專利名稱：一種海洋骨膠原肽鈣螯合物生物補鈣劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種海洋骨膠原肽鈣螯合物生物補鈣劑的制備方法，屬于現(xiàn)代食品加工和生物技術領域。
背景技術：
鈣是人體生命活動所必需的礦物元素，是機體新陳代謝的源泉。鈣也是人體中含量最豐富的礦物元素，對維持人體的循環(huán)、呼吸、內分泌及骨骼等系統(tǒng)的正常生理功能具有不可替代的作用。我國居民的膳食組成以植物性食物為主，其植酸鹽、纖維素、草酸等含量較高，居民的鈣吸收率偏低，尤其孕產婦、老年人、兒童缺鈣現(xiàn)象更為嚴重。人體缺鈣會導致骨質疏松、佝僂病、易過敏等嚴重后果。近年來，隨著人們對健康及營養(yǎng)問題關注度增加，補鈣成為了熱門話題?！?br> 骨骼中的鈣以羥基磷酸鈣的形式與骨膠原粘合而固定下來的。骨骼中若無骨膠原，羥基磷酸鈣只能以分子和顆粒的形式堆積，則不能稱之為骨骼。此外，骨骼中如果沒有足夠的膠原或其合成速度小于降解速度，骨鈣則進入血漿，導致血鈣濃度升高而排出體外，從而引起骨質疏松等疾病。所以，在補鈣的同時應補充骨膠原，以促進鈣的吸收和固定。CN101731666A公開一種魚骨生物活性多肽鈣粉，包括將魚骨研磨成魚骨泥；加入復合蛋白酶酶解，離心；將上清液超濾、濃縮、干燥成魚骨蛋白多肽粉；將離心所得沉淀物烘干得可溶性鈣；將所得魚骨蛋白多肽粉和所得可溶性鈣混合。然而，該技術僅僅是將骨膠原肽與鈣源簡單混合?，F(xiàn)代研究已經(jīng)證實，骨的生長除了需要鈣以外，還需要有蛋白質。骨膠原蛋白不僅能夠增加骨的韌性，還可以與鈣結合，避免骨鈣的流失。生物體內許多具有抗氧化活性的物質屬于蛋白質和肽類，膠原肽(膠原多肽)是各種動物膠原蛋白(皮、骨、關節(jié)等)經(jīng)蛋白酶等降解處理后得到的相對分子量在20kDa以下的產物，其消耗吸收性不僅能夠大大提高，同時還具有膠原蛋白的功能特性。研究發(fā)現(xiàn)，膠原肽具有減緩動脈硬化發(fā)生、抗氧化、降血壓、改善骨質疏松、促進皮膚膠原代謝等功能。CN102241733A公開了一種鹿骨膠原多肽螯合鈣，采用酶水解及超聲輔助法提取鹿骨中的膠原蛋白，得到膠原蛋白水解成膠原多肽，和鹿骨鈣或無機鈣源進行化學螯合，經(jīng)過冷凍干燥制得。CN102429236A公開了一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法，包括制備豬骨泥；接種粘質沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種，發(fā)酵培養(yǎng)，離心，上清液制得骨膠原多肽，分離出的骨泥渣制得可溶性的骨鈣；將骨膠原多肽和可溶性骨鈣螯合，制得豬骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑。CN102429891A公開了一種低分子量羊骨膠原多肽鈣螯合物微膠囊的制備方法，包括制備羊骨粉，添加胃蛋白酶酶解，添加木瓜蛋白酶酶解，離心，上清液得骨膠原多肽；加入氯化鈣或可溶性羊骨鈣螯合反應，制備低分子量羊骨膠原多肽鈣螯合物微膠囊。上述方法均采用陸地動物的骨源制作螯合補鈣劑，其應用范圍比較局限，一是因為陸地動物易患疾病，特別是微生物感染疾病，如豬瘟、豬肺疫、豬丹毒、鏈球菌病、副傷寒、乙型腦炎等；羊的細菌病，包括肉毒梭菌中毒癥、彎曲菌病、沙門氏菌病、鏈球菌病、羊猝疽、腸毒血癥，羊的病毒病，包括口蹄疫、綿羊痘、梅迪一維斯納病等；鹿的壞死桿菌病等等。造成骨源的污染性和帶菌性，特別是病死的動物。二是出于宗教原因，很多地區(qū)的人們不能接受陸地動物來源的食料等等。海洋骨膠原肽(MOP)是一種低聚肽，因此也稱海洋骨膠原低聚肽，具有多種生理功能，能保護胃黏膜以及抗?jié)?，促進皮膚膠原代謝，抑制血壓上升，促進鈣離子吸收和降低血清中膽固醇含量等，且其在鈣離子吸收過程中，不需要VD的參與，就能促進鈣的吸收。海洋骨原肽是從海洋魚骨中酶解提取的小分子低聚肽，可直接被機體腸道吸收和利用。“海洋骨膠原肽對去卵巢大鼠體重以及胰腺細胞凋亡和組織病變的影響”(朱翠鳳等，《中國老年學雜志》2007年6月第27卷，P1046-1049)中研究了從三文魚等海洋水產品骨頭和殘余肌肉中通過體外酶解法水解提取的低聚活性肽混合物具有非常好的水溶性和抗氧化、提高免疫力等功能。研究顯示，海洋骨原肽可能明顯增加去卵巢大鼠股骨的骨密度 和骨礦物質含量。其作用機制可能是由于海洋骨原肽可能促進成骨細胞的增殖和分化，促進骨形成，對增加骨量有協(xié)同作用；同時，海洋骨原肽可能抑制破骨細胞的增殖和分化，減少骨吸收和骨量丟失，抑制骨吸收?！昂Ｑ篝~骨膠原低聚肽改善骨質疏松的效果觀察”(潘興昌等，《預防醫(yī)學情報雜志》2011年5月第27卷第5期，P393-395)中研究了膠原肽能夠促進鈣質吸收、增加骨密度，對骨代謝具有有益作用，海洋魚膠原低聚肽能夠促進人體骨膠原蛋白的合成，與骨細胞和鈣、磷等礦物質共同促進新骨形成，增加骨鈣沉積。目前，現(xiàn)有技術中還沒有關于海洋骨膠原肽與鈣絡合形成的螯合物的技術。由于海洋骨膠原肽具有很多利用骨質的優(yōu)勢，因此本發(fā)明將提出一種海洋骨膠原肽與鈣螯合形成螯合物的技術，不僅能使鈣離子在海洋骨膠原肽的粘合下沉積在骨骼中，而且能促進游離鈣離子的吸收，從而有效預防和改善因缺鈣而引起的骨質疏松、佝僂病及過敏等健康問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明在于彌補現(xiàn)有技術中的不足，提出一種海洋骨膠原肽鈣螯合物補鈣劑的制備方法，利用海洋骨膠原肽與可溶性鈣源螯合成一種新型的功能性補鈣食品。該補鈣劑制備過程安全，在偏酸性條件下溶解性較好，無毒副作用，而且由于海洋骨膠原肽的存在，還具有抑制血壓上升和促進皮膚膠原代謝等功能。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，本發(fā)明的方法包括酶解、螯合和沉淀步驟，其中酶解步驟包括在魚骨中加入堿性蛋白酶酶解，然后加入木瓜蛋白酶酶解，制成骨膠原肽；螯合步驟包括在骨膠原肽溶液中加入鈣源進行螯合反應；沉淀步驟包括將螯合液用無水乙醇進行沉淀，得海洋骨膠原肽鈣螯合物。在實現(xiàn)本發(fā)明制備方法的一個具體的實施方案中，本發(fā)明的方法包括如下步驟(I)原料預處理將魚骨絞碎，加入堿水進行乳化，(2)酶解加入堿性蛋白酶，在55°C，pH = 8.5條件下，酶解2 3h，然后溫度降至40°C，調節(jié)pH = 6. 5，加入木瓜蛋白酶，在60°C下反應I. 5 2h，滅酶4 5min，制成骨膠原肽，(3)螯合在骨膠原肽溶液中加入鈣源，使骨膠原肽與鈣源質量比為5 I 3 1，調節(jié)反應液pH值為4 7，溫度保持在40°C 70°C下反應40 80min，(4)乙醇沉淀將反應液冷卻，加入無水乙醇進行沉淀，得海洋骨膠原肽鈣螯合物沉淀液，(5)沉淀收集將沉淀液液過濾，收集沉淀，獲得海洋骨膠原肽螯合鈣。本發(fā)明的方法中，步驟(I)的原料預處理,可以加入5 8倍體積的pH8. 5 9. 5的堿水，在40 50°C下進行乳化。乳化的作用是便利于后面的酶解處理，提高酶解效率。本發(fā)明的方法中，步驟⑵的酶解，加入堿性蛋白酶時，原料與堿性蛋白酶的質量比可以為500 I 500 1.5 ;加入木瓜蛋白酶時，原料與加入木瓜蛋白酶的質量比可以為 500 2 500 3。 本發(fā)明的方法中，步驟(3)的螯合，鈣源優(yōu)選選自氯化鈣或氫氧化鈣。其他鈣源也是可以的，只要是可溶性鈣，例如硫酸鈣。本發(fā)明的方法中，步驟(4)的乙醇沉淀，可以是加入螯合液2 4倍體積的無水乙醇進行沉淀。本發(fā)明的方法中，步驟(5)的沉淀收集，可以將收集的沉淀用無水乙醇洗滌，獲得海洋骨膠原肽螯合鈣。本發(fā)明的方法中，在螯合步驟之后，進行乙醇沉淀步驟之前，可以將螯合液在45°C 55°C下進行濃縮，以便更有利于隨后的乙醇沉淀效果。在實現(xiàn)本發(fā)明制備方法的另一個具體的實施方案中，其他步驟與上一個實施方案一致，只是將酶解后得到的骨膠原肽，干燥制成海洋骨膠原肽粉，然后再將此海洋骨膠原肽粉重新配制成多肽溶液，用配置的多肽溶液與鈣源進行螯合反應、沉淀，得海洋骨膠原肽鈣螯合物沉淀物。這個實施方案的一個優(yōu)選具體步驟包括如下原料預處理稱取一定量的新鮮魚骨，用清水反復清洗。清洗干凈后絞碎，加入
5-8倍體積的堿水(pH8. 5-9. 5)，在40-50°C下進行乳化。酶解將乳化后的原料移入酶解罐，加熱至55°C，調節(jié)pH = 8. 5。加入堿性蛋白酶，原料與酶以500 1-500 I. 5的質量混合。55°C，pH = 8. 5的條件下，酶解2_3h。然后溫度降至40°C，調節(jié)pH = 6. 5，加入木瓜蛋白酶，原料與酶以500 2-500 3的質量比混合。溫度調至60°C，反應I. 5-2h。100°C滅酶4-5min。噴霧干燥將魚骨膠原肽澄清液蒸發(fā)濃縮至固形物含量為30-50%。使用離心式噴霧干燥機干燥魚骨膠原肽。得到淡黃色粉末狀海洋骨膠原肽。多肽溶液的配制稱取一定量的海洋骨膠原肽，加入蒸餾水，海洋骨膠原肽與蒸餾水以2 100-6 100的質量比混合，制備得到濃度為2%-6%的多肽溶液。螯合鈣離子稱取一定質量的氯化鈣，使混合溶液中多肽與氯化亞鐵的質量比為5:1-3: I。加入酸調整pH值為4-7，攪拌使其充分溶解，將反應液置于密閉反應器中，400C -70°C下反應 40-80min。濃縮反應液靜置冷卻，置于真空濃縮設備中，在45°C -55°C下利用真空濃縮設備對反應液進行濃縮。
產品純化及干燥在按照I : 4-1 2的體積比向濃縮液中加入無水乙醇，放置在室溫中沉淀4-6h，真空抽濾收集沉淀并，用無水乙醇洗滌除去游離鈣離子，通過干燥得到海洋骨膠原肽鈣螯合物固體粉末。本發(fā)明的魚骨可以來源于任何海洋魚類的骨頭，例如三文魚，鮫錬魚等。溶解性實驗表明，海洋骨膠原肽微溶于中性水溶液，在偏酸性條件下溶解度增加。溶液澄清透明，呈淡黃色。對本發(fā)明海洋骨膠原肽螯合鈣離子前后的紅外光譜進行譜圖對比，傅里葉紅外光譜分析表明3066111c-1處出現(xiàn)吸收峰(0H與NH伸縮振動頻率重疊)，同時在92511^1 —處有吸收峰，說明含有-COOH結構131511^1處，出現(xiàn)吸收峰(偏磷酸鹽PO2反對稱伸縮)； 1085H1C-1處出現(xiàn)強吸收峰。螯合物傅里葉紅外光譜圖3066H1C-1處吸收峰變窄，且92511^1處吸收峰消失，說明鈣離子與海洋骨膠原肽在-COOH位置結合。3200-300011^1有寬吸收峰，而螯合后此處吸收峰變窄，并向高波位移動，且在ΙΟδδπκΓ1處出現(xiàn)強吸收峰，說明Ca2+與氨基結合。這個實驗不僅驗證說明制備海洋骨膠原肽鈣螯合物工藝的可行性，而且證明制備的螯合物是不同于海洋骨原肽的一種新物質。因此，本發(fā)明還提供一種通過本發(fā)明方法或任一種優(yōu)選方法制備而成的海洋骨膠原肽鈣螯合物。由于海洋骨原肽主要是魚骨膠原蛋白的酶水解產物，因此本發(fā)明的海洋骨膠原肽鈣螯合物易于吸收和利用，能夠為機體骨骼膠原蛋白的更新提供優(yōu)質而且必需的氮源營養(yǎng)物質。與陸生動物來源的骨膠原蛋白肽相比，海洋骨原肽具有來源安全的特點，無瘋牛病、口蹄疫、寄生蟲傳染等危害，同時可以避免一些宗教習慣和生活習俗的限制。營養(yǎng)和功能上，由于海洋骨原肽來源于海洋魚骨，在功能肽結構組成以及氨基酸序列上均具有陸生動物不可比擬的優(yōu)勢。特別是，海洋魚骨膠原低聚肽具有促進鈣質吸收、增加骨密度，能夠促進人體骨膠原蛋白的合成，可以改善骨質疏松。將海洋魚膠原低聚肽與鈣質進行螯合，可以充分利用海洋骨原肽自身的優(yōu)勢，可以進一步促進骨細胞和新骨形成，增加骨鈣沉積。通過對骨質疏松患者的研究發(fā)現(xiàn)，食用本發(fā)明海洋骨膠原肽鈣螯合物營養(yǎng)制劑的患者在試驗結束后，自覺癥狀和體征均有不同程度的改善或消失，在改善骨質疏松的效果方面，優(yōu)于陸生動物來源蛋白肽或水解物的鈣螯合產品，也優(yōu)于單純補充鈣劑。本發(fā)明的海洋骨膠原肽鈣螯合物可以按照常規(guī)技術制備成口服液、片劑、膠囊、口服顆粒劑等劑型。


圖I是本發(fā)明方法制備的海洋骨膠原肽鈣螯合物的海洋骨膠原肽螯合鈣離子前后的紅外光譜的譜圖對比，橫坐標是紅外波長，縱坐標是透光率。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并不限制本發(fā)明的范圍。實施例I
原料預處理稱取I. Okg新鮮三文魚骨，用清水反復清洗。清洗干凈后絞碎,加入7倍體積的堿水(pH = 9)，在50°C下進行乳化。酶解將乳化后的原料移入酶解罐，加熱至55°C，調節(jié)pH = 8. 5。加2. 2g堿性蛋白酶，混合均勻。55°C，pH = 8. 5的條件下，酶解3h。然后溫度降至40°C，調節(jié)pH = 6. 5，加入5. Og木瓜蛋白酶，混合均勻。溫度調至60°C，反應2h。100°C滅酶5min。噴霧干燥將魚骨膠原肽澄清液蒸發(fā)濃縮至固形物含量為30-50%。使用離心式噴霧干燥機干燥魚骨膠原肽。得到淡黃色粉末狀海洋骨膠原肽。多肽溶液的配置稱取4. Og的海洋骨膠原肽于反應器中，加入IOOmL蒸餾水攪拌溶解，得濃度為4. 0%重量百分比的多肽溶液。 鈣離子螯合稱取I. Og氯化鈣固體，溶解于多肽溶液中，使其濃度達到I. 0%重量百分比。，攪拌溶解。加入鹽酸調節(jié)pH為6，將反應液置于60°C反應罐中，反應lh。濃縮反應液靜置冷卻，置于真空濃縮設備中，利用真空濃縮設備在45°C -55°C下濃縮反應液。產品純化及干燥向濃縮液中以I : 3的體積比加入無水乙醇，進行乙醇沉淀，靜置4h，并用無水乙醇洗滌。在50°C下真空干燥30min，得到海洋骨膠原肽鈣螯合物原粉。試驗表明，所得海洋骨膠原肽鈣螯合物原粉呈淡黃色粉末狀。不溶于中性水溶液中，片酸性條件下溶解度逐漸增加。實施例2原料預處理稱取2. Okg金槍魚骨，用清水反復清洗。清洗干凈后絞碎，加入7倍體積的堿水(pH = 9)，在50°C下進行乳化。酶解將乳化后的原料移入酶解罐，加熱至55°C，調節(jié)pH = 8. 5。加入5. Og堿性蛋白酶，混合均勻。55°C，pH = 8. 5的條件下，酶解3h。然后溫度降至40°C，調節(jié)pH = 6. 5，加入10. Og木瓜蛋白酶，混合均勻。溫度調至60°C，反應2h。100°C滅酶5min。鈣離子螯合稱取I. 5g氫氧化鈣固體，溶解于多肽溶液中，使其濃度達到I. 5%重量百分比。，攪拌溶解。加入鹽酸調節(jié)pH為6，將反應液置于60°C反應罐中，反應lh。濃縮反應液靜置冷卻，置于真空濃縮設備中，利用真空濃縮設備在45°C -55°C下濃縮反應液。產品純化及干燥向濃縮液中以I : 3的體積比加入無水乙醇，進行乙醇沉淀，靜置4h，并用無水乙醇洗滌。在50°C下真空干燥30min，得到海洋骨膠原肽鈣螯合物原粉。實施例3將實施例I制備的海洋骨膠原螯合鈣粉通過傅里葉紅外光譜儀，掃描的紅外光
-i'TfeP曰。海洋骨膠原肽鈣螯合物傅立葉紅外光譜檢測分析結果，傅里葉紅外光譜分析表明3066111c-1處出現(xiàn)吸收峰(0H與NH伸縮振動頻率重疊)，同時在92511^1 —處有吸收峰，說明含有-COOH結構131511^1處，出現(xiàn)吸收峰(偏磷酸鹽PO2反對稱伸縮)108511^1處出現(xiàn)強吸收峰。螯合物傅里葉紅外光譜圖3066H1C-1處吸收峰變窄，且925H1C-1處吸收峰消失，說明鈣離子與海洋骨膠原肽在-COOH位置結合。3200-300011^1有寬吸收峰，而螯合后此處吸收峰變窄，并向高波位移動，且在1085ΠΚΓ1處出現(xiàn)強吸收峰，說明Ca2+與氨基結合。這個實驗不僅驗證說明制備海洋骨膠原肽鈣螯合物工藝的可行性，而且證明制備的螯合物是不同于海洋骨原肽和氯化鈣的一種新物質 。
權利要求
1.一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，其特征在于，該方法包括酶解、螯合和沉淀步驟，其中 酶解步驟包括在魚骨中加入堿性蛋白酶酶解，然后加入木瓜蛋白酶酶解，制成骨膠原肽； 螯合步驟包括在骨膠原肽溶液中加入鈣源進行螯合反應； 沉淀步驟包括將螯合液用無水乙醇進行沉淀，得海洋骨膠原肽鈣螯合物。
2.如權利要求I所述的一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (1)原料預處理將魚骨絞碎，加入堿水進行乳化， (2)酶解加入堿性蛋白酶，在55°C，pH= 8. 5條件下，酶解2 3h，然后溫度降至40°C，調節(jié)pH = 6. 5，加入木瓜蛋白酶，在60°C下反應I. 5 2h，滅酶4 5min，制成骨膠原肽， (3)螯合在骨膠原肽溶液中加入鈣源，使骨膠原肽與鈣源質量比為5: I 3 : 1，調節(jié)反應液PH值為4 7，溫度保持在40°C 70°C下反應40 80min， (4)乙醇沉淀將反應液冷卻，加入無水乙醇進行沉淀，得海洋骨膠原肽鈣螯合物沉淀液， (5)沉淀收集將沉淀液液過濾，收集沉淀，獲得海洋骨膠原肽螯合鈣。
3.如權利要求2所述的一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，其特征在于，步驟(I)的原料預處理中，加入5 8倍體積的pH8. 5 9. 5的堿水，在40 50°C下進行乳化。
4.如權利要求2所述的一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，其特征在于，步驟(2)的酶解中，加入堿性蛋白酶時，原料與堿性蛋白酶的質量比為500 : I 500 : I. 5;加入木瓜蛋白酶時，原料與加入木瓜蛋白酶的質量比為500 : 2 500 : 3。
5.如權利要求2所述的一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，其特征在于，步驟(3)的螯合中，鈣源選自氯化鈣或氫氧化鈣。
6.如權利要求2所述的一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，其特征在于，步驟(4)的乙醇沉淀中，加入螯合液2 4倍體積的無水乙醇進行沉淀，步驟(5)的沉淀收集中，將收集的沉淀用無水乙醇洗滌，獲得海洋骨膠原肽螯合鈣。
7.如權利要求2-5任一項所述的一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，其特征在于，在螯合步驟之后，進行乙醇沉淀步驟之前，將螯合液在45°C 55°C下進行濃縮。
8.一種海洋骨膠原肽鈣螯合物，其特征在于是按照權利要求1-7中任一項所述的海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法制備。
9.權利要求8的海洋骨膠原肽鈣螯合物在制備口服液、片劑、膠囊、顆粒劑補鐵劑型中的用途。
全文摘要
一種海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法，包括酶解、螯合和沉淀步驟，其中酶解步驟包括在魚骨中加入堿性蛋白酶酶解，然后加入木瓜蛋白酶酶解，制成骨膠原肽；螯合步驟包括在骨膠原肽溶液中加入鈣源進行螯合反應；沉淀步驟包括將螯合液用無水乙醇進行沉淀，得海洋骨膠原肽鈣螯合物。本發(fā)明的海洋骨膠原肽鈣螯合物的制備方法。以三文魚、鮟鱇魚等海洋魚產品加工廢料雜魚骨為原料制得無腥味淡黃色粉末狀魚骨膠原肽，并將其與氯化鈣螯合。產品在偏酸性條件下溶解為淡黃色液體，通過傅里葉紅外光譜對螯合物進行結構鑒定，鈣離子與多肽中-COOH和氨基結合形成配位鍵，說明生成了一種新型的海洋骨膠原肽鈣螯合物。本發(fā)明采用魚產品加工廢料魚骨制備骨膠原肽，充分利用資源，且原料安全無毒，制備過程無有害物質參加和產生，且工藝簡單、成本低廉，可用補鈣類保健品及藥品的制備。
文檔編號A23L1/29GK102871121SQ201210380780
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權日2012年10月10日
發(fā)明者蔡木易, 魯軍, 高菲, 谷瑞增, 易維學, 董哲, 馬勇, 陳亮, 潘興昌, 徐亞光, 馬永慶, 林峰, 金振濤, 劉文穎, 陸路, 劉艷, 魏穎, 張海欣 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院