專(zhuān)利名稱(chēng)：陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br₂在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s_Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)的發(fā)展使疾病在分子水平上的基因治療成為可能?；虔煼ǖ恼麄€(gè)過(guò)程為目的基因在載體的攜帶下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并實(shí)現(xiàn)基因修正和基因置換等，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常引起的疾病，或者通過(guò)干擾特定基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)治療的目的等(參見(jiàn) Qasba, P. K.等人，DNA and Gene Therapy: Transfer of Mouse DNA to Humanand Mouse Embryonic Cells byPolyoma Pseudovirions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA1971，68，2345-2349 ;以及Xia, Η. B.等人，siRNA-mediated gene silencing in vitro an·din vivo, Nat. Biotechnol. 2002，20，1006-1010)，基因療法的關(guān)鍵問(wèn)題之一便是如何將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)部，若單獨(dú)采用裸基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染，基因片段難于被細(xì)胞攝取，而且即便裸基因能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，也會(huì)被胞內(nèi)的核酸酶所降解。因此，尋找理想的基因載體是基因療法所面臨的一大難題。目前應(yīng)用的基因載體可分為兩大類(lèi)病毒載體和非病毒載體。病毒載體，主要包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等，它們轉(zhuǎn)染效率較高，但由于受到免疫原性、承載DNA能力、細(xì)胞靶向性和成本等因素的影響，限制了其應(yīng)用，參見(jiàn)Luo，D.等人，Synthetic DNAdelivery systems, Nat. Biotechnol. 2000，18，33-37。非病毒載體，主要是陽(yáng)離子載體通過(guò)其帶正電荷的基團(tuán)與DNA帶負(fù)電荷的磷酸根發(fā)生靜電作用，從而減弱DNA鏈上磷酸根負(fù)電荷之間的排斥作用，導(dǎo)致DNA彎曲、凝聚，甚至將DNA包載成一定大小的復(fù)合物進(jìn)行傳輸，有關(guān)一些合成類(lèi)物質(zhì)用于基因轉(zhuǎn)染的研究已引起人們的廣泛關(guān)注。其中，非病毒載體研究較多的幾類(lèi)為脂類(lèi)(參見(jiàn)Feigner, P. L.等，Lipofection:Ahighly efficient, Iipid—mediated DNA-transfectionprocedure, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1987，84，7413-7417)、聚電解質(zhì)(polyethylenimine 聚乙烯亞胺，參見(jiàn)Boussif, 0.等人，A versatile vector for gene and oligo-nucleotide transferinto celIsin culture and in vivo:Polyethyenimine,Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 1995, 92:7297-7301; dendrimers 樹(shù)枝狀聚合物，參見(jiàn) Nylander, Τ·等人，DNAcondensation using cationicdendrimers-morphology and supramolecular structureof formed aggregates, Soft Matter 2011,7,4577-4594)、高價(jià)陽(yáng)離子物質(zhì)(參見(jiàn)Leroux,J. C. Gene delivery with bisphosphonate-stabilized calcium phosphatenanoparticles, J. Control. Release 2011, 150, 87-93)等。盡管有關(guān)非病毒基因載體與DNA相互作用的研究受到了重視，但目前常用的陽(yáng)離子型聚合物作為基因載體的一個(gè)很大局限性在于聚合物分子的大小和價(jià)態(tài)的非均一性，這種非均一性直接導(dǎo)致所制備的載體/DNA結(jié)構(gòu)不同，給生物體內(nèi)的釋放研究帶來(lái)巨大困難。因此，隨著基因療法的不斷發(fā)展，需要發(fā)展新型的非病毒基因載體，提聞?shì)d體/DNA結(jié)構(gòu)的均一性，提聞基因轉(zhuǎn)染的效率，最終提聞基因治療的效果。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提出一種[Cn-s_Cnim]Br2作為非病毒基因載體負(fù)載DNA的技術(shù)方案，即[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物、制備方法及其在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。為了有助于理解本發(fā)明，下面定義了一些術(shù)語(yǔ)。本文定義的術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。除非另外說(shuō)明，本文中的[Cn-s-Cnim]Br2(n=10, 12，14 ；s=2, 4, 6)是指陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑，是由雙頭部和雙尾部構(gòu)成，中間由橋連基團(tuán)(短鏈飽和脂肪鏈)連接， 所述頭部由咪唑雜環(huán)構(gòu)成，所述尾部由疏水飽和脂肪鏈構(gòu)成。除非另外說(shuō)明，本文中的DNA是指質(zhì)粒DNA。除非另外說(shuō)明，本文中的復(fù)合物是指由兩種或兩種以上的不同的物質(zhì)所形成的結(jié)合體。納米復(fù)合物是指結(jié)合體的大小尺寸在納米級(jí)別。例如[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物是指由DNA通過(guò)相互結(jié)合而形成的結(jié)合體，復(fù)合物的尺寸大小在納米級(jí)別。除非另外說(shuō)明，本文中的Z+/-是指表面活性劑中咪唑基團(tuán)所帶正電荷與DNA分子中磷酸基團(tuán)所帶負(fù)電荷的摩爾比。盡管經(jīng)由理論計(jì)算得出每個(gè)咪唑基團(tuán)所帶正電荷為O. 74(參見(jiàn)Xu, G. Y.等人，Comparison of Aggregation Behaviors between Ionic Liquid-TypeImidazolium GeminiSurfactant[C12-4-C12im]Br2 and Its Monomer[C12mim]Br onSilicon Wafer, Langmuir, 2009, 25, 9721-9727),為簡(jiǎn)化計(jì)算，本文中每個(gè)Gemini 表面活性劑所帶正電荷以整數(shù)2進(jìn)行計(jì)算。為了實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案—種陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s_Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用,所述陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑，通式為[Cn-S_Cnim]Br2，n=10, 12，14 ；s=2,4,6,作為非病毒基因載體在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用時(shí)，先將[Cn-s-Cnim]Br2溶解于pH6. 8-7. 5的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液中，取100 μ L加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，孵育24小時(shí)，利用酶標(biāo)儀測(cè)試細(xì)胞樣品的吸光度值來(lái)測(cè)試細(xì)胞的存活率，通過(guò)細(xì)胞存活率判定[(^-『(^!!!扣^細(xì)胞毒性；所述的細(xì)胞包括人胚腎細(xì)胞(ΗΕΚ293細(xì)胞)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(Α549Υ-10細(xì)胞)或人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)。細(xì)胞存活率(％)=A570 (樣品)/A57tl (對(duì)照)X 100% (I)其中A57tl (樣品)為加入[Cn-s-Cnim]Br2后的細(xì)胞的吸光度，A570 (對(duì)照)為空白對(duì)照的細(xì)胞的吸光度。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選地，非病毒基因載體選自[C1Q-4-C1Qim]Br2、[C12-4_C12im]Br2、[C14-4-C14im]Br2、[C12-2_C12im]Br2 和[C12-6_C12im]Br2。進(jìn)一步優(yōu)選地，非病毒基因載體選自[C12-2-C12im]Br2、[C12-4-C12im]Br2 和[C12-6_C12im]Br2。其中，非病毒基因載體以[C12-4_C12im]Br2為例說(shuō)明，其有效誘導(dǎo)DNA凝聚，高效轉(zhuǎn)染基因。[C12-4-C12im]Br2可根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)制備,例如可參見(jiàn)Xu, G. Y.等人，SynthesisandProperties of Ionic Liquid-Type Gemini Imidazolim Surfactants, J. ColloidInterface Sci. 2008，326490-495;Aggregation and Thermodynamic Propertiesof Ionic Liquid-Type Gemini ImidazoliumSurfactants with Different SpacerLength, Colloid Polym Sci. 2009，287，395-402 文獻(xiàn)提供的方法制備。[C12-4_C12im]Br2 結(jié)
構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.一種陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用,所述陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑，通式為[Cn-S_Cnim]Br2，n=10，12，14 ；s=2,4,6,作為非病毒基因載體直接應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染時(shí)，先將[Cn-s-Cnim]Br2溶解于pH 6. 8-7. 5的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液中，取100 μ L加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，孵育24小時(shí)，利用酶標(biāo)儀測(cè)試細(xì)胞樣品的吸光度值來(lái)測(cè)試細(xì)胞的存活率，通過(guò)細(xì)胞存活率判定[Cn-s-Cnim]Br2細(xì)胞毒性；所述的細(xì)胞包括人胚腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549Y-10細(xì)胞)或人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑選自[C12-2-C 12im]Br2、[C12-4_C12im]Br2 和[C12-6-C12im]Br2 ;其中，優(yōu)選[C12-4_C12im]Br2。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑[C12-4-C12im]Br2有效誘導(dǎo)DNA凝聚形成[C12-4_C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物,包括步驟如下 分別用緩沖液配制[C12-4-C12im]Br2溶液和DNA溶液，[C12-4-C12im]Br2與DNA按照冗+/_為(1 50) : (I(Tl)的摩爾比制備混合溶液，使DNA溶液的終濃度為I X 10_6mOl/L I X 10_4mOl/L，再將該混合溶液室溫下孵育15 40分鐘，得到[C12-4_C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述[C12-4-C12im]Br2與DNA按照Z(yǔ)+/_為(Γ2): (I(Tl)的摩爾比；優(yōu)選地，所述[(12-4-(12址]81'2與0嫩按照Z(yǔ)+/-為(I 2): (2 I)的摩爾比。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于制備DNA溶液和[C12-4-C12im]Br2溶液的混合溶液時(shí)，將兩種溶液混勻并漩渦震蕩15 40秒；優(yōu)選地，漩渦震蕩30秒；混合溶液中DNA溶液的終濃度保持在I X 10_5mOl/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于用[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的方法為取制備的[(12-4-(121111]81'2/1)嫩納米復(fù)合物200^加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，所述的細(xì)胞選自人胚腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞或人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞；經(jīng)過(guò)24小時(shí)的孵育，用熒光倒置顯微鏡測(cè)定質(zhì)粒DNA上的綠色熒光蛋白(GFP)基因的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑[Cn-s-Cnim]Br2在基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。本發(fā)明中非病毒基因載體為陽(yáng)離子型咪唑Gemini表面活性劑([C12-4-C12im]Br2)，緩沖液配制的[C12-4-C12im]Br2溶液可直接應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染。本發(fā)明還提供了[C12-4-C12im]Br2有效誘導(dǎo)DNA凝聚形成[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物的方法；向受體細(xì)胞添加[C12-4-C12im]Br2/DNA的納米復(fù)合物的緩沖液溶液，可以實(shí)現(xiàn)基因在細(xì)胞內(nèi)的高效率轉(zhuǎn)染。本發(fā)明中[Cn-s-Cnim]Br2及[C12-4-C12im]Br2/DNA納米復(fù)合物對(duì)不同的細(xì)胞均具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，且對(duì)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102943086SQ201210404508
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月22日
發(fā)明者徐桂英, 周亭, 楊延蓮, 敖明祺, 李平, 王琛 申請(qǐng)人:山東大學(xué)