一種可用于治療神經(jīng)元退行性病變的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可用于治療神經(jīng)元退行性病變的藥物組合物。本發(fā)明提供了一種特異性誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的方法，具體地，首先將Myt1L基因構(gòu)建在病毒載體上，包裝獲得帶有Myt1L的假病毒顆粒，并通過Myt1L假病毒顆粒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可將膠質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞。所獲得的神經(jīng)元細(xì)胞及其組合物，能夠在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病等的治療中有潛在價(jià)值。
【專利說明】—種可用于治療神經(jīng)元退行性病變的藥物組合物
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種特異性誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元細(xì)胞的方法和組合物。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]干細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有著十分廣闊的應(yīng)用前景，胚胎干細(xì)胞具有全面分化的潛能，成為研究的熱點(diǎn)。1997年英國科學(xué)家Wilmut等人將羊體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入去核的卵母細(xì)胞中并發(fā)育成成熟的個體——著名的多利羊，從而在實(shí)踐中證實(shí)了體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成為全能干細(xì)胞的可能性。2006年，日本科學(xué)家Takahashi和Yamanaka發(fā)現(xiàn)4個轉(zhuǎn)錄因子(0ct_4、Sox-2、Klf4和c-Myc)共同作用小鼠皮膚細(xì)胞后，能夠成功的將其誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)分化為可以向三個胚層分化的多能干細(xì)胞，2007年Takahashi和Yamanaka利用這四個轉(zhuǎn)錄因子成功的將人的表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成多功能干細(xì)胞。盡管Takahashi和Yamanaka的研究成為了干細(xì)胞研究領(lǐng)域中的一個里程碑，但在實(shí)際操作中必須經(jīng)歷從體細(xì)胞誘導(dǎo)獲得多功能干細(xì)胞，再從多功能干細(xì)胞基礎(chǔ)上定向分化為目的靶細(xì)胞，整個過程步驟多、周期長，失敗率高，所分化的細(xì)胞還具有腫瘤形成的潛在危險(xiǎn)，這些問題不利于該技術(shù)的推廣和應(yīng)用。
[0005]2010年Wernig實(shí)驗(yàn)室首次在Nature上報(bào)道了通過fcn2、Ascll和Mytll三個因子將小鼠的體細(xì)胞直接誘導(dǎo)獲得具有功能性的類似神經(jīng)元細(xì)胞，開啟了神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究的新篇章。2011年Wernig實(shí)驗(yàn)室通過Brn2、Ascll、Mytll和NeuroDl四個轉(zhuǎn)錄因子,將人的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成功能性神經(jīng)元細(xì)胞。這些研究簡化了從體細(xì)胞誘導(dǎo)到多功能干細(xì)胞再定向分化為神經(jīng)元的繁`瑣途徑，為神經(jīng)生物學(xué)研究提供了更為有效的工具。
[0006]帕金森病主要是因位中腦部位〃黑質(zhì)〃區(qū)中的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生病變，多巴胺的合成減少、抑制乙酰膽堿的功能降低而造成的，病變之后，神經(jīng)元數(shù)量減少、功能下降，該區(qū)域?qū)荒z質(zhì)細(xì)胞所“占領(lǐng)”，如果能夠讓這些膠質(zhì)細(xì)胞再變回為神經(jīng)元細(xì)胞，那么也許對于帕金森病的治療有一定的幫助作用。
[0007]綜上，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)簡便有效誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的方法和組合物。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明目的為提供一種簡便有效的誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的方法和組合物。
[0010]
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種MytlL基因或MytlL蛋白的用途，用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
[0011 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物。[0012]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種假病毒顆粒，所述假病毒顆粒具有以下特征:
(a)攜帶外源的MytlL的編碼序列；
(b)可感染膠質(zhì)細(xì)胞，并且在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源的MytlL轉(zhuǎn)錄因子。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的MytlL來源于人。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的假病毒顆粒選自下組慢病毒、腺病毒、皰疹病毒、或痘病毒。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的假病毒顆粒是如下制備的:
將攜帶MytlL的編碼序列的載體導(dǎo)入假病毒顆粒的包裝細(xì)胞中，從而形成假病毒顆粒。
[0016]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5’至3’依次包括以下元件:
膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子、MytlL的編碼序列、終止密碼子。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子包括:GFAP啟動子(GFAP，膠質(zhì)纖維酸性蛋白)和HRE-GFAP雜合啟動子(HRE，低氧反應(yīng)元件)。
[0018]在另一優(yōu)選例中，MytlL來源于哺乳動物，優(yōu)選人。
[0019]在本發(fā)明的第四方 面，提供了一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有本發(fā)明第三方面中所述的表達(dá)盒。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒載體。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體、或腺相關(guān)病毒載體。
[0022]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物包括(i)藥學(xué)上可接受的載體以及(ii)本發(fā)明第四方面所述的表達(dá)載體或本發(fā)明第二方面所述的假病毒顆粒。
[0023]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種本發(fā)明第四方面所述表達(dá)載體或本發(fā)明第二方面所述的假病毒顆粒的用途，它們被用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
[0024]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞的方法，包括步驟:
在外源MytlL蛋白存在下，培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的外源MytlL蛋白包括在培養(yǎng)體系中添加的MytlL蛋白，或在所述膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源MytlL編碼序列而產(chǎn)生的外源MytlL蛋白。
[0026]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
[0027]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1顯示了用于構(gòu)建MytlL慢病毒載體的載體FUGW的結(jié)構(gòu)圖。
[0029]圖2顯示了被MytlL慢病毒感染后的U251細(xì)胞的明視野圖。[0030]圖3顯示了被MytIL慢病毒感染后的U251細(xì)胞的熒光野圖，結(jié)果說明被感染的細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)Tujl蛋白。
[0031]圖4顯示了被MytlL慢病毒感染后的U251細(xì)胞的DAPI染色圖，說明細(xì)胞核處被染色。
[0032]圖2-圖4結(jié)果顯示，被感染的細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)神經(jīng)特異性蛋白Tujl。
[0033]
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明人經(jīng)過長期深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，MytlL單基因可有效地誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明人將MytlL基因構(gòu)建在病毒載體上，包裝獲得帶有MytlL的假病毒顆粒，并通過MytlL假病毒顆粒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0035]啟動子
在本發(fā)明中，可用的啟動子沒有特別限制，為一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，有與MytlL模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。可以選自組成性因子、誘導(dǎo)性因子和組織特異性因子。更佳地為組織特異性啟動子，如膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子，可在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性啟動遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。 MytlL基因和蛋白
MytlL,髓磷脂轉(zhuǎn)錄因子樣蛋白，作為一個轉(zhuǎn)錄因子，參與神經(jīng)細(xì)胞的分化；中央神經(jīng)系統(tǒng)中在神經(jīng)元和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用。
[0036]基因名稱:MYT1L物種:人源；轉(zhuǎn)錄本的Genbank編號:NM_015025。
[0037]MYTlL的氨基酸序列的登錄號為NP_055840，具體序列如下:
MEVDTEEKRH RTRSKGVRVP VEPAIQELFS CPTPGCDGSG HVSGKYARHR SVYGCPLAKK60
RKTQDKQPQE PAPKRKPFAV KADSSSVDEC DDSDGTEDMD EKEEDEGEEY SEDNDEPGDE120
DEEDEEGDRE EEEEIEEEDE DDDEDGEDVE DEEEEEEEEE EEEEEEENED HQMNCHNTRI180
MQDTEKDDNN NDEYDNYDEL VAKSLLNLGK IAEDMYRAR TESEMNSNTS NSLEDDSDKN240
ENLGRKSELS LDLDSDVVRE TVDSLKLLAQ GHGVVLSENM NDRNYADSMS QQDSRNMNYV300
MLGKPMNNGL MEKMVEESDE EVCLSSLECL RNQCFDLARK LSETNPQERN PQQNMNIRQH360
VRPEEDFPGR TPDRNYSDML NLMRLEEQLS PRSRVFASCA KEDGCHERDD DTTSVNSDRS420
EEVFDMTKGN LTLLEKAIAL ETERAKAMRE KMAMEAGRRD NMRSYEDQSP RQLPGEDRKP480
KSSDSHVKKP YYDPSRTEKK ESKCPTPGCD GTGHVTGLYP HHRSLSGCPH KDRVPPEILA540
MHESVLKCPT PGCTGRGHVN SNRNSHRSLS GCPIAMEKL AKAQEKHQSC DVSKSSQASD600
RVLRPMCFVK QLEIPQYGYR NNVPTTTPRS NLAKELEKYS KTSFEYNSYD NHTYGKRAIA660
PKVQTRDISP KGYDDAKRYC KDPSPSSSST SSYAPSSSSN LSCGGGSSAS STCSKSSFDY720
THDMEMHMA ATAILNLSTR CREMPQNLST KPQDLCATRN PDMEVDENGT LDLSMNKQRP780
RDSCCPILTP LEPMSPQQQA VMNNRCFQLG EGDCWDLPVD YTKMKPRRID EDESKDITPE840
DLDPFQEALE ERRYPGEVTI PSPKPKYPQC KESKKDLITL SGCPLADKSI RSMLATSSQE900
LKCPTPGCDG SGHITGNYAS HRSLSGCPRA KKSGIRIAQS KEDKEDQEPI RCPVPGCDGQ960
GHITGKYASH RSASGCPLM KRQKDGYLNG SQFSWKSVKT EGMSCPTPGC DGSGHVSGSF 1020LTHRSLSGCP RATSAMKKAK LSGEQMLTIK QRASNGIEND EEIKQLDEEI KELNESNSQM 1080
EADMIKLRTQ ITTMESNLKT IEEENKVIEQ QNESLLHELA NLSQSLIHSL ANIQLPHMDP 1140
INEQNFDAYV TTLTEMYTNQ DRYQSPENKA LLENIKQAVR GIQV1184
(SEQ ID N0.:1)
應(yīng)理解，在本發(fā)明中，術(shù)語“MytlL基因和蛋白”不僅包括野生型和突變型的MytlL基因和蛋白，還包括MytlL蛋白的活性片段或活性衍生蛋白(以及相應(yīng)的編碼序列)，只要所述活性片段或活性衍生蛋白仍具有野生型MytlL蛋白的基本功能(例如保留> 50%, ^ 70%以上野生型MytlL蛋白活性)。
[0038]MytlL基因可用常規(guī)方法(如PCR或全合成)獲得，然后導(dǎo)入載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，從而表達(dá)獲得MytlL蛋白。此外，MytlL基因或克隆還可購買獲得，例如可購自O(shè)riGene公司(貨號SC304207)購得。
[0039]病毒載體
在本發(fā)明中，一種優(yōu)選的載體是病毒載體。本發(fā)明的病毒載體可以將膠質(zhì)細(xì)胞直接誘導(dǎo)形成神經(jīng)元。
[0040]用于本發(fā)明的病毒載體沒有特別限制，可以是任何能夠利用病毒具有傳送其基因組的特點(diǎn)，將遺傳物質(zhì)帶入其他細(xì)胞，進(jìn)行感染的病毒載體?？砂l(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中。包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體、腺相關(guān)載體。
[0041]—種優(yōu)選的病毒載體是慢病毒載體。在本發(fā)明的一個實(shí)例中，通過PCR技術(shù)將MytlL基因構(gòu)建到FUGW慢病毒載體上，從而形成FUGW-MYT1L慢病毒載體。
[0042]一種特別優(yōu)選的病毒載體是假病毒顆粒。在本領(lǐng)域中，制備假病毒顆粒的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如采用包裝細(xì)胞來生產(chǎn)假病毒顆粒。
[0043]在本發(fā)明的一個實(shí)例中，一種MytlL慢病毒載體的包裝方法包括:將載體系統(tǒng)中的FUGW-MYT1L慢病毒載體、pCMV_dR8.2 dvpr載體和pCMV_VSV_G載體共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，即可在宿主細(xì)胞中包裝獲得MYTlL慢病毒顆粒。宿主細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0044]體外誘導(dǎo)方法
本發(fā)明還提供了一種體外的、非治療性的將膠質(zhì)細(xì)胞直接誘導(dǎo)成神經(jīng)元的方法。一種通過MytlL慢病毒顆粒誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞的方法包括步驟:通過MytlL慢病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞,感染后的細(xì)胞維持培養(yǎng)20天以上，從而形成神經(jīng)元。
[0045]經(jīng)誘導(dǎo)所形成的神經(jīng)元細(xì)胞，可通過免疫熒光進(jìn)行檢測，例如，用神經(jīng)元特異性蛋白Tujl的抗體來檢測，從而鑒別出神經(jīng)元細(xì)胞。
[0046]藥物組合物以及給藥方式
本發(fā)明還提供一種可用于將非神經(jīng)元細(xì)胞(如膠質(zhì)細(xì)胞)誘導(dǎo)形成神經(jīng)元的組合物。本發(fā)明的藥物組合物還可治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病。
[0047]本發(fā)明藥物組合物包括本發(fā)明上述的表達(dá)載體或假病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的載體。
[0048]在本發(fā)明的藥物組合物，通常含有106_1012PFU/ml的假病毒顆粒，較佳地107-1012PFU/ml的假病毒顆粒，更佳地IO9-1O11 PFU/ml的假病毒顆粒。
[0049]“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0050]術(shù)語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑。
[0051]通常，將所述表達(dá)載體或假病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的載體混合后，即可獲得的本發(fā)明的藥物組合物。
[0052]本發(fā)明所述的組合物的給藥方式?jīng)]有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于):靜脈注射、皮下注射、腦部注射等。
[0053]本發(fā)明的有益效果包括:
1.本發(fā)明僅需包裝MytlL —個轉(zhuǎn)錄因子至病毒載體，即可將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元細(xì)胞，解決了只有將多個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入載體才能獲得功能性神經(jīng)元的步驟。
[0054]2.本發(fā)明簡化了將體細(xì)胞誘導(dǎo)為多功能干細(xì)胞，再定向分化為神經(jīng)元的繁瑣途徑。
[0055]3.啟動子為膠質(zhì)細(xì)胞識別特異性啟動子，遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄僅在膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行，避免了感染其他細(xì)胞的可能。
[0056]
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0057]實(shí)驗(yàn)材料 1.載體:
載體名稱:FUGW(購自Addgene公司，貨號14883)
兀件順序:Ubiquitin promoter-MCS-GFP-ffRE 克隆位點(diǎn):BamHI / AgeI 載體圖譜:如圖1所示。
[0058]2.擴(kuò)增引物:
正向:
aggtcgactc tagaggatcc cgccaccatg gaggtggaca ccgaggagaa gcggcat (SEQ ID N0.: 2)
反向:
agtccatggt ggcgaccggg acctgaattc ctctcacagc ctgcttta (SEQ ID N0.: 3)
3.細(xì)胞
3.1.293T 細(xì)胞:
購自美國ATCC。細(xì)胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，細(xì)胞密度為
1.2 X IO7細(xì)胞/20ml (0.6 X IO9 /L)時，重新接種于15cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)70%~80%時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h前將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
[0059]膠質(zhì)細(xì)胞U251: 購自美國ATCC。用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的U251細(xì)胞，細(xì)胞密度為1.2X IO7細(xì)胞/20ml (0.6 X IO9 /L)時，重新接種于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)皿，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。[0060] 實(shí)施例1
MytlL慢病毒載體的構(gòu)建:
(I)以通過MYTlL cDNA克隆為模板，通過擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增獲得大小3.5 Kb左右的PCR產(chǎn)物。
[0061 ] (2)對PCR產(chǎn)物和病毒載體進(jìn)行BamHI和AgeI的雙酶切。
[0062](3)過T4 DNA連接酶(購自Takara公司)連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0063](4)通過對轉(zhuǎn)化子的鑒定，挑選陽性克隆送測，以測序序列和預(yù)期序列一致的作為正確克隆，命名為FUGW-MYT1L慢病毒載體。
[0064]實(shí)施例2
MytlL慢病毒載體的包裝:
(I)制備慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒的DNA溶液(FUGW-MYT1L慢病毒載體20iig，pCMV-dR8.2 dvpr 載體(購自 Addgene) 15 u g, pCMV-VSV-G 載體(購自 Addgene) 10 u g,與相應(yīng)體積的Opt1-MEM混合均勻稀釋，調(diào)整總體積為2.5ml，在室溫下溫育5分鐘。
[0065](2)取 100 u lLipofectamine2000 (購自 invitrogen)試劑在另一管中與 2.4mlOpt1-MEM(購自Invitrogen)混合稀釋,在室溫下溫育5分鐘。
[0066](3)把(I)中所述稀釋后的DNA與(2)中所述稀釋后的Lipofectamine2000進(jìn)行混合，5分鐘內(nèi)輕輕地顛倒混勻。室溫下溫育20min。
[0067](4)將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞加入20ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。
[0068](5)每瓶細(xì)胞中加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基25ml，于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0069](6)收集轉(zhuǎn)染48小時后的293T細(xì)胞上清液。于4°C，4000g離心lOmin，除去細(xì)胞碎片。以0.45 m濾器過濾上清液于40ml超濾離心管(購自Millipore)中。把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中并蓋上蓋子，將過濾杯插到濾過液收集管中。組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上。在4000g離心約10-15分鐘。離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。
[0070](7)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，-80度長期保存。所獲得的病毒命名為MYTlL慢病毒顆粒。
[0071]實(shí)施例3
MytlL慢病毒誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞；
(I)當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞U251密度達(dá)50%~60%時進(jìn)行病毒感染，感染前將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為
無血清培養(yǎng)基。
[0072](2)根據(jù)U251細(xì)胞的MOI值(M0I=5)，加入適宜量的MYTlL慢病毒(加入病毒數(shù)=細(xì)胞數(shù)X MOI值)。12h后觀察細(xì)胞狀態(tài):如果沒有明顯的細(xì)胞毒性作用，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基；如果有明顯的細(xì)胞毒性作用，立即更換培養(yǎng)基。
[0073](3)培養(yǎng)基更換:當(dāng)U251細(xì)胞被MYTlL慢病毒感染后三天時，使用帶有N27因子(Invitrogen, 17504-044,)的 Neurobasal 培養(yǎng)基(Invitrogen, 12348-017)逐步替換原有的培養(yǎng)基。替換方法，每次保留1/2的原有培養(yǎng)基，加入1/2的新鮮的帶有N27因子的Neurobasal培養(yǎng)基，每三天更換一次培養(yǎng)基，確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好。
[0074](4)細(xì)胞維持:病毒感染后的U251細(xì)胞需要持續(xù)培養(yǎng)20天以上，在此期間需要對細(xì)胞進(jìn)行定期換液。
[0075]實(shí)施例4
對所誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞的免疫熒光檢測；
將持續(xù)培養(yǎng)20天以上的感染后U251細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟如下:
(1)洗滌:用TBS輕輕清洗細(xì)胞，洗三次，以去除細(xì)胞中的雜質(zhì)； (2)固定步驟:新鮮配好的4%多聚甲醛固定常溫20分鐘；
(3)洗滌:預(yù)冷的TBS洗三遍，每遍5分鐘；
(4)透膜:吸干液體，用0.2% Triton-X室溫10分鐘。
[0076](5)洗滌:TBS洗三遍，每遍5分鐘；
(6)封閉:加200 μ? 2% BSA，室溫I小時。
[0077](7) 一抗孵育:β 3-Tubulin (TU-20) Mouse mAb (Cell SignalingTechnology, #4466)，加 ΙΟΟμΙ—抗(1:200),用 1%BSA 配抗體，4 度過夜，或者 37 度 2 小時。
[0078](8)洗滌:洗一抗，TBS每次10分鐘，洗三次，注意:一定要覆蓋玻片表面，盡量洗干凈。
[0079]以下步驟均在暗室操作
(9)二抗孵育:(暗室操作)Alexa Fluor 546 Donkey Ant1-Mouse IgG (Invitrogen,A10036)，加ΙΟΟμΙ 二抗(1: 500)，閉光，室溫孵育I小時。
[0080](10)洗滌:(暗室操作)洗二抗，TBS每次10分鐘，洗三次，注意:一定要覆蓋玻片表面，盡量洗干凈，避光。
[0081](11)封片:(暗室操作)用VECTASHIELD?的DAPI染色劑(4’，6- 二脒基-2-苯基口引哚4’，6-diamidino-2-phenyI indole,是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的突光染料)(H-1200)(3 ng/mL)，室溫10分鐘；注意:盡量不要有氣泡；玻片放上后就不能再移動。
[0082](12)拍照:使用熒光顯微鏡拍照:
MYTlL慢病毒感染后的U251細(xì)胞，再維持20天左右時，通過神經(jīng)元特異性蛋白Tujl的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明U251細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)TujI蛋白，并且Tujl陽性細(xì)胞具有80%以上，說明此時的U251細(xì)胞已經(jīng)具備了神經(jīng)元的特性，如圖2-4。而未感染MYTlL慢病毒的U251細(xì)胞則無法檢測到Tujl的表達(dá)。
[0083]這表明，MYTlL慢病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白，使得所誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞具備了神經(jīng)元特性。
[0084]實(shí)施例5
構(gòu)建膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)的表達(dá)盒和載體
GFAP啟動子和HRE-GFAP雜合啟動子是已知的可在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)的啟動子。在本實(shí)施例中，以構(gòu)建好的FUGW-MYT1L慢病毒載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的慢病毒載體。具體的方法如下:
FUGff-MYTlL載體中用于啟動MYTlL的ubiquitin啟動子從載體中通過酶切的方法切除，插入PCR擴(kuò)增獲得的膠質(zhì)特異性啟動子-GFAP啟動子或HRE-GFAP啟動子，從而獲得含有以下表達(dá)盒的MYTlL慢病毒載體:(a)GFAP啟動子-MytlL的編碼序列-終止密碼子；
(b)HRE-GFAP雜合啟動子-MytlL的編碼序列-終止密碼子。
[0085]所述的表達(dá)盒可在膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)MytlL蛋白。
[0086]測試結(jié)果表明，含該組織特異性表達(dá)盒的慢病毒載體感染膠質(zhì)細(xì)胞后，同樣可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白(Tujl蛋白)，使得所誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞具備了神經(jīng)元特性。此外，該含該組織特異性表達(dá)盒的慢病毒載體感染表皮細(xì)胞后，不表達(dá)外源的MytlL蛋白。
[0087]討論:
本發(fā)明提供了一種特異性誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的方法，具體地，首先將MytlL基因構(gòu)建在病毒載體上，包裝獲得帶有MytlL的假病毒顆粒，并通過MytlL假病毒顆粒感染膠質(zhì)細(xì)胞后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可將膠質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞。神經(jīng)退行性疾病是由于神經(jīng)元衰老和死亡后膠質(zhì)細(xì)胞占據(jù)了主導(dǎo)地位，從而阻斷了神經(jīng)元之間的電生理反應(yīng)。MYTlL慢病毒可以將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)形成神經(jīng)元細(xì)胞，MYTlL病毒載體在神經(jīng)退行性疾病(例如帕金森病等)的治療中具有潛在價(jià)值，通過將膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)元后將中斷的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修復(fù)，從而減輕病人的痛苦。
[0088]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范
圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種MytlL基因或MytlL蛋白的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
2.一種假病毒顆粒，其特征在于，所述假病毒顆粒具有以下特征: (a)攜帶外源的MytlL的編碼序列； (b)可感染膠質(zhì)細(xì)胞，并且在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)外源的MytlL轉(zhuǎn)錄因子。
3.如權(quán)利要求2所述的假病毒顆粒，其特征在于，所述的假病毒顆粒選自下組慢病毒、腺病毒、皰疫病毒、腺相關(guān)病毒或痘病毒。
4.一種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒從5’至3’依次包括以下元件: 膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子、MytlL的編碼序列、終止密碼子。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒，其特征在于，所述的膠質(zhì)細(xì)胞特異性的啟動子包括:GFAP啟動子和HRE-GFAP雜合啟動子；和/或 MytlL來源于哺乳動物，優(yōu)選人。
6.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體包括質(zhì)粒、病毒載體； 更佳地，所述的病毒載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰疫病毒載體、痘病毒載體、或腺相關(guān)病毒載體。
8.—種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包括(i)藥學(xué)上可接受的載體以及(?)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求2所述的假病毒顆粒。
9.一種權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求2所述的假病毒顆粒的用途，其特征在于，用于制備誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元的組合物；或制備治療神經(jīng)退行性疾病的組合物。
10.一種誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟: 在外源MytlL蛋白存在下，培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/0793GK103656677SQ201210352867
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月21日
【發(fā)明者】高博, 盛一, 謝勝華, 吳慶, 徐述 申請人:上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司