1)、根據(jù)待測(cè)microRNA設(shè)計(jì)合成權(quán)利要求2、任一項(xiàng)所述的microRNA檢測(cè)探針,且不同種探針使用不同熒光標(biāo)記； 2)、將合成的microRNA檢測(cè)探針與待測(cè)microRNA互補(bǔ)配對(duì),使得折疊型結(jié)構(gòu)打開(kāi)； 3)、加入與檢測(cè)探針的末端區(qū)互補(bǔ)的引物，并加入不具外切酶活性的DNA聚合酶，通過(guò)引物延伸以及相應(yīng)的鏈置換釋放出microRNA，恢復(fù)產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)產(chǎn)生的檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的靶microRNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種microRNA熒光檢測(cè)探針，該探針為折疊結(jié)構(gòu)，包括末端區(qū)，該區(qū)域?yàn)殡p鏈結(jié)構(gòu)；環(huán)狀區(qū)，為單鏈結(jié)構(gòu)，包括待測(cè)靶標(biāo)的互補(bǔ)序列以及間隔序列，間隔序列不與探針的其它序列形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。該探針末端區(qū)能保持探針折疊型結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定，在加入含有檢測(cè)對(duì)象的樣品時(shí)，折疊型結(jié)構(gòu)打開(kāi)，加入與檢測(cè)探針的末端區(qū)互補(bǔ)的引物，并加入不具外切酶活性的DNA聚合酶，通過(guò)引物延伸以及相應(yīng)的鏈置換釋放出microRNA，并使探針恢復(fù)產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)產(chǎn)生的檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的靶microRNA。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)不同RNA的探針且標(biāo)記不同的熒光，則可以實(shí)現(xiàn)不同microRNA的同時(shí)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102899417SQ20121041176
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者周翔, 王少儒, 田沺, 翁小成, 肖珩 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)